郁川，翟崇凱，廖成水，余祖華，何雷，賈艷艷，李靜，張春杰，程相朝,2

1 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003

2 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471003

減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性

郁川1*，翟崇凱1*，廖成水1，余祖華1，何雷1，賈艷艷1，李靜1，張春杰1，程相朝1,2

1 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471003

2 洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽 471003

郁川, 翟崇凱, 廖成水, 等. 減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(12): 1664-1675.

Yu C, Zhai CK, Liao CS, et al. Construction and characterization of type III secretion system of attenuatedSalmonella typhimurium.Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1664-1675.

為開發(fā)新型重組減毒鼠傷寒沙門菌口服活疫苗載體，本研究以pYA3493質(zhì)粒為基礎(chǔ)，用鼠傷寒沙門菌sopENt100基因及其啟動(dòng)子替代原有的Ptrc啟動(dòng)子，構(gòu)建沙門菌三型分泌表達(dá)載體pYA-sopENt100；再將質(zhì)粒pYA-sopENt100電轉(zhuǎn)入沙門菌ΔcrpΔasdSL1344，構(gòu)建減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表達(dá)系統(tǒng)，研究其生物學(xué)特性，進(jìn)一步將報(bào)告基因egfp克隆入sopE基因下游，構(gòu)建重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)，感染Vero細(xì)胞，用Western blotting分析該系統(tǒng)遞呈外源抗原的能力。PCR、酶切及測序結(jié)果表明，減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功；生物學(xué)特性鑒定結(jié)果表明，其血清型與親本株ΔcrpSL1344及野生株SL1344保持一致；其生化特性與親本株基本相近，但與野毒株相比發(fā)生明顯變化；生長速度也更為緩慢；重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 的LD50較野生株SL1344降低了7.0×104倍；Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組菌培養(yǎng)上清中能檢測到SopENt100-egfp融合蛋白(37 kDa)；重組菌株感染Vero細(xì)胞后，可以同時(shí)檢測到SopENt100-egfp融合蛋白 (37 kDa) 和EGFP蛋白 (27 kDa)。以上結(jié)果證實(shí)，本研究成功構(gòu)建了新型減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasd(pYA-sopENt100) 三型分泌表達(dá)系統(tǒng)，其能夠有效遞呈外源抗原，該重組菌株有潛力作為安全、穩(wěn)定、高效表達(dá)外源基因的口服重組活疫苗載體。

減毒鼠傷寒沙門菌，三型分泌系統(tǒng)，sopE基因，平衡致死系統(tǒng)，活疫苗載體

鼠傷寒沙門菌屬腸桿菌科沙門菌屬的B血清群成員，具有廣泛感染的宿主譜，也是一種重要的人畜共患病原菌，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生上均具有十分重要的意義[1-2]。通過基因工程減毒的鼠傷寒沙門菌毒力降低，但能保持良好的免疫原性，能有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答[3-4]。另外，減毒沙門菌LPS作為內(nèi)在佐劑，可以刺激宿主細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子以及增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞捕獲和加工MHC-I類抗原的能力，有利于將重組沙門菌的抗原呈遞給特異性的B、T細(xì)胞[5-6]。因此，減毒鼠傷寒沙門菌是攜帶抗原的良好載體和天然粘膜免疫佐劑，這已受到醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)的廣泛關(guān)注[7-8]。

沙門菌質(zhì)粒平衡致死載體系統(tǒng)的建立有效解決了外源質(zhì)粒的不穩(wěn)定攜帶和表達(dá)以及耐藥基因潛在的生物安全性問題[9-10]。asd質(zhì)粒平衡致死系統(tǒng)是基于缺失載體菌的編碼二氨基庚二酸 (DL-α，ε-Diaminopimelicacid，DAP) 合成酶的基因而開發(fā)的載體表達(dá)系統(tǒng)。asd基因(Aspartic semialdehyde dehydrogenase) 編碼的天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必需酶，asd突變株在無外源DAP條件下不能形成完好的細(xì)胞壁，最終溶菌死亡。然而外源的抗原基因可被克隆至asd+的質(zhì)粒中與突變菌形成互補(bǔ)，使重組菌在無外源DAP 存在的條件下仍能存活[11-12]。本實(shí)驗(yàn)室為開發(fā)新型鼠傷寒沙門菌口服活疫苗載體，在缺失編碼cAMP受體蛋白 (cAMP receptor protein，crp) 基因[13]的沙門菌基礎(chǔ)上成功構(gòu)建出減毒鼠傷寒沙門菌平衡致死系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-3493)[14]。

鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng) (type Ⅲsecretion system，T3SS) 與細(xì)菌的定殖、侵染以及在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活有著密切的關(guān)系[15]。T3SS通過一個(gè)復(fù)雜的針頭復(fù)合物將外源蛋白注入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。沙門菌外膜蛋白E (Salmonella outer protein E，sopE)是T3SS的一種重要的功能蛋白，它通過與Cdc42 和 Rac1相互作用，激活Rho GTPase，從而導(dǎo)致膜波動(dòng)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)沙門菌內(nèi)化到宿主細(xì)胞[16]。此外，已經(jīng)證實(shí)SopE氨基末端100個(gè)氨基酸 (sopENt100) 是分泌和轉(zhuǎn)位區(qū)域，能夠作為一種外源蛋白運(yùn)輸工具，可以高效輸送異源蛋白到真核細(xì)胞胞質(zhì)[17]。另外，在真核細(xì)胞內(nèi)SopE蛋白能夠迅速地被泛素化處理和被蛋白酶體降解，不僅有利于外源抗原的遞呈，而且對(duì)宿主細(xì)胞自身的毒性較小[18]。

綜上所述，本試驗(yàn)在減毒鼠沙門菌平衡致死系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用鼠傷寒沙門菌III型分泌系統(tǒng)高效遞呈外源抗原的優(yōu)勢，構(gòu)建減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 三型分泌表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步研究該系統(tǒng)遞呈外源抗原的能力及其生物學(xué)特性，進(jìn)而為研發(fā)更加安全、有效、穩(wěn)定的新型重組減毒鼠傷寒沙門菌口服活疫苗載體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞及培養(yǎng)條件

鼠傷寒沙門菌SL1344強(qiáng)毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所，質(zhì)粒pEGFP-N1購自Invitrogen公司，無抗性原核表達(dá)載體pYA3493 (asd+，pBRori，β-lactamase signal sequence) 及其宿主菌χ6097 (araΔ(lac-pro) rPslΔasdA4Δ[zhf-2:: Tn10] thiф80d/lacZΔM15) 由美國華盛頓大學(xué)Dr. Roy Curtiss Ⅲ教授惠贈(zèng)，鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344由本室構(gòu)建保存[14]，大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌在各種培養(yǎng)基中37 ℃靜置或振搖培養(yǎng)，各培養(yǎng)基根據(jù)需要加入終濃度為50 μg/mL DAP、50 μg/mL的慶大霉素。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

沙門菌屬診斷血清及各種單因子血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；DAP購自Sigma-Aldrich 公司；TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、dNTPs、DNA marker、T4 DNA連接酶和各種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司；鼠抗EGFP單抗及HPR標(biāo)記兔抗鼠IgG購自Abcam；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；凝膠回收試劑盒購自生工生物工程有限公司；麥康凱瓊脂和生化鑒定試劑均購自杭州天和微生物試劑有限公司；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；1日齡健康羅曼雛雞，按常規(guī)方法檢測均為沙門菌抗體陰性[19]。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)鼠傷寒沙門菌 (GenBank Accession No. AE008859)sopE基因的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)序列以及質(zhì)粒pEGFP-N1中EGFP的全基因序列，運(yùn)用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物并由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(表1，引物中的斜體部分為酶切位點(diǎn))。

1.4 沙門菌三型分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以質(zhì)粒pYA3493為基礎(chǔ)，用鼠傷寒沙門菌sopE基因的啟動(dòng)子及分泌信號(hào)序列替代原有的Ptrc啟動(dòng)子，構(gòu)建沙門菌三型分泌表達(dá)載體pYA-sopENt100(圖1)；將egfp報(bào)告基因插入pYA-sopENt100下游，構(gòu)建重組標(biāo)記載體pYA-sopENt100-egfp。然后分別將質(zhì)粒pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp轉(zhuǎn)化大腸桿菌χ6097，取100 μL涂布于LB平板上。15?18 h后挑取無色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切和測序鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物序列Table 1 The primer sets for PCR in this study

圖1 重組質(zhì)粒pYA-sopENt100構(gòu)建示意圖Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid pYA-sopENt100.

