韓笑奇，白姝，史清洪,2

1 天津大學 化工學院，天津 300354

2 天津大學 系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300354

交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結構調控作用

韓笑奇1，白姝1，史清洪1,2

1 天津大學 化工學院，天津 300354

2 天津大學 系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300354

韓笑奇, 白姝, 史清洪. 交聯(lián)酶聚集體制備中鈣離子的結構調控作用. 生物工程學報, 2016, 32(12): 1676?1684.

Han XQ, Bai S, Shi QH. Structural regulation by calcium ion in preparing cross-linked enzyme aggregates. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1676?1684.

以葡萄糖氧化酶 (GOx) 為研究對象，系統(tǒng)地研究了鈣離子對交聯(lián)酶聚集體 (CLEA) 粒子尺寸和微觀結構的調控作用以及酶催化性能和實用性的影響。研究結果表明，GOx酶沉淀過程中引入鈣離子可顯著降低CLEA粒子尺寸并導致粒子內納米孔道結構逐步消失。在0.1 mmol/L鈣離子濃度下，GOx酶的CLEA仍保有清晰的納米孔道結構。以葡萄糖為底物的GOx酶CLEA催化結果顯示，該CLEA粒子的酶活性為對照CLEA粒子的2.69倍。即便1.0 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子的GOx酶活性仍高出對照CLEA粒子約 42%。此外，0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA不僅具有更高的底物轉化速率和很好的操作穩(wěn)定性，而且CLEA中GOx酶的最大反應速度顯著提高。這些實驗結果明確了鈣離子對CLEA粒子尺寸和微觀結構的調控作用，為制備具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基礎。

葡萄糖氧化酶，交聯(lián)聚集體酶，鈣離子，擴散通道，轉化速率

交聯(lián)酶聚集體 (Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs) 是本世紀初在交聯(lián)酶晶體 (Cross-linked enzyme crystals，CLECs) 基礎上發(fā)展起來的一種新型無載體固定化酶技術[1]。相較于CLEC中利用復雜的酶分子晶體制備固定化酶的方法[2]，CLEA通過更加簡便易行的物理沉淀方法使酶分子聚集，進而通過戊二醛等交聯(lián)而成穩(wěn)定的超分子結構。因其對酶純度要求低、制備方法簡單、聚集體穩(wěn)定性高且易于回收和重復利用等諸多優(yōu)點，單酶CLEA技術在生物催化和生物分離等領域展現(xiàn)良好的應用前景并得到了系統(tǒng)地研究[3-6]。López-Serrano等利用硫酸銨和十二烷基硫酸鈉聯(lián)合沉淀方法制備的交聯(lián)脂肪酶聚集體具有高于天然脂肪酶1-2倍的催化活性[7]。此后，聚集體粒徑和結構、聚集體穩(wěn)定性等影響CLEA性能的參數(shù)和工藝條件也得到了系統(tǒng)地考察[8]。2014年，Torabizadeh等提出引入鈉鈣雙離子聚集酶分子的陽離子輔助聚集策略。但結果顯示，α-淀粉酶沉淀中鈉鈣雙離子的存在改善了CLEA的穩(wěn)定性并些許提高了淀粉底物的親和性[9]。相比于單酶催化，生物體內更為普遍的代謝產物合成都是通過兩個或多個酶的級聯(lián)反應完成的[10-11]。Sheldon教授課題組于2003年提出了多酶CLEAs的“combi-CLEAs”概念[12]，進而制備了級聯(lián)催化 (S)-扁桃酰胺合成的 (S)-醇腈酶和腈水解酶雙酶CLEA[13]。此后，該方法也被用于構建包括級聯(lián)[14-15]和非級聯(lián)反應[16]在內的多酶催化體系。相對于單酶CLEA，多酶CLEAs的復雜性不僅僅在于酶種類的增加，也帶來了底物擴散和中間產物通道等諸多問題[17-19]。因此，CLEA合成的調控技術成為設計和優(yōu)化酶催化體系的重要基礎。

