梁敏，彭婷婷，石亞偉

山西大學(xué)生物技術(shù)研究所 教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

敲除L-periaxin基因的大鼠RSC96細(xì)胞系的建立

梁敏，彭婷婷，石亞偉

山西大學(xué)生物技術(shù)研究所 教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

梁敏, 彭婷婷, 石亞偉. 敲除L-periaxin基因的大鼠RSC96細(xì)胞系的建立. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(12): 1735-1744.

Liang M, Peng TT, Shi YW. Establishment of L-periaxin gene knock-out RSC96 cell line. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1735-1744.

軸周蛋白 (Periaxin) 是外周神經(jīng)系統(tǒng)非致密性髓鞘中特異表達(dá)的蛋白，編碼Periaxin的基因經(jīng)由選擇性剪接產(chǎn)生兩種蛋白異構(gòu)體L-periaxin和S-periaxin，對髓鞘形成的初始化有重要作用。至今在Periaxin 基因上已發(fā)現(xiàn)有18種不同的位點(diǎn)突變導(dǎo)致外周脫髓鞘神經(jīng)疾病腓骨肌萎縮癥4F亞型 (CMT4F) 的發(fā)生。利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (TALENs) 靶向基因敲除技術(shù)對大鼠RSC96細(xì)胞的periaxin基因進(jìn)行敲除，根據(jù)TALENs設(shè)計原則，確定L-periaxin基因的敲除靶點(diǎn)在其編碼NLS結(jié)構(gòu)域部分，設(shè)計相應(yīng)的TALEN左臂與右臂的識別序列，構(gòu)建含上述識別序列的L-periaxin基因敲除載體TALEN-L和TALEN-R，并將其轉(zhuǎn)入RSC96細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選，獲得L-periaxin基因敲除細(xì)胞株，經(jīng)測序確認(rèn)大鼠RSC96細(xì)胞中的基因組中L-periaxin基因區(qū)段已被敲除，成功構(gòu)建了L-periaxin基因敲除細(xì)胞模型。計算L-periaxin基因敲除載體的突變率為21.6%。Western blotting 實(shí)驗(yàn)證明，在RSC96細(xì)胞中只能檢測到S-periaxin蛋白的表達(dá)。通過流式細(xì)胞術(shù)及MTT實(shí)驗(yàn)檢測基因敲除細(xì)胞的細(xì)胞周期和生長速度，發(fā)現(xiàn)敲除L-periaxin基因的細(xì)胞生長速度緩慢，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少。

periaxin，基因敲除，RSC96細(xì)胞，TALEN技術(shù)

Periaxin是施萬細(xì)胞中特異表達(dá)的支架蛋白之一[1]，參與髓鞘成熟及穩(wěn)定[2-3]。Periaxin蛋白在周圍神經(jīng)纖維發(fā)育早期即可表達(dá)，在髓鞘中的定位是逐漸變化的，在髓鞘形成過程中，其表達(dá)在近軸突膜上 (靠近軸突)，但髓鞘成熟后，它定位在遠(yuǎn)軸突膜上 (靠近基底膜)[4]。Periaxin敲除的小鼠髓鞘纖維可正常發(fā)育[5]，但是細(xì)胞質(zhì)帶 (Cajal帶) 被破壞，并且施萬細(xì)胞在神經(jīng)發(fā)育過程中的伸長程度受損[6]，導(dǎo)致節(jié)間距離減小，使神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低，影響運(yùn)動功能。Periaxin的突變也會導(dǎo)致多種神經(jīng)疾病，包括先天性肌營養(yǎng)不良、神經(jīng)纖維瘤病和麻風(fēng)病[7]。至今在Periaxin基因上已發(fā)現(xiàn)有18種不同的位點(diǎn)突變可能導(dǎo)致外周脫髓鞘神經(jīng)疾病CMT4F亞型的發(fā)生[8]。Periaxin根據(jù)mRNA剪接方式的不同可以編碼L-periaxin和S-periaxin兩種蛋白亞型，分別含有1 461個氨基酸和147個氨基酸[9-10]。