1.5 重組菌株的構(gòu)建及鑒定

10 μL pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp質(zhì)粒加入100 μL Δcrp?asdSL1344的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中混合均勻，冰浴30 min，將混合物迅速轉(zhuǎn)移至電極杯中，然后進(jìn)行電擊；電擊后迅速加入400 μL預(yù)熱的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、180×g振蕩培養(yǎng)3 h，取出100 μL涂布于不含DAP的LB平板上。15?24 h后挑取無色單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定。

1.6 重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 生物學(xué)特性

1.6.1 重組菌株的表型及生化鑒定

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 及其親本株?crpSL1344、雙缺失株Δcrp?asdSL1344和野生株SL1344分別劃線接種于含1%麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h后進(jìn)行O和H抗原等血清型鑒定，然后將各菌株分別轉(zhuǎn)接于各生化管中培養(yǎng)研究其生化特性。

1.6.2 重組質(zhì)粒在菌株中的穩(wěn)定性檢測

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 在LB固體板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到LB±DAP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)50代。培養(yǎng)產(chǎn)物每10代挑取50個(gè)單菌落提取質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和計(jì)算質(zhì)粒丟失率[20]，以研究重組質(zhì)粒在菌株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.6.3 重組菌株的生長特性鑒定

分別挑取重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 及其親本株?crpSL1344、雙缺失株Δcrp?asdSL1344和野生株SL1344單菌落培養(yǎng)過夜，菌液用無菌PBS連續(xù)10倍稀釋，選取合適稀釋度涂板計(jì)數(shù)，計(jì)算母液細(xì)菌濃度。然后菌液以終濃度均為1×106CFU/mL進(jìn)行轉(zhuǎn)接，連續(xù)培養(yǎng)18 h，每隔1 h測定波長 600 nm的光密度 (OD600) 值，繪制4種菌株的生長曲線。

1.6.4 重組菌株對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn)

無菌挑取重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 及其親本株ΔcrpSL1344和野生株SL1344單菌落，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)選擇合適稀釋度，每個(gè)稀釋度口服10只雞，每只200 μL，另設(shè)PBS對(duì)照組，觀察30 d，記錄雞死亡情況，運(yùn)用生物軟件 (Bliss) 計(jì)算各組LD50。

1.7 SopENt100-egfp融合基因在重組菌株中的表達(dá)情況鑒定

挑取減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h；然后按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h，8 000×g離心10 min收集沉淀和上清。沉淀用超聲波進(jìn)行破碎，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，加等體積預(yù)冷的20%三氯乙酸冰浴20 min，8 000×g離心30 min；然后將濃縮后上清用1 mL無水乙醇洗滌，12 000×g離心5 min；重復(fù)洗滌2次，向上清和沉淀中加入5×SDS上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并進(jìn)一步進(jìn)行Western blotting分析。第一抗體為鼠抗EGFP單抗 (1∶1 000稀釋)，第二抗體為HPR標(biāo)記兔抗鼠IgG (1∶3 000稀釋)，同時(shí)設(shè)對(duì)照組Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100)。

1.8 重組減毒沙門菌侵染Vero細(xì)胞及表達(dá)蛋白的Western blotting分析

培養(yǎng)Vero細(xì)胞生長至80%?90%時(shí)，按細(xì)菌/細(xì)胞感染比500∶1分別將重組減毒鼠傷寒沙門菌Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)和Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100) 加入六孔板中，培養(yǎng)4 h后，用無菌PBS洗滌3次，加入含有10%胎牛血清及50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心5 min收集上清液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)一步進(jìn)行Western blotting分析，其中一抗為鼠抗EGFP單抗 (1∶1 000稀釋)，二抗為HPR標(biāo)記的兔抗鼠IgG (1∶3 000稀釋)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門菌三型分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

對(duì)pYA-sopENt100進(jìn)行PCR和酶切鑒定，PCR擴(kuò)增出大小約為500 bp的目的條帶 (圖2A)；經(jīng)AccⅢ和EcoRⅠ雙酶切后出現(xiàn)大小分別為500 bp和2 900 bp的兩條目的條帶 (圖2B)；pYA-sopENt100-egfp可擴(kuò)增出約800 bp的egfp片段 (圖2C)，經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)大小分別約800 bp和3 400 bp兩條帶 (圖2D)。測序結(jié)果表明，PsopE-sopENt100和egfp基因序列與預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)核酸序列的同源性均為100%。重組質(zhì)?？稍诖竽c桿菌χ6097 (asd-) 菌株中穩(wěn)定存在，以上結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌三型分泌表達(dá)載體pYA-sopENt100及其重組載體pYA-sopENt100-egfp構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant plasmid. (A) PCR identification of recombinant plasmid pYA-sopENt100.M: DNA marker ladder (DL 5 000); 1: recombinant plasmid pYA-sopENt100; 2: ddH2O control. (B) Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pYA-sopENt100. M: DNA marker ladder (DL 5 000); 1: pYA-sopENt100. (C) PCR identification of recombinant plasmid pYA-sopENt100-egfp. M: DNA marker ladder (DL 2 000); 1: pYA-sopENt100-egfp; 2: ddH2O control. (D) Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid pYA-sopENt100-egfp. M: DNA marker ladder (DL 5 000); 1: recombinant plasmid pYA-sopENt100-egfp.