CLEA的制備通常包括沉淀和交聯(lián)兩個步驟[20-21]，首先在無機鹽、水溶性有機溶劑、聚合物乃至有機酸等作用下溶液中的酶析出形成聚集體[8]，聚集體與戊二醛、葡聚糖等交聯(lián)劑反應生成不溶性CLEAs。沉淀方法和交聯(lián)劑對CLEAs中酶活性的影響雖已被廣泛地觀察，但少有涉及CLEAs尺寸和酶分子結構[20,22]。CLEAs的尺寸乃至其中酶分子構象與生物催化體系中底物擴散、酶的生物活性和生物催化性能是密切相關的。

本研究以葡萄糖氧化酶 (GOx) 為研究對象，考察了鈣離子對CLEAs尺寸的調控作用以及對酶分子結構、催化活性和CLEAs穩(wěn)定性的影響，從而為優(yōu)化葡萄糖氧化酶CLEA的合成提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

GOx酶購于Sigma公司；無水乙醇、十二水合磷酸氫二鈉 (Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉 (NaH2PO4·2H2O)、氯化鈣 (CaCl2) 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 均為購于本地的分析純試劑；50% (V/V) 戊二醛和靛藍胭脂紅購于光復精細化工研究所。

1.2 方法

1.2.1 GOx酶CLEA的制備

GOx酶CLEA的制備步驟如下：稱取GOx酶4 mg置于1.5 mL離心管中，然后加入1 mL蒸餾水溶解，制得4 mg/mL的GOx酶溶液；稱取27.75 mg氯化鈣溶于1 mL蒸餾水中制得250 mmol/L的氯化鈣濃縮液，濃縮液經(jīng)蒸餾水依次稀釋制得濃度為25、2.5和0.25 mmol/L的氯化鈣工作液。然后，分別量取60 μL的GOx酶溶液置于5個1.5 mL離心管中后，再依次向GOx酶溶液中加入40 μL的蒸餾水和不同濃度的氯化鈣工作液，各離心管中鈣離子終濃度依次為100、10、1、0.1和0 mmol/L。上述溶液混合均勻后，加入900 μL無水乙醇并靜置30 min沉淀GOx酶，沉淀后向離心管中加入50% (V/V)的戊二醛各42 μL，在2% (V/V) 戊二醛終濃度下交聯(lián)3 h。交聯(lián)反應結束后，在3 000 r/min離心回收GOD酶CLEA并用蒸餾水反復置換除去殘留戊二醛、乙醇和游離鈣離子。制備的GOx酶CLEA經(jīng)LABCONCO FreeZone冷凍干燥機凍干后稱重，計算GOD酶CLEA的產率。使用前，將GOx酶CLEA溶解于600 μL的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中 (pH 7.0)。

1.2.2 GOx酶CLEA活性測定

GOx酶CLEA的活性采用靛藍胭脂紅褪色法測定[23]。過氧化氫濃度的標準曲線繪制方法如下：向裝有5 mL含1 mmol/L靛藍胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中分別加入0、0.5、1、1.5、2和2.5 mL的10 mg/L過氧化氫溶液并用蒸餾水稀釋至15 mL配成過氧化氫濃度依次為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/L的靛藍胭脂紅溶液。上述溶液在沸水中煮沸10 min后用自來水冷卻至室溫，在波長615 nm處測定其吸光度，繪制過氧化氫濃度與靛藍胭脂紅吸光度的標準曲線。

GOx酶CLEA活性測定方法如下：向裝有1 mL含5 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液；混合均勻并反應1 min后，加入5 mL含1 mmol/L靛藍胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 并加蒸餾水稀釋至15 mL；上述溶液在沸水中煮沸10 min后用自來水冷卻至室溫，測定其在615 nm處吸光度。根據(jù)上述繪制的過氧化氫濃度與靛藍胭脂紅吸光度的標準曲線計算得到過氧化氫的產量。GOx酶CLEA活性 (A) 通過下式計算，