TALEN (Transcription activator-like effector nucleases) 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶，是繼歸巢核酸內(nèi)切酶 (Homing endonucleases)、鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases, ZFNs) 技術(shù)之后[11]，發(fā)展起來的又一種對靶向基因進(jìn)行修飾的新技術(shù)。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子 (Transcription activator-like effectors，TALEs) 最初發(fā)現(xiàn)于植物病原黃單胞菌中，可以特異性地識別并結(jié)合一定的DNA序列[12]；ForkⅠ是一種Ⅱs型限制酶，在二聚體的狀態(tài)下存在切割活性[13]。TALE核酸酶(TALENs) 即是由TALEs構(gòu)成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與內(nèi)切核酸酶ForkⅠ構(gòu)成的切割結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

TALE蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由數(shù)量可變且高度保守的重復(fù)單元組成，一般情況下，34個氨基酸組成一個重復(fù)單元，每個重復(fù)單元序列中第12、13位的氨基酸特異識別DNA鏈中的A、T、G、C堿基[14]。這樣一個能夠識別單一堿基的TALE蛋白可作為一個單獨(dú)的基本單元模塊，多個這樣的模塊按照一定的順序串連組合，可識別特定的DNA序列。所以DNA序列中的每一個堿基的識別都需要一個對應(yīng)的基本單元模塊，即編碼34個氨基酸的TALE重復(fù)序列。

2009年，各個重復(fù)單元特異識別的DNA堿基被破譯。12、13位氨基酸與堿基之間的對應(yīng)分子密碼為：NI對應(yīng)A，HD對應(yīng)C，NG對應(yīng)T，NN對應(yīng)G/A[11]。根據(jù)TALE-DNA分子密碼，將識別目的序列上各個堿基的TALE單元依次連接，構(gòu)成可識別完整堿基序列的TALEs；并與ForkⅠ酶相連接即形成DNA酶TALEN[15]。兩個TALEN單體的結(jié)合位點(diǎn)間的距離要適當(dāng)，并且反向相對，使得ForkⅠ的兩個單體能在一處聚集并形成具有切割活性的二聚體，從而定點(diǎn)剪切DNA[16]。

RSC96細(xì)胞株是原代大鼠施萬細(xì)胞經(jīng)長時間培養(yǎng)后自發(fā)轉(zhuǎn)化而成的[17-18]，為了進(jìn)一步研究L-periaxin基因在髓鞘形成過程中的作用，我們利用TALEN技術(shù)構(gòu)建了一對針對L-periaxin基因的TALENs載體，獲得了敲除L-periaxin基因的RSC96細(xì)胞株，為后續(xù)研究其在髓鞘形成過程中的作用及腓骨肌萎縮癥的防治提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆菌株E. coli X10由本實(shí)驗(yàn)室保存；大鼠施萬細(xì)胞RSC96購自武漢博士德生物公司，用含10%無支原體胚胎牛血清的DMEM (含葡萄糖4.5 g/L，含丙酮酸鈉0.11 g/L) 培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)中載體構(gòu)建使用上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司TALEN試劑盒中：A、T、G、C 四種TALE基本單元模塊 (即多個能夠識別A、T、G、C四個堿基的TALE蛋白)，L15: cmv-sp6-NLS-TAL-T-IRES-puro-pA，R11: cmv-sp6-NLSTAL-T-pA作為左右臂載體。

兔抗L-periaxin及S-periaxin多抗購自上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司，山羊抗兔抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

按照TALENs設(shè)計原則在TALEN序列設(shè)計軟件中 (https://tale-nt.cac.cornell.edu/) 確定L-periaxin基因敲除靶位點(diǎn)，選用位于NLS2結(jié)構(gòu)域的一段基因作為靶點(diǎn)，并在其上下游分別設(shè)計相應(yīng)的TALEN左臂識別序列、TALEN右臂識別序列 (表1)。