2.2 重組菌株的構(gòu)建及鑒定

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100)和Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 能夠在不含DAP的LB固體培養(yǎng)基上生長，初步說明重組質(zhì)粒pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp導(dǎo)入了宿主菌Δcrp?asdSL1344。重組質(zhì)粒pYA-sopENt100經(jīng)PCR可以擴(kuò)增出500 bp的目的條帶，經(jīng)AccⅢ和EcoR Ⅰ雙酶切后出現(xiàn)大小分別為500 bp和2 900 bp的兩條帶，而重組質(zhì)粒pYA-sopENt100-egfpPCR可以擴(kuò)增出800 bp的目的條帶，經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后出現(xiàn)大小分別約為800 bp和3 400 bp的兩條帶。以上結(jié)果可說明重組質(zhì)粒pYA-sopENt100和pYA-sopENt100-egfp被成功導(dǎo)入了宿主菌株Δcrp?asdSL1344。

2.3 ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)重組菌株的生物學(xué)特性

2.3.1 重組菌株的表型及生化鑒定

血清型鑒定表明，重組菌Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 的血清型同親本株和野生株相比沒有發(fā)生變化，血清型仍為O1,4,5,12:Hi1,2。野生株SL1344能夠利用麥芽糖，在含有麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈紅色菌落；而重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 不能利用麥芽糖，因此在含麥芽糖的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈無色菌落，這與親本株ΔcrpSL1344保持一致。生化鑒定結(jié)果顯示，重組菌株的生化特性與野生株SL1344相比發(fā)生了明顯改變，其失去了利用丙三醇、阿拉伯糖、麥芽糖、山梨醇和木糖碳源的能力，也不能分解H2S，但仍保留了利用葡萄糖、甘露醇的能力，這些都與親本株ΔcrpSL1344基本保持一致。

2.3.2 重組質(zhì)粒在菌株中的穩(wěn)定性檢測

將重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 在LB±DAP液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)50代，培養(yǎng)產(chǎn)物每隔10代挑取50個(gè)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定并計(jì)算質(zhì)粒丟失率。質(zhì)粒穩(wěn)定性結(jié)果表明，重組菌株連續(xù)培養(yǎng)50代后，LB組菌株均可擴(kuò)增出約800 bp的egfp目的條帶 (圖3)，質(zhì)粒保存率為100%，而LB+DAP組菌株的質(zhì)粒丟失率為48% (圖4)。

圖3 重組沙門菌體外穩(wěn)定性PCR鑒定結(jié)果Fig. 3 PCR identification of the stabilities of recombinant plasmid in recombinant strains. M: DNA marker ladder (DL 2 000); 1: ddH2O control; 2?6: the 10th, 20th, 30th, 40th and 50th generation of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp).

圖4 重組質(zhì)粒在沙門菌中的穩(wěn)定性鑒定結(jié)果Fig. 4 The plasmid stabilities in recombinant strains.

2.3.3 重組菌株的生長特性鑒定

重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)、缺失菌Δcrp?asdSL1344和親本株ΔcrpSL1344的菌落大小明顯小于野生株SL1344，其平均菌落直徑大小分別為0.39 mm、0.36 mm、0.42 mm和0.79 mm。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，以每小時(shí)所測菌液OD600值為縱坐標(biāo)，繪制4種細(xì)菌的生長曲線 (圖5)。結(jié)果表明，重組菌株的生長速度低于強(qiáng)毒株，而與缺失菌株和親本株相比沒有明顯變化。

2.3.4 重組菌株對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn)

各試驗(yàn)組1日齡雛雞接種后連續(xù)觀察30 d，計(jì)算各組死亡情況和半數(shù)致死量(LD50)。由表2可知，口服感染?crp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 的LD50是2.28×1010CFU，ΔcrpSL1344的LD50是1.14×1010CFU，野生菌株SL1344的LD50是3.25×105CFU，重組菌株Δcrp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)的LD50較野生株 SL1344降低了7.0×104倍，與?crpSL1344保持相當(dāng)。試驗(yàn)結(jié)果表明重組菌?crp?asdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 毒力明顯減弱，作為疫苗載體安全性較好。

圖5 ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)、ΔcrpΔasdSL1344、ΔcrpSL1344和SL1344生長曲線Fig. 5 Growth curves of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp), ΔcrpΔasdSL1344, ΔcrpSL1344 and SL1344.

