馬艷，李偉，李小波，鮑冬梅，盧建培

1 廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

2 廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及活性鑒定

馬艷1，李偉2，李小波1，鮑冬梅1，盧建培1

1 廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

2 廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

馬艷, 李偉 李小波, 等. 肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及活性鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(12): 1715-1726.

Ma Y, Li W, Li XB, et al. Optimization of expression conditions and activity identification of hepatocyte-targeting peptide-human endostatin. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1715-1726.

為了獲得足夠多純度高且有活性的肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白（HTP-rES），首先研究了BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株的生長(zhǎng)曲線和最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)；單因素分析不同pH值、不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)劑濃度、不同誘導(dǎo)溫度時(shí)融合蛋白表達(dá)量；通過(guò)包涵體洗滌、復(fù)性、純化，以獲得高純度的肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合蛋白；最后采用流式細(xì)胞儀和MTT對(duì)融合蛋白進(jìn)行活性鑒定。結(jié)果表明，BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株在1.5-3.5 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基pH 8.0、IPTG終濃度0.06 mmol/L、42 ℃、誘導(dǎo)表達(dá)5 h為最佳表達(dá)條件。包涵體洗滌后純度達(dá)60%，經(jīng)復(fù)性、純化后獲得的目的蛋白純度達(dá)到95%以上，對(duì)人肝癌細(xì)胞具有靶向性，能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。研究確立了融合蛋白最佳表達(dá)條件以及復(fù)性、純化條件，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

肝靶向肽，人內(nèi)皮抑制素，表達(dá)條件優(yōu)化，活性鑒定

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81502520)，廣東省自然科學(xué)基金 (No. 2016A030310299) 資助。

內(nèi)皮抑制素 (Endostatin，ES) 是由細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原ⅩⅧ的羧基末端水解而來(lái)的一種動(dòng)物體內(nèi)天然存在的蛋白，是一種內(nèi)源性血管形成抑制因子，能選擇性地靶向微血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和黏附，負(fù)性調(diào)節(jié)血管形成過(guò)程，具有廣譜的抗腫瘤作用[1-4]。另外，ES對(duì)一些腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等也具有明顯的抑制作用[5-6]。但ES用藥劑量大、療效不夠理想等缺點(diǎn)，限制了其在臨床中的應(yīng)用。肝靶向肽 (Hepatocyte-targeting peptide) 能與肝細(xì)胞表面上的受體特異性結(jié)合，將具有藥物活性的物質(zhì) (如放射性核素、化療藥物、毒素、酶和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等) 盡量集中于肝臟部位，發(fā)揮其生物學(xué)功能[7-8]。本課題組提出將肝靶向肽與人內(nèi)皮抑制素進(jìn)行融合，制備肝靶向人內(nèi)皮抑制素 (HTP-rES)，提高藥物在病灶部位的局部濃度，從而可提高藥物的治療指數(shù)。

前期工作中，我們利用SOE-PCR重組了肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素融合基因，并成功構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21/pET21b-HTP-rES。本研究通過(guò)優(yōu)化目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)條件、目的蛋白包涵體復(fù)性條件以及目的蛋白的純化條件，以期確立目的蛋白最佳表達(dá)條件，獲得足夠多的純度高且有活性的目的蛋白，為進(jìn)一步研究肝靶向肽-人內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性及藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 表達(dá)菌株和細(xì)胞株

BL21/pET21b-HTP-rES由廣東藥科大學(xué)廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVECs) 購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司，人肝癌細(xì)胞HepG2、人正常肝細(xì)胞Chang's購(gòu)自上?？茖W(xué)院細(xì)胞所。

1.1.2 主要試劑

酵母提取物、胰蛋白胨 (OXOID公司)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、還原型谷胱甘肽 (GSH)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG) (Sigma公司)，His Trap HP 親和層析柱 (GE公司)，Endothelial cell medium (ECM，ScienCell公司)，Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)、FBS (Gibco公司)。