按照TALEN試劑盒構(gòu)建方法，通過反復(fù)的酶切-連接反應(yīng)構(gòu)建可特異識別periaxin基因左、右臂的TALEN重復(fù)序列，并將TALEN左、右臂識別序列分別與cmv-sp6-NLS-TAL-T-IRES-puro-pA、cmv-sp6-NLS-TAL-T-pA (質(zhì)粒圖譜見圖1，由上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司提供) 載體重組，分別命名為TALEN-L與TALEN-R。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及藥篩

將DMEM (含葡萄糖4.5 g/L，含丙酮酸鈉0.11 g/L)培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，向培養(yǎng)RSC96細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入4-5 mL培養(yǎng)基后，置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞6 h后可貼壁，1-2 d后可更換細(xì)胞培養(yǎng)液，2-3 d后可傳代。取生長狀態(tài)良好的RSC96細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前一天接種于培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時，將TALEN-L、TALEN-R與pEGFPN1共轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。取2 μg TALEN-L、2 μg TALEN-R、0.5 μg pEGFP-N1與6 μL脂質(zhì)體混勻后室溫孵育20 min，加入細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染后的RSC96細(xì)胞置于Delta Vision下觀察，確定轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70%后，加入16 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行藥篩。藥篩3 d后，得到成功轉(zhuǎn)入TALEN-L和TALEN-R的細(xì)胞，用無抗性的培養(yǎng)基再培養(yǎng)數(shù)日。

表1 大鼠L-periaxin基因的靶點(diǎn)信息Table 1 The target information of Rattus L-periaxin gene

圖1 TALEN質(zhì)粒圖譜 (左圖為連接可識別TALEN左臂，即靶位點(diǎn)上游序列的TALEN重復(fù)序列的載體；右圖為連接可識別TALEN右臂，即靶位點(diǎn)下游序列的TALEN重復(fù)序列的載體)Fig. 1 The plasmid profile of TALEN. Left: connecting-vector of TALEN-L; Right: connecting-vector of TALEN-R.

1.4 TALEN表達(dá)載體的活性檢測及突變率檢測

根據(jù)periaxin基因序列在位于編碼NLS結(jié)構(gòu)域的打靶位點(diǎn)上下游各300 bp處設(shè)計引物Sense (5'-CCCCTGTCCACTCACTGTGAGATT C-3') 和Antisense (5'-GGCTCCTAGCCCAAGG GTTGGCAGG-3')，以藥篩后的RSC96細(xì)胞全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物測序。再將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，進(jìn)行單克隆測序，以單克隆測序結(jié)果中含有基因突變的序列數(shù)占所有測序序列數(shù)比例，確定質(zhì)粒的突變率。

1.5 單克隆篩選

消化經(jīng)過藥篩的細(xì)胞接種96孔板，挑選單個細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，并將細(xì)胞克隆編號。待細(xì)胞長至一定數(shù)量，將不同編號的細(xì)胞分別收取少量細(xì)胞進(jìn)行鑒定，其余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)、凍存，用于后續(xù)研究。收取的少量細(xì)胞分別提取基因組DNA，以上述Sense和Antisense為引物，PCR擴(kuò)增TALENs作用靶位點(diǎn)處上下游共約650 bp片段，經(jīng)T7E1酶酶切后，通過瓊脂糖凝膠檢測，如果出現(xiàn)雜帶，則證明該單克隆細(xì)胞株為突變型。之后將鑒定為突變的細(xì)胞克隆的PCR產(chǎn)物分別與pMD18-T克隆載體連接，每個克隆挑取至少10個單菌落測序。采用同源性分析軟件(DNAMAN) 進(jìn)行序列比對，分析確定突變類型。

1.6 Western blotting檢測細(xì)胞中Periaxin蛋白表達(dá)情況

收集L-periaxin基因敲除成功的RSC96細(xì)胞及對照組RSC96細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。將待測樣品置于聚丙烯酰胺凝膠上，電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 (上海生工生物工程股份有限公司) 上。經(jīng)過封閉后，用兔抗L-periaxin及S-periaxin多抗 (上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司) 4 ℃過夜孵育，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫振蕩2 h后洗滌，顯色。