表2 各實(shí)驗(yàn)組口服感染結(jié)果Table 2 Oral infection results of each experimental group

2.4 重組菌株的表達(dá)產(chǎn)物鑒定

重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 經(jīng)過培養(yǎng)后，Western blotting分析顯示，在約37 kDa處有SopENt100-egfp融合蛋白條帶，并且存在于過濾的上清和沉淀中(圖6)，表明SopENt100-egfp融合蛋白能夠在減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344中獲得分泌表達(dá)。

圖6 重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting鑒定Fig. 6 Western blotting identification of the expressed protein from recombinant attenuated strain ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp). M: protein marker; 1: supernatant of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100); 2: supernatant of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp); 3: precipitation of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100); 4: precipitation of ΔcrpΔasdSL1344(pYA-sopENt100-egfp).

2.5 重組減毒沙門菌侵染Vero細(xì)胞及Western blotting分析

重組減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 感染Vero細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞經(jīng)處理后進(jìn)行Western blotting反應(yīng)。結(jié)果顯示，在約37 kDa處有SopENt100-egfp融合蛋白條帶，約27 kDa處出現(xiàn)EGFP蛋白條帶，而空載體菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 在對(duì)應(yīng)位置并未出現(xiàn)條帶，表明該重組三型分泌表達(dá)系統(tǒng)能夠有效地將SopENt100-egfp融合蛋白遞呈Vero細(xì)胞，并且SopENt100-egfp融合蛋白能夠被Vero細(xì)胞加工處理，其分泌相關(guān)蛋白SopENt100能夠被進(jìn)一步切除 (圖7)。

圖7 重組菌株感染Vero細(xì)胞后EGFP蛋白的Western blotting鑒定Fig. 7 Western blotting identification of the expressed EGFP protein from Vero cells infected by recombinant attenuated strain. M: protein marker; 1: ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100); 2: ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp).

3 討論

減毒鼠傷寒沙門菌可通過自然感染途徑如口服或鼻內(nèi)接種，引起動(dòng)物較強(qiáng)的黏膜、細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，具有培養(yǎng)條件簡單、繁殖速度較快、免疫原性良好、制備及使用方便、經(jīng)濟(jì)等多種優(yōu)點(diǎn)，可以作為攜帶外源基因的良好載體，具有廣泛應(yīng)用前景[12,17]。減毒沙門菌的生物安全性和穩(wěn)定性直接決定著疫苗的安全性和適用性。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，口服1.0×109CFU的減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA3493) 對(duì)雞只沒有明顯的毒性[14]。這表明減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344具有作為疫苗活載體的潛能。

利用減毒沙門菌作為活載體表達(dá)外源抗原，研制多價(jià)疫苗時(shí)，常常出現(xiàn)減毒沙門菌在體內(nèi)惡劣環(huán)境壓力下質(zhì)粒丟失或表達(dá)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。目前，已報(bào)道多種方法來提高外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，其中，效果最穩(wěn)定且應(yīng)用最多的是asd+質(zhì)粒平衡表達(dá)系統(tǒng)。asd+質(zhì)粒平衡表達(dá)系統(tǒng)由缺失其生存所必需的asd基因的親本菌株和含有asd基因的互補(bǔ)質(zhì)粒組成。asd基因表達(dá)產(chǎn)物天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶，是DAP合成的必需酶，而DAP又是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。因此，asd基因的缺失將導(dǎo)致突變菌株無法在DAP-條件下生存。沙門菌質(zhì)粒平衡致死載體系統(tǒng)的建立有效解決了外源質(zhì)粒的不穩(wěn)定攜帶和表達(dá)以及耐藥基因潛在生物安全性問題[11-12]。為保證該系統(tǒng)的穩(wěn)定性，重組質(zhì)粒pYA-sopENt100上的SD-asd基因?yàn)閍sd基因的部分片段，其缺少相應(yīng)的啟動(dòng)子元件 (-10區(qū)和-35區(qū))，僅保留了SD序列。同時(shí)，重組質(zhì)粒pYA-sopENt100采用pBR ori低水平復(fù)制起始位點(diǎn)，這樣一方面大大降低了Asd蛋白的表達(dá)水平，減少了Asd蛋白對(duì)宿主菌的毒性作用。另一方面能夠適量增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)，從而提高外源蛋白的表達(dá)量[21]。質(zhì)粒穩(wěn)定性結(jié)果顯示，重組菌株連續(xù)培養(yǎng)50代，LB組菌株均可擴(kuò)增出約800 bp的egfp目的條帶，質(zhì)粒保存率為100%，而LB+DAP組菌株的質(zhì)粒丟失率為48%。這初步表明該分泌表達(dá)系統(tǒng)在DAP-環(huán)境下具有良好的穩(wěn)定性。