1.1.3 主要儀器

蛋白垂直電泳儀、Gel100凝膠成像系統(tǒng)、全波長(zhǎng)掃描分光光度計(jì) (BIO-RAD公司)；大型高速冷凍離心機(jī) (Backman公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀 (Sonics公司)：蛋白質(zhì)層析純化設(shè)備(GE公司)、超低溫冷凍干燥儀 (Labconco公司)、制備型高效液相 (Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將構(gòu)建好的表達(dá)菌株BL21/pET21b-HTP-rES接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。按1∶100 (V/V) 接入到20 mL LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9和10 h各取1 mL菌液進(jìn)行OD600值測(cè)量，繪制出BL21/pET21b-HTP-rES生長(zhǎng)曲線，確定其生長(zhǎng)規(guī)律。

1.2.2 最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的BL21/pET21b-HTP-rES按1∶100 (V/V)接入到35 mL LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即OD600≈0.5后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑，開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別于0、1.5、2、2.25、2.5、2.75、3和3.5 h，取1 mL菌液進(jìn)行SDS-PAGE，分析表達(dá)菌株的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

1.2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化

在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，單因素分析不同培養(yǎng)溫度 (17 ℃、25 ℃、32 ℃、37 ℃、42 )℃、不同誘導(dǎo)時(shí)間 (0、1.5、2、3、4、5、6、7、8 h)、不同IPTG濃度 (0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、3.84 mmol/L)、不同pH培養(yǎng)基 (4、5、6、7、8、9、10) 時(shí)目的蛋白的表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

1.2.4 目的蛋白包涵體的洗滌分離

在優(yōu)化的表達(dá)條件下，大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，8 000 r/min離心15 min收集菌體。將菌體用1×PBS洗滌1次，裂解緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0) 重懸，冰上超聲裂解，超聲條件：300 W超聲10 s，間隔15 s，25 min，菌體變澄清。8 000 r/min離心15 min去上清，沉淀用洗滌液A (50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，1% TritonX-100，pH 8.0) 洗3次，或者用洗滌液B (50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，2 mol/L尿素，pH 8.0) 洗3次，洗滌上清和沉淀分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 目的蛋白包涵體的復(fù)性

對(duì)所得包涵體稱重，每0.1 g包涵體加入10 mL變性液 (6 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，室溫下攪拌至液體澄清，8 000 r/min離心15 min收集上清。將變性液按1∶10稀釋到稀釋液 (3 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，4 mmol/L GSH，1 mmol/L GSSG，pH 8.0)，然后進(jìn)行梯度鹽酸胍透析復(fù)性。透析液分別為A (2.0 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)；B (1.0 mol/L鹽酸胍，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)；C (0.5 mol/L鹽酸胍，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)；D (0.25 mol/L鹽酸胍，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)和E (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)，每種透析液透析12 h。8 000 r/min離心15 min收集透析液E上清，獲得復(fù)性后融合蛋白，BCA法測(cè)定復(fù)性后蛋白濃度。

1.2.6 目的蛋白的純化

復(fù)性重折疊的上清液用Ni-NTA (30 mL，GE公司) 親和層析柱進(jìn)行純化。首先對(duì)AKTA純化儀進(jìn)行沖洗、平衡。設(shè)置程序，用5 mL/min的速度上樣復(fù)性后的蛋白液，緩沖液A (20 mmol/L Tris-HCl，0.4 mol/L NaCl，0.5% TritonX-100，10 mmol/L咪唑，pH 7.4) 平衡柱子，在5個(gè)柱體積內(nèi)用緩沖液B (20 mmol/L Tris-HCl，0.4 mol/L NaCl，0.5% TritonX-100，1.0 mol/L咪唑) 從0%?100%梯度洗脫吸附在柱子上的蛋白；分階段收集洗脫的蛋白溶液，SDS-PAGE分析，將雜蛋白少融合蛋白含量高的蛋白液進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥，并儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 目的蛋白R(shí)P-HPLC檢測(cè)

用C18型HPLC進(jìn)行蛋白純度分析。流動(dòng)相為CH3OH∶0.05 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液=40∶60 (V/V)，pH 5.5，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，目標(biāo)物濃度以色譜峰面積計(jì)算。