1.7 RSC96細(xì)胞、L-periaxin缺失的RSC96細(xì)胞和體外轉(zhuǎn)染L-periaxin的RSC96細(xì)胞的生長曲線的繪制

分別取對數(shù)生長期的RSC96細(xì)胞、L-periaxin缺失的RSC96細(xì)胞和體外轉(zhuǎn)染L-periaxin的RSC96細(xì)胞接種于96孔板，每孔3 000個細(xì)胞，每組9個復(fù)孔，分別于接種后的第12、24、36、48、60、72 h加MTT (5 mg/mL)，20 μL/孔，37 ℃、5% CO2溫箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清后加DMSO 150 μL/孔，37 ℃振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，于490 nm波長處在酶聯(lián)儀上測定各孔吸光度值，以時間為橫軸、吸光度值為縱軸，繪制3組細(xì)胞生長情況柱狀圖。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

分別將1×106個RSC96細(xì)胞、L-periaxin缺失的RSC96細(xì)胞和體外轉(zhuǎn)染L-periaxin的RSC96細(xì)胞種植于35 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜之后換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。用70%冰冷的乙醇4 ℃固定2 h，3 000×g離心5 min，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后重懸于含50 μg/mL的PI (Propidium iodide, 碘化丙啶) 和100 μg/mL DNase-free RNase的PBS溶液中。樣品在37 ℃避光放置15 min后用流式細(xì)胞儀測定DNA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 TALEN表達(dá)載體鑒定

構(gòu)建TALEN表達(dá)載體的設(shè)計中TALEN左臂識別序列長度為15 bp，其中每一個堿基的識別需要一個對應(yīng)的基本單元模塊，即編碼34個氨基酸的TALEN重復(fù)序列 (102 bp)，所以識別15 bp需要的TALEN重復(fù)序列為1 530 bp (102×15 bp)，另外L15空載體BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間有803 bp，所以一旦構(gòu)建成功的TALEN-L雙酶切后得到的片段大小應(yīng)為2 333 bp (1 530+803 bp)；同理，TALEN右臂識別序列為18 bp，雙酶切后得到的片段大小為2 639 bp。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒TALEN-L與TALEN-R用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，0.7 %瓊脂糖凝膠電泳顯示 (圖2)，TALEN-L得到了約2 333 bp的目的片段和約4 570 bp的載體片段；TALEN-R得到了約2 639 bp的目的片段和約3 386 bp的載體片段，酶切結(jié)果揭示TALEN表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 TALEN表達(dá)載體活性檢測及突變率計算

將TALEN-L、TALEN-R質(zhì)粒與pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染RSC96細(xì)胞48 h后，利用Delta Vision拍照，觀察轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，其轉(zhuǎn)染效率達(dá)到70% (圖3)。

圖2 TALEN質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的電泳結(jié)果Fig. 2 Enzymatic digestion of TALEN-L and TALEN-R with BamHⅠand EcoRⅠ.

圖3 TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RSC96細(xì)胞48 h后轉(zhuǎn)染效果Fig. 3 Effect of transfection RSC96 cell with TALEN-L and TALEN-R after 48 h.

將轉(zhuǎn)染TALEN-L和TALEN-R質(zhì)粒的RSC96細(xì)胞加入16 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行藥篩3 d，部分細(xì)胞死亡，仍有貼壁存活細(xì)胞，且狀態(tài)良好。加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)天后，收集轉(zhuǎn)染成功的RSC96細(xì)胞提取基因組DNA (圖4A)。PCR擴(kuò)增TALENs作用靶位點(diǎn)處上下游可見650 bp片段 (圖4B)，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，打靶位置處的序列出現(xiàn)套峰，說明打靶成功(圖4C)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，挑選13個菌落通過自身引物篩選，目的片段大小仍為650 bp (圖4D)。依據(jù)篩選結(jié)果，將1-8和10-11號質(zhì)粒送測序。測序結(jié)果顯示，2號質(zhì)粒缺失1 bp；3號質(zhì)粒缺失7 bp；5號質(zhì)粒缺失6 bp，表明該質(zhì)粒有活性，質(zhì)粒的突變效率為21.6%，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn) (表2)。