1.2.3 GOx酶CLEA催化底物轉化速率常數(shù)測定

向6只分別裝有1 mL含5 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液，混合均勻后在25 ℃下反應。反應過程中每間隔10 min取出一支試管，向其中加入5 mL含1 mmol/L靛藍胭脂紅的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 并加蒸餾水稀釋至15 mL。上述溶液置于沸水中煮沸10 min后用自來水冷卻至室溫，測定其在615 nm處吸光度。根據(jù)過氧化氫濃度與靛藍胭脂紅吸光度標準曲線得到不同時刻過氧化氫產量，計算出相應的葡萄糖消耗量。GOx酶CLEA的底物轉化速率由下式計算，

1.2.4 GOx酶CLEA動力學參數(shù)測定

GOx酶CLEA的最大反應速率(Vmax) 和米氏常數(shù)(Km) 采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法獲得[24]。首先，向分別裝有1 mL含5、10、15、20和25 mmol/L葡萄糖的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 7.0) 的試管中加入50 μL的GOx酶CLEA溶液；然后，依據(jù)GOx酶CLEA活性測定方法測定不同底物濃度下的轉化速率。最后，采用Lineweaver-Burk作圖法求出GOx酶CLEA的Km值和Vmax值。

1.2.5 觀測GOx酶CLEA粒徑大小和形態(tài)結構

GOx酶CLEA的粒徑和形態(tài)分別采用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡 (SEM) 進行觀測。步驟如下：20 μL的GOx酶CLEA溶液均勻滴至載玻片上后，置于倒置顯微鏡下觀察本研究制備的GOx酶CLEA粒徑大小。此外，20 μL的GOx酶CLEA溶液均勻滴至錫箔紙上后自然風干；風干樣品噴金處理后在SEM下掃描CLEA的結構形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 GOx酶CLEA的制備和性質

不同鈣離子濃度下制備GOx酶CLEA的收率如圖1所示。從中可以看出，GOx酶CLEA收率隨著鈣離子濃度的升高而降低；當GOx酶沉淀中鈣離子濃度達到100 mmol/L 時，GOx酶CLEA得率僅為40.2%。這一得率遠低于沒有鈣離子條件下的GOx酶CLEA得率 (對照CLEA，95.5%)。造成這一結果的原因可能在于如下兩個方面：鈣離子引入可能抑制了GOx酶分子間的聚集，促進更小粒徑的GOx酶CLEA生成。最終結果是，離心和清洗條件下收集的GOx酶CLEA產品減少，損失增大。

圖1 GOx酶CLEA收率隨鈣離子濃度的變化Fig. 1 Effect of calcium concentration on the CLEA yield of GOx enzyme.

不同鈣離子濃度下制備的GOx酶CLEA形態(tài)如圖2所示。圖2 (A) 為0.0 mmol/L鈣離子濃度下GOx酶CLEA形態(tài)，其不僅具有較大的聚集體尺寸，而且呈現(xiàn)出一定的透光性。但隨著沉淀過程中鈣離子的引入GOx酶CLEA不僅透光性逐步喪失而且聚集體的表觀尺寸 (粒徑)顯著減小。通常，較小的CLEA粒徑有利于底物的擴散，進而提高酶的催化效率。圖3中不同鈣離子濃度下制備的CLEA粒子表面的掃描電鏡 (SEM) 照片更清晰地顯示出這種變化。從SEM結果可以看出，鈣離子引起了GOx酶CLEA的納米孔道結構發(fā)生了顯著改變。圖3A顯示，作為對照CLEA具有明顯的納米孔道結構。當鈣離子濃度由0.0增至1.0 mmol/L后，CLEA不僅粒子尺寸降低 (圖2C所示)，CLEA粒子的納米孔道結構也漸趨消失 (圖3C所示)。這種變化與光鏡下CLEA粒子透光性改變相一致。從上述顯微鏡結果可知，鈣離子濃度為0.1 mmol/L時，GOx酶CLEA仍然具有明顯的納米孔道結構 (圖3B所示)，從而有利于底物和產物的擴散。同時，酶分子呈現(xiàn)較為緊密的結合，有利于維持酶的穩(wěn)定性。此前，Wang等通過淀粉與木瓜蛋白酶的共沉淀獲得了更大的微米級孔道結構以改善底物的傳遞[24]。隨著鈣離子濃度進一步增大，CLEA粒子內的納米孔道結構漸趨消失 (圖3C-E)。