1.2.8 融合蛋白的活性鑒定

融合蛋白對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向作用：用分別含20 μg/mL內(nèi)皮抑素、10 μg/mL HTP-rES的培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，37 ℃、30 min后收集細(xì)胞，依次加入Anti-ES與PE標(biāo)記的二抗，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度，即HTP-rES與人肝癌細(xì)胞HepG2的結(jié)合活性。HTP-rES對(duì)細(xì)胞的抑制作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，加入10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.312、0.0 μg/mL HTP-rES，6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，MTT法測(cè)定OD490的值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BL21/pET21b-rhES重組菌株的生長(zhǎng)曲線分析

生長(zhǎng)曲線反映了重組菌株的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)，從曲線中可以確定工程菌在某一時(shí)刻所處的生長(zhǎng)階段。依此為依據(jù)，選擇合適的誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)。由BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株的生長(zhǎng)曲線 (圖1) 可見(jiàn)，在1.5?3.5 h之間，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)考察

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，基因工程菌選擇在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)，此時(shí)工程菌生長(zhǎng)速度較快，蛋白積累速度加快，表達(dá)水平較高。根據(jù)菌株生長(zhǎng)曲線，本實(shí)驗(yàn)考察了0 h、1.5 h、2 h、2.25 h、2.5 h、2.75 h、3 h、3.5 h七個(gè)誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)融合蛋白表達(dá)水平的影響。SDS-PAGE結(jié)果分析表明(圖2)，在2.5 h進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量和目的蛋白在總蛋白中比例都較高。因此選擇2.5 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

圖1 BL21/pET21b-HTP-rES重組菌株的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 The growth curve of BL21/pET21b-HTP-rES.

2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化

在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，不同誘導(dǎo)時(shí)間表明 (圖3)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)目的蛋白表達(dá)量隨之增加，在5 h時(shí)達(dá)到高峰，并持續(xù)到7 h，但雜蛋白也有所增加，所以最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h。以最佳的誘導(dǎo)時(shí)間，在不同溫度、不同pH值和不同IPTG濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明 (圖4、5、6)，42 ℃表達(dá)量最高，pH 8.0表達(dá)量最高，IPTG濃度為0.06、0.48、0.96 mmol/L時(shí)表達(dá)量相當(dāng)。因?yàn)镮PTG對(duì)菌株有毒性，本實(shí)驗(yàn)選擇42 ℃、pH 8.0、IPTG終濃度為0.06 mmol/L、誘導(dǎo)5 h是最佳表達(dá)條件。

圖2 BL21/ pET21b-HTP-rES重組菌株的不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的表達(dá)量Fig. 2 The expression of pET21b-HTP-rES at different induction time. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different induction timing by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The percent of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis software.

圖3 不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE of expression level at differient induction times. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at differient induction times by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

圖4 不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE of induced expression at different temperature. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different temperature by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

圖5 不同pH值誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE of induced expression at different pH. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different pH by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

2.4 目的蛋白包涵體的洗滌、溶解和復(fù)性

包涵體經(jīng)洗滌液洗滌的電泳結(jié)果 (圖7)，洗滌液粗略洗滌后，包涵體中的細(xì)菌雜蛋白有了明顯減少。為獲得有生物活性的蛋白，需將溶解后的蛋白進(jìn)行復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)選用稀釋梯度透析復(fù)性。多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶解稀釋后的蛋白濃度在0.5 mg/mL時(shí)有利于后續(xù)的復(fù)性實(shí)驗(yàn)；當(dāng)透析液中鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時(shí)有少量沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明融合蛋白在鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時(shí)開(kāi)始復(fù)性。在鹽酸胍濃度為0.5 mol/L和0.25 mol/L復(fù)性液中添加GSH和GSSG，蛋白復(fù)性率大大提高 (表1)。

圖6 不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE of induced expression at different IPTG. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different IPTG by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. (B) The volume of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis.

表1 HTP-rES蛋白復(fù)性率Table 1 Refolding yield of HTP-rES

圖7 不同洗滌液洗滌包涵體后的SDS-PAGE分析Fig. 7 SDS-PAGE of the inclusion body after washed by the different washing buffer. (A) Expression of pET21b-HTP-rES at different induction timing by SDS-PAGE in 15% resolving gel that stained with Coomassie Blue. 1: whole cells after induction; 2: supernatant of lysate; 3: precipitation of lysate; 4: supernatant after first washing; 5: precipitate after first washing; 6: supernatant after second washing; 7: precipitate after second washing; 8: supernatant after third washing; 9: precipitate after third washing; M: protein marker. (B) The percent of target protein in band was scanned by quantity one gel analysis software.