2.3 periaxin缺失單細(xì)胞克隆的篩選

為制備periaxin基因敲除細(xì)胞系，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將TALENs表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RSC96細(xì)胞，通過挑取單克隆法獲得30個細(xì)胞克隆。采用T7E1酶切和測序的方法確定細(xì)胞克隆的突變類型。

圖4 TALEN質(zhì)?；钚詸z測結(jié)果 (A: TALEN敲除L-periaxin后的RSC96細(xì)胞基因組提取結(jié)果；B: 以基因組為模板對打靶位置進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果；C: 打靶位置PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序結(jié)果；D: 打靶位置PCR產(chǎn)物連接T載體的篩選結(jié)果)Fig. 4 Detection of TALEN plasmid activity. (A) Genome extraction from L-periaxin knock-out RSC96 cell. (B) PCR results of L-periaxin gene targeting position. (C) Sequencing results of L-periaxin gene targeting position. (D) Screening results of PCR product connected with T-vector.

用T7E1酶分別酶切每個克隆的PCR產(chǎn)物，未轉(zhuǎn)染TALENs的細(xì)胞作為對照。結(jié)果顯示，編號為G4的細(xì)胞株的PCR產(chǎn)物經(jīng)T7E1酶切后出現(xiàn)兩條帶 (圖5A)，該細(xì)胞株為突變體。又依據(jù)其PCR產(chǎn)物測序峰圖判斷 (圖5B)，其為單拷貝敲除的RSC96細(xì)胞株系。之后以同樣的方法進(jìn)行二次敲除，最終得到一株periaxin敲除的RSC96細(xì)胞。從測序結(jié)果可以看出，所取得的單克隆細(xì)胞系中，periaxin基因的一個拷貝出現(xiàn)了23 bp的堿基缺失 (圖5B箭頭指向缺失堿基位置)，另一個拷貝出現(xiàn)了1 bp的堿基缺失，從而導(dǎo)致該缺失位點(diǎn)以后閱讀框移碼的改變，終止密碼子提前出現(xiàn)，后續(xù)1 376個氨基酸不能正常表達(dá)，不能產(chǎn)生L-periaxin基因編碼的蛋白。

表2 L-periaxin基因突變細(xì)胞克隆的打靶情況Table 2 The targeting position of L-periaxin mutation in cell cloning

圖5 TALEN敲除L-periaxin的RSC96細(xì)胞突變株的鑒定 (A: 正常RSC96細(xì)胞株及編號為G4的TALEN敲除細(xì)胞株靶位點(diǎn)處PCR產(chǎn)物的T7E1酶切結(jié)果對比；B: 正常RSC96細(xì)胞株及編號為G4的TALEN敲除細(xì)胞株靶位點(diǎn)處測序結(jié)果比對)Fig. 5 Identification of TALEN knock-out L-periaxin RSC96 cell line. (A) Digestion of the genome of RSC96 and knock-out L-periaxin RSC96 cell(G4) with T7E1. (B) Comparison of the sequence between RSC96 and knock out L-periaxin RSC96 cell(G4)by TALENs.