減毒沙門菌通過利用細(xì)菌的分泌系統(tǒng)將外源抗原遞呈給抗原遞呈細(xì)胞。在疫苗載體設(shè)計(jì)的過程中，外源抗原的表達(dá)和遞呈能力直接關(guān)系著疫苗的功效。鼠傷寒沙門菌進(jìn)入宿主細(xì)胞后形成內(nèi)化空泡而不能有效地將外源抗原呈遞給MHC分子，從而直接影響著鼠傷寒沙門菌的抗原遞呈能力[22]。T3SS通過一個(gè)復(fù)雜的針頭復(fù)合物將外源蛋白注入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[23]。許多學(xué)者已經(jīng)證實(shí)，利用鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)來遞呈外源抗原能夠有效的解決上述問題，具有更大的優(yōu)越性和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。將外源抗原與鼠傷寒沙門菌三型分泌蛋白SopE的分泌和轉(zhuǎn)位信號(hào)進(jìn)行融合，從而利用沙門菌三型分泌系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)外源蛋白的定向運(yùn)輸[17]。另外，在真核細(xì)胞內(nèi)SopE蛋白能夠迅速地被蛋白酶體降解，有利于外源抗原的遞呈[18]。2011年Chen等[24]通過構(gòu)建sopE-Sj23LHD-GST表達(dá)載體來預(yù)防日本血吸蟲，試驗(yàn)結(jié)果表明該載體能夠有效地遞呈sopE-Sj23LHD-GST，對(duì)日本血吸蟲具有良好的免疫保護(hù)力；2012年Juárez等[25]構(gòu)建sopE-ESAT-6等表達(dá)載體來預(yù)防結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果表明該載體可以誘使機(jī)體產(chǎn)生較高的特異性抗體，可以有效地預(yù)防結(jié)核病。鑒于此，本研究將標(biāo)記基因egfp插入sopE信號(hào)序列下游，初步探究構(gòu)建的三型分泌表達(dá)載體pYA-sopENt100抗原遞呈能力。結(jié)果顯示，重組減毒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 成功表達(dá)了融合蛋白SopENt100-egfp。此外，重組菌株ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 感染Vero細(xì)胞后，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在約37 kDa處有SopENt100-egfp融合蛋白條帶，而在約27 kDa處出現(xiàn)EGFP蛋白條帶。上述結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) 能夠有效地遞呈外源抗原，并且融合蛋白中的信號(hào)蛋白SopENt100能夠被宿主細(xì)胞進(jìn)一步切除。

本研究通過對(duì)重組減毒鼠傷寒沙門菌的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，該重組菌株與強(qiáng)毒株相比生長速度明顯減慢，毒力明顯降低，具有良好的安全性，且遺傳穩(wěn)定。這說明sopE基因的表達(dá)對(duì)重組菌株的生物學(xué)特性沒有明顯的影響。同時(shí)，重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 表達(dá)的SopENt100-egfp融合蛋白可存在于過濾的上清中，說明重組菌株可分泌性表達(dá)該蛋白，避免了被胞內(nèi)蛋白酶降解，利于表達(dá)蛋白的正確折疊及保持良好的生物學(xué)活性。以上結(jié)果表明將鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)引入沙門菌平衡致死系統(tǒng)可以作為安全、穩(wěn)定、高效表達(dá)外源基因的口服重組活疫苗載體，具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上，本研究利用減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌系統(tǒng)以及平衡致死系統(tǒng)成功構(gòu)建了能穩(wěn)定攜帶外源抗原的新型減毒鼠傷寒沙門菌三型分泌表達(dá)系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100)；重組菌ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) 毒力降低，遺傳穩(wěn)定，能分泌性表達(dá)SopENt100-egfp融合蛋白，且能有效地向Vero細(xì)胞遞呈EGFP蛋白，為開發(fā)減毒鼠傷寒沙門菌新型口服活疫苗載體奠定基礎(chǔ)。

[1] Jawale CV, Lee JH. Characterization of aSalmonellatyphimuriumghost carrying an adjuvant protein as a vaccine candidate for the protection of chickens against virulent challenge. Avian Pathol, 2014, 43(6): 506-513.

[2] Bagheryan Z, Raoof JB, Golabi M, et al. Diazonium-based impedimetric aptasensor for the rapid label-free detection ofSalmonella typhimuriumin food sample. Biosens Bioelectron, 2016, 80: 566-573.

[3] Tang LH, Pan ZM, Cheng NN, et al. Construction and immunogenicity of attenuatedSalmonella typhimuriumharbouring stable DNA vaccine against H5 subtype of avian influenza virus. Acta Microbiol Sin, 2007, 47(4): 662-666 (in Chinese).唐麗華, 潘志明, 程寧寧, 等. 穩(wěn)定攜帶H5亞型禽流感病毒候選DNA疫苗減毒沙門氏菌的構(gòu)建及其免疫原性. 微生物學(xué)報(bào), 2007, 47(4): 662-666.