圖2 光學顯微鏡下GOx酶CLEAs形態(tài)照片F(xiàn)ig. 2 CLEA to pographies of GOx enzymes. The concentrations of calcium were (A) 0.0 mmol/L, (B) 0.1 mmol/L, (C) 1.0 mmol/L, (D) 10 mmol/L and (E) 100 mmol/L.

2.2 鈣離子對CLEA粒子GOx酶活性的影響

在明確沉淀過程中鈣離子的引入對GOx酶CLEA形態(tài)和孔道結構影響的基礎上，進一步考察了這種變化對CLEA粒子GOx酶活性的影響。本文研究中定義對照CLEA粒子的GOx酶活性為100%。不同CLEA粒子中GOx酶的相對活性如圖4所示。CLEA酶活性分析中，反應液內無游離鈣離子，因此GOx酶活性變化與CLEA粒子尺寸及納米孔道結構的改變密切相關。從圖4中可以看出，低鈣離子濃度下制備的CLEA粒子中GOx酶的活性顯著提高。相較于對照CLEA，鈣離子濃度為0.1 mmol/L條件下制備的CLEA粒子具有更高的GOx酶活性，其相對活性為對照CLEA的269% (圖4)。當鈣離子濃度進一步提高至1.0 mmol/L時，制備的CLEA粒子中GOx酶活性仍比對照CLEA高42%。進一步研究顯示，這種CLEA粒子中GOx酶活性的提高與鈣離子的結合密切相關。0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子經(jīng)10 mmol/L EDTA溶液處理除去結合鈣離子后，CLEA粒子GOx酶活性降低了56%。這一結果表明，低濃度鈣離子的引入不僅調控了CLEA粒子的尺寸和納米孔道結構，也對酶的活性位點起到了保護作用。這種保護作用很有可能是通過穩(wěn)定GOx酶構象等方式實現(xiàn)的。

圖3 GOx酶CLEA的SEMFig. 3 SEM images of GOx enzymes CLEA. The concentrations of calcium were (A) 0.0 mmol/L, (B) 0.1 mmol/L, (C) 1.0 mmol/L, (D) 10 mmol/L and (E) 100 mmol/L.

2.3 CLEA粒子的GOx酶底物轉化速率

在上述研究工作的基礎上，進一步研究了0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備CLEA粒子的GOx酶底物轉化率，結果如圖5所示。結果表明，制備的CLEA粒子獲得了更高的GOx酶底物轉化速率，轉化速率達到0.28 mol/(g·h)。隨著葡萄糖的消耗，底物濃度降低，底物轉化速率逐步下降。而在相同條件下，對照CLEA粒子的底物轉化速率僅為0.10 mol/(g·h)，并隨著催化反應時間而降低。

圖4 不同GOx酶CLEA的相對活性變化Fig. 4 Relative activities of CLEAs of GOx enzymes.

圖5 CLEA的GOx酶底物轉化速率隨時間變化情況Fig. 5 The relationship of turnover rate of CLEA of GOx enzyme and time.

GOx酶的CLEA粒子反應動力學的Lineweaver-Burk圖見圖6。結果顯示，CLEA粒子中GOx酶的Km值為51.06 mmol/L，僅略低于對照CLEA的Km值 (64.83 mmol/L)。與此同時，0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子的GOx酶Vmax值達到81.30 mmol/(L·min)，其顯著高于對照CLEA的34.48 mmol/(L·min)。這一結果不同于鈉鈣雙離子作用下以大分子淀粉為底物的α-淀粉酶的CLEA結果[9]，表明鈣離子存在下的CLEA制備方法對于促進小分子底物 (如葡萄糖等) 的反應更加有利。