2.5 目的蛋白的純化及RP-HPLC

融合蛋白N端有6×His標(biāo)簽，復(fù)性后的融合蛋白經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和層析柱純化后，在咪唑濃度為150 mmol/L時(shí)出現(xiàn)目的蛋白洗脫峰，SDS-PAGE和RP-HPLC結(jié)果表明：得到純度高達(dá)95%的融合蛋白 (圖8和圖9)。

2.6 目的蛋白的活性鑒定

圖8 融合蛋白純化的洗脫條件和SDS-PAGE分析Fig.8 Elution conditions of fusion protein purification and SDS-PAGE analysis. 1-7: elution buffer of collection tube 1 to 7 with different imidazole; M: protein marker.

圖9 純化后融合蛋白的RP-HPLC結(jié)果Fig. 9 RP-HPLC of the fusion protein after purified.

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HTP-rES與HepG2結(jié)合活性 (圖10)，可見(jiàn)含有HTP-rES融合蛋白處理過(guò)的HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯高于無(wú)肝靶向肽的人內(nèi)皮抑制素和空白對(duì)照。表明HTP-rES對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞具有靶向性。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖11) 表明HTP-rES可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并具有一定的劑量依賴性。在10 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果最好，達(dá)到48.75%；而HTP-rES對(duì)正常肝細(xì)胞Chang's作用不明顯。

圖10 融合蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的結(jié)合活性Fig. 10 The binding of the fusion protein to HepG2.

圖11 融合蛋白對(duì)細(xì)胞的抑制作用Fig. 11 Inhibition of the fusion protein to different cells.

3 討論

蛋白質(zhì)藥物因?yàn)榫哂懈呋钚?、?qiáng)特異性、低毒性、生物功能明確和有利于臨床應(yīng)用等特點(diǎn)，已成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分。利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)藥物成本低、成功率高、安全可靠，越來(lái)越受到研究者的青睞。原核表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)槠湟子谂囵B(yǎng)、繁殖快、表達(dá)量高、成本低、易純化和遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，成為表達(dá)重組蛋白藥物的首選體系[9-11]。原核表達(dá)時(shí)，不同誘導(dǎo)條件在很大程度上影響目的蛋白得率[12-15]。為提高目的蛋白的表達(dá)效率，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了重組菌株的生長(zhǎng)曲線，進(jìn)一步對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、最適pH、最適IPTG濃度、最適誘導(dǎo)時(shí)間和最適溫度；通過(guò)包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性和純化獲得了既能靶向于肝癌細(xì)胞又能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的融合蛋白。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)考察不同時(shí)機(jī)發(fā)現(xiàn)，在2.5 h進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量和目的蛋白在總蛋白中比例都較高，為最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。單因素優(yōu)化表達(dá)條件結(jié)果表明，融合蛋白的表達(dá)最佳條件為42 ℃、pH 8.0、IPTG濃度0.06 mmol/L和誘導(dǎo)5 h，占細(xì)胞總蛋白的30%。由于包涵體中的融合蛋白與部分破碎的細(xì)胞膜膜蛋白及脂體粘連在一起，影響后續(xù)復(fù)性效率，所以在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用去污劑如1% TritonX-100或低濃度的變性劑 (如2 mol/L尿素) 在50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA中洗滌，通過(guò)洗滌包涵體沉淀得到粗制的融合蛋白，高濃度的變性劑能使包涵體溶解，如6 mol/L鹽酸胍或8 mol/L尿素，通過(guò)離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而使大部分包涵體蛋白溶解。本實(shí)驗(yàn)分別或先后使用1% TritonX-100或2 mol/L尿素洗滌，發(fā)現(xiàn)用2 mol/L尿素洗滌時(shí)會(huì)有部分目的蛋白被洗下來(lái)，另外2 mol/L尿素洗滌后包涵體在6 mol/L鹽酸胍中的溶解率降低，最后確定用洗滌液A (1% TritonX-100，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗滌3次，用6 mol/L鹽酸胍溶解。為獲得有生物活性的蛋白，需將溶解后的蛋白進(jìn)行復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)選用稀釋透析復(fù)性。多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)透析液中鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時(shí)有少量沉淀產(chǎn)生，當(dāng)透析液中不含鹽酸胍時(shí)產(chǎn)生大量沉淀，說(shuō)明融合蛋白在鹽酸胍濃度為0.5 mol/L時(shí)開(kāi)始復(fù)性。增加鹽酸胍濃度為0.25 mol/L透析液，緩慢去除變性劑，添加GSH和GSSG，有利于二硫鍵的緩慢形成，蛋白復(fù)性率大大提高。

肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)是血管豐富的實(shí)體性腫瘤，腫瘤血管生成在其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[16-18]。因此，HCC的抗腫瘤血管生成治療具有巨大的科學(xué)意義和重要的實(shí)用價(jià)值。ES與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的肝素/硫酸肝素 (HS)、Integrin和VEGF等多種受體結(jié)合，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和黏附；另外，ES還能與一些腫瘤細(xì)胞上的Integrin α5β1結(jié)合影響增殖、遷移、黏附等。美國(guó)EntreMed公司采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了人內(nèi)皮抑制素，因?yàn)楫a(chǎn)量低且半衰期短而限制了其在臨床上的應(yīng)用[19-20]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了新型重組人內(nèi)皮抑制素 (Recombinant human endostatin，rES，商品名Endostar，恩度)，其氨基末端經(jīng)過(guò)基因修飾加上了9個(gè)氨基酸序列 (MGGSHHHHH)，形成6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，從而提高了產(chǎn)量，簡(jiǎn)化了純化工藝，蛋白質(zhì)活性和穩(wěn)定性也有了明顯提高，目前已用于治療多種腫瘤[21-24]。但治療時(shí)ES在體內(nèi)各組織分布相對(duì)平均，在病灶部位形成有效濃度較低，為了達(dá)到臨床效果，只有加大藥物劑量，或增加給藥次數(shù)，或聯(lián)合化療藥物用藥；因此，提高治療成本，引起較嚴(yán)重的毒副作用。提高ES的靶向性，可將藥物有效地輸送至病變部位，可提高藥物的治療指數(shù)，減少其毒副作用[25-27]。本研究構(gòu)建的肝靶向肽-重組人內(nèi)皮抑制素融合蛋白，經(jīng)原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)、復(fù)性和親和層析純化后，獲得純度高達(dá)95%的融合蛋白。該融合蛋白與肝癌細(xì)胞HepG2的結(jié)合能力明顯高于無(wú)靶向性的重組人內(nèi)皮抑制素Endostar具有良好的肝細(xì)胞靶向性；同時(shí)還能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖，可能成為肝癌靶向治療一種新型、有效的治療手段。該研究確定了融合蛋白最佳表達(dá)條件，獲得了純度高且有活性的目的蛋白，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Yan Ma. Tel: +86-20-39352552; E-mail: mayan820901@126.com

Optimization of expression conditions and activity identification of hepatocyte-targeting peptide-human endostatin

Yan Ma1, Wei Li2, Xiaobo Li1, Dongmei Bao1, and Jianpei Lu1
1 Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances, School of Basic Sciences, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China
2 School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

To obtain sufficient purified and active fusion protein-hepatocyte-targeting peptide-human endostatin (HTP-rES), we studied the growth curve and the optimal induction timing of BL21/pET21b-HTP-rES. Different conditions of pH value, induction time, induction concentration and induction temperature were optimized by univariate analysis. After washing, refolding and purifying, the activity of fusion protein was identified by flow cytometry and 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide (MTT). Results show that the logarithmic growth phase of BL21/pET21b-HTP-rES was from 1.5 h to 3.5 h, the optimum expression conditions were pH 8.0, 0.06 mmol/L IPTG, at 42 ℃ for 5 h. The purity of inclusion bodies was up to 60% after washing. The purity of target protein was more than 95% after refolding and purification. Our findings provide the foundation for further biological activity and drug development.

hepatocyte-targeting peptide, human endostatin, expression conditions, activity identification

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81502520), Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2016A030310299).

Received:April 28, 2016;Accepted:August 8, 2016