[4] Cao J, Chen ZH, Ren YL, et al. Oral immunization with attenuatedSalmonellacarrying a co-expression plasmid encoding the core and E2 proteins of hepatitis C virus capable of inducing cellular immune responses and neutralizing antibodies in mice. Vaccine, 2011, 29(20): 3714-3723.

[5] Nandre RM, Lee JH. Construction of a recombinant-attenuatedSalmonellaenteritidisstrain secretingEscherichiacoliheat-labile enterotoxin B subunit protein and its immunogenicity and protection efficacy against salmonellosis in chickens. Vaccine, 2014, 32(3): 425-431.

[6] Chen DS, Guo WZ, Xu ZW, et al. Construction of a dual-promoter expression plasmid delivered bySalmonellacholeraesuisC500. Chin J Biotech, 2009, 25(3): 341-347 (in Chinese).陳弟詩, 郭萬柱, 徐志文, 等. 豬霍亂沙門氏菌遞送的雙啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(3): 341-347.

[7] Lin IYC, Van TTH, Smooker PM. Live-attenuated bacterial vectors: tools for vaccine and therapeutic agent delivery. Vaccines, 2015, 3(4): 940-972.

[8] Zhang D, Huang XB, Zhang XH, et al. Construction of an oral vaccine for transmissible gastroenteritis virus based on the TGEV N gene expressed in an attenuatedSalmonellatyphimuriumvector. J Virol Methods, 2016, 227: 6-13.

[9] Zhang Q, Ma QL, Li Q, et al. Enhanced protection against nasopharyngeal carriage ofStreptococcus pneumoniaeelicited by oral multiantigen DNA vaccines delivered in attenuatedSalmonella typhimurium. Mol Biol Rep, 2011, 38(2): 1209-1217.

[10] Kim SW, Kang HY, Hur J, et al. Construction of a conditional lethalSalmonellamutantviagenetic recombination using thearasystem andasdgene. J Microbiol Methods, 2011, 87(2): 202-207.

[11] Li J, Chen SB, Yu ZH, et al. Construction of host-vector balanced lethal system ofSalmonella typhimuriumSL1344Δcyamutant and immuneprotection test of chickling. Acta Microbiol Sin, 2015, 55(7): 942-948 (in Chinese).李靜, 陳松彪, 余祖華, 等. 鼠傷寒沙門菌SL1344株環(huán)化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及其雛雞免疫保護(hù)試驗(yàn). 微生物學(xué)報(bào), 2015, 55(7): 942-948.

[12] Xu YD, Guo AZ, Liu WH, et al. Construction and characterization of ΔcrpΔasdmutant host-vector balanced lethal system ofSalmonellacholeraesuisC500 Strain. Chin J Biotech, 2006, 22(3): 366-372 (in Chinese).徐引弟, 郭愛珍, 劉維紅, 等. 豬霍亂沙門氏菌C500株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2006, 22(3): 366-372.

[13] Liao CS, Cheng XC, Zhao ZQ, et al. Construction and characterization of the cAMP receptor protein gene deletion mutant ofSalmonellatyphimuriumSL1344 strain. Chin J Vet Sci, 2011, 31(12): 1711-1716 (in Chinese).廖成水, 程相朝, 趙戰(zhàn)勤, 等. 鼠傷寒沙門菌SL1344株cAMP受體蛋白基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 31(12): 1711-1716.

[14] Tian FH, Cheng XC, Zhang CJ, et al. Construction and characterization of aSalmonellatyphimuriumSL1344ΔcrpΔasdmutant strain. Chin J Vet Sci, 2013, 33(11): 1700-1706 (in Chinese).田芳華, 程相朝, 張春杰, 等. 鼠傷寒沙門菌SL1344株ΔcrpΔasd缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性初步研究. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 33(11): 1700-1706.

[15] Galán JE, Collmer A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science, 1999, 284(5418): 1322-1328.

[16] Friebel A, IIchmann H, Aepfelbacher M, et al.SopEandSopE2fromSalmonellatyphimuriumactivate different sets of Rho GTPases of the host cell. J Biol Chem, 2001, 276(36): 34035-34040.

[17] Chen LM, Briones G, Donis RO, et al. Optimization of the delivery of heterologous proteins by theSalmonellaentericaserovartyphimuriumtype III secretion system for vaccine development. Infect Immun, 2006, 74(10): 5826-5833.