CLEA粒子的穩(wěn)定性測定通過CLEA粒子重復催化相同濃度葡萄糖溶液的方法進行測定，結果如圖7所示。從中可以看出，0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA在重復使用過程中，酶的活性逐步降低，在重復使用8次后GOx酶活性損失了15%。相較于此，對照CLEA粒子在重復使用過程中酶活性的損失更為嚴重，重復使用8次后GOx酶活性降低了32%。這一結果顯示，引入鈣離子能夠起到穩(wěn)定GOx酶活性的作用。這也從另一側面進一步驗證了低濃度鈣離子的引入對GOx酶活性位點和分子構象的保護作用。

圖6 Ca2+對GOx酶CLEA反應動力學的影響Fig. 6 Effect of calcium ions on the CLEA kinetics of GOx enzyme.Cs is the concentration of the substrate.

圖7 GOx酶CLEA活性隨催化次數(shù)的變化Fig. 7 Relationship of relative activity of CLEA and operational cycles.

3 結論

針對CLEA粒子尺寸和微觀結構的調控，以GOx酶為研究對象，系統(tǒng)地考察了鈣離子對CLEA粒子尺寸和微觀結構以及酶催化性能和實用性的影響。研究結果表明，GOx酶沉淀過程中引入鈣離子顯著降低了CLEA粒子尺寸，同時CLEA粒子的納米孔道結構也隨之漸趨消失。0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備CLEA粒子仍保有清晰的、有利于底物和產物擴散的納米孔道結構。以葡萄糖為底物的GOx酶催化結果顯示，0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子GOx酶活性為對照CLEA的2.69倍；即便1.0 mmol/L鈣離子濃度下制備的GOx酶CLEA活性仍高出對照CLEA 42%。此外，0.1 mmol/L鈣離子濃度下制備的CLEA粒子不僅具有更高的GOx酶底物轉化速率和很好的操作穩(wěn)定性，而且CLEA中GOx酶的最大反應速率顯著提高。研究結果顯示，這歸功于鈣離子對GOx酶活性位點和酶分子構象的保護作用。本文的研究結果明確了鈣離子對CLEA粒子尺寸和微觀結構的調控作用，為制備具有高效生物催化活性的CLEA粒子奠定了基礎。

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(本文責編 陳宏宇)

Structural regulation by calcium ion in preparing cross-linked enzyme aggregates

Xiaoqi Han1, Shu Bai1, and Qinghong Shi1,2
1 School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300354, China
2Key Laboratory of System Bioengineering of Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300354, China

We studied the effect of calcium ion on particle size and pore structure of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) of glucose oxidase, with activity and stability of the enzyme as evaluation criteria. With calcium ion to prepare CLEA significantly decreased particle sizes of CLEAs whilst the pore structures of CLEAs gradually disappeared with the increase of calcium concentration. When glucose oxidase was precipitated at 0.1 mmol/L Ca2+, glucose oxidase in CLEA showed the definitive pore structure. Moreover, glucose oxidase activity in CLEA with Ca2+was 1.69 times higher than that without Ca2+. Even at Ca2+as high as 1.0 mmol/L, glucose oxidase activity in CLEA was 42% higher than that of CLEA without Ca2+. Furthermore, CLEA prepared with 0.1 mmol/L Ca2+not only exhibited higher substrate conversion and operational stability, but also increased the maximum reaction speed. Therefore, calcium ion improved the performance of glucose oxidase in CLEAs.

glucose oxidase, cross-linked enzyme aggregates, calcium ion, channeling for diffusion, turnover rate

Qinghong Shi. Tel: +86-22-27403389; E-mail: qhshi@tju.edu.cn

Received:April 16, 2016;Accepted:May 24, 2016

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 21276189, 21236005), Natural Science Foundation of Tianjin (No. 15JCYBJC48500).

國家自然科學基金 (Nos. 21276189, 21236005)，天津市應用基礎與前沿技術研究計劃 (No. 15JCYBJC48500) 資助。

時間：2016-07-14

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160714.1436.002.html