[18] Kubori T, Galán JE. Temporal regulation ofSalmonellavirulence effector function by proteasome-dependent protein degradation. Cell, 2003, 115(3): 333-342.

[19] Ministry of Health of the People's Republic of China. GB/T 14926.1-2001 Laboratory animalmethod for examination ofSalmonellasp. Beijing: China Standards Press, 2002 (in Chinese).中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/T 14926.1-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌檢測方法. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2002.

[20] Nakayama K, Kelly SM, Curtiss R III. Construction of an Asd+expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in aSalmonellavaccine strain. Nat Biotechnol, 1988, 6(6): 693-697.

[21] Wang SF, Kong QK, Curtiss R III. New technologies in developing recombinant attenuatedSalmonellavaccine vectors. Microb Pathog, 2013, 58(5): 17-28.

[22] Panthel K, Meinel KM, Sevil Domènech VE, et al.Salmonellatype III-mediated heterologous antigen delivery: a versatile oral vaccination strategy to induce cellular immunity against infectious agents and tumors. Int J Med Microbiol, 2008, 298(1/2): 99-103.

[23] Cangelosi C, Hannagan S, Santiago CP, et al. Transfer of the clonedSalmonellaSPI-1 type III secretion system and characterization of its expression mechanisms in gram negative bacteria in comparison with cloned SPI-2. Microbiol Res, 2015, 180: 57-64.

[24] Chen G, Dai Y, Chen JX, et al. Oral delivery of the Sj23LHD-GST antigen bySalmonellatyphimuriumtype III secretion system protects againstSchistosomajaponicuminfection in mice. PLoS Negl Trop Dis, 2011, 5(9): e1313.

[25] Juárez-Rodríguez MD, Yang J, Kader R, et al. Live attenuatedSalmonellavaccines displaying regulated delayed lysis and delayed antigen synthesis to confer protection againstMycobacteriumtuberculosis. Infect Immun, 2012, 80(2): 815-831.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and characterization of type III secretion system of attenuated Salmonella typhimurium

Chuan Yu1＊, Chongkai Zhai1＊, Chengshui Liao1, Zuhua Yu1, Lei He1, Yanyan Jia1, Jing Li1, Chunjie Zhang1, and Xiangchao Cheng1,2
1 The Key Laborary of Animal Disease and Public Health, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China
2 Luoyang Vocational & Technical College, Luoyang 471003, Henan, China

In order to develop a recombinant attenuatedSalmonella typhimuriumas oral live vaccine vector, we constructed recombinant plasmid pYA-sopENt100by replacing thetrcpromoter with thesopEpromoter and secretion signal sequencesopENt100ofSalmonella typhimuriumon the basis of plasmid pYA3493. Then, the complementary plasmid pYA-sopENt100was transformed into ΔcrpΔasdSL1344 by electroporation to generate attenuatedSalmonella typhimuriumtype III secretion system ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100). We further characterized ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100). We also constructed a recombinant strain ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) that harbored the reporter gene-enhanced green fluorescent protein (egfp) gene. Vero cells were infected with ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) and the ability of delivery foreign antigens was testedviaWestern blotting analysis. The results of PCR, enzyme digestion and sequencing showed that the ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) type III secretion system was constructed successfully. The serotype of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) was identical to ΔcrpΔasdSL1344 and SL1344. Compared with wild strain SL1344, the biochemical characteristics of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) had obvious change, but it was basically the same with ΔcrpΔasdSL1344. The growth speed was much slower than that of the wild strain SL1344. The chicken virulence test (LD50) showed that the virulence of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) was 7×104times lower than SL1344. In addition, we observed the 37 kDa SopENt100-egfp protein in the cultured supernatant of ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp) strain by Western blotting analysis. However, both the 37 kDa SopENt100-egfp protein and 27 kDa EGFP protein were detected in ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100-egfp)-infected Vero cells. These results demonstrated that the recombinantSalmonella typhimuriumtype III secretion system ΔcrpΔasdSL1344 (pYA-sopENt100) was successfully constructed, and it should be used as a live vaccine vector for expressing foreign genes.

attenuatedSalmonella typhimurium, type III secretion system,sopEgene, balance-lethal system, live vaccine vector

Xiangchao Cheng. Tel/Fax: +86-379-64179396; E-mail: chengxch@126.com

Received:April 7, 2016;Accepted:June 28, 2016

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31302059, 31572489), Scientific and Technological Project of Henan Province (No. 152102110078), Doctor Foundation of Henan University of Science and Technology (No. 4025-13480064).

*These authors contributed equally to this study.

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31302059, 31572489)，河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目 (No. 152102110078)，河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金 (No. 4025-13480064) 資助。

時(shí)間：2016-09-12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160912.1112.001.html