2.4 Western blotting檢測TALEN敲除細(xì)胞中Periaxin蛋白表達(dá)

L-periaxin和S-periaxin的抗體均為C端抗體，經(jīng)過Western blotting檢測可發(fā)現(xiàn)，對照組的RSC96細(xì)胞既有L-periaxin的表達(dá)，也有S-periaxin的表達(dá)；而敲除L-periaxin的RSC96細(xì)胞中，由于打靶位置之后的1 376個氨基酸均不能正常表達(dá)，L-periaxin C端的抗體檢測不到L-periaxin的表達(dá)，只有S-periaxin的C端抗體檢測到S-periaxin的表達(dá) (圖6)。

2.5 MTT法測細(xì)胞生長

通過MTT法檢測對照組 (WT)、敲除組(periaxin-/-)、體外轉(zhuǎn)染L-periaxin組 (periaxin+/+) 3組細(xì)胞的生長狀況。結(jié)果顯示 (圖7)，敲除L-periaxin后細(xì)胞生長速度較正常細(xì)胞及體外轉(zhuǎn)染L-periaxin基因的RSC96細(xì)胞均降低，說明L-periaxin基因可能對細(xì)胞生長有一定的促進(jìn)作用，敲除后影響了細(xì)胞的生長。采用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 Western blotting檢測細(xì)胞中Periaxin蛋白表達(dá) (A: TALEN打靶位點(diǎn)及L-periaxin和S-periaxin抗體對應(yīng)的抗原表位區(qū)域；B: Western blotting檢測敲除L-periaxin的RSC96細(xì)胞的Periaxin蛋白表達(dá)結(jié)果)Fig. 6 Detection the expression of Periaxin in RSC96 cell by Western blotting. (A) Knock-out target position of TALEN and antigen epitope regions corresponding to antibodies in L-periaxin or S-periaxin. (B) Detection the periaixn in TALEN knock-out L-periaxin RSC96 by Western blotting.

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

為了進(jìn)一步驗(yàn)證L-periaxin基因?qū)?xì)胞生長的影響，對照組、敲除組和過表達(dá)組3組細(xì)胞周期利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示 (圖8)敲除組S期比例與對照組相比減少了14.94%，由此可見敲除L-periaxin通過抑制細(xì)胞的S期(即DNA合成期)，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖，同時也證明了TALEN敲除L-periaxin后，影響了其在施萬細(xì)胞中的生物學(xué)活性。

圖7 MTT法檢測細(xì)胞活力Fig. 7 Cell viability was determined by the MTT assay. Error bars represent±s of triplicate experiments. *P〈0.05; **P〈0.01.

圖8 通過流式細(xì)胞儀檢測periaxin對RSC96細(xì)胞增殖與周期的影響Fig. 8 Flow cytometry to evaluate the effect of periaxin on the proliferation and cell cycle progression of RSC96 cell.

3 討論

Periaxin基因的突變與缺失可導(dǎo)致腓骨肌萎縮癥4F亞型發(fā)生，該疾病是一種脫髓鞘型遺傳病[19-20]。Periaxin蛋白是外周神經(jīng)系統(tǒng)中成髓鞘細(xì)胞施萬細(xì)胞中特異且大量表達(dá)的蛋白，在髓鞘成熟與維護(hù)中發(fā)揮重要作用[21]。Periaxin基因突變或缺失，會導(dǎo)致施萬細(xì)胞不能正常包裹軸突，發(fā)生脫髓鞘現(xiàn)象。Gillespie等研究證明缺失了Periaxin的小鼠在6周后坐骨神經(jīng)變厚，軸突被基底薄片及施萬細(xì)胞包裹，形成洋蔥頭樣結(jié)構(gòu)[5]。神經(jīng)纖維的延展速度與節(jié)間的生長并不能完全匹配，節(jié)間距離減少，軸突直徑增加。另外，Periaxin的突變還將影響神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速度，紊亂髓鞘外郎飛氏結(jié)的節(jié)間長度和直徑等[7]。

基因敲除是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一門新技術(shù)[22]。傳統(tǒng)的打靶技術(shù)效率低，應(yīng)用大大受限[23]，所以近年來出現(xiàn)了許多新的基因敲除技術(shù)，如基因重組、鋅指核酸酶等[24]。鋅指核酸酶技術(shù)能夠?qū)Π谢蜻M(jìn)行定點(diǎn)斷裂，顯著提高同源重組效率，是一種高效的新型基因打靶技術(shù)。已應(yīng)用于多種動物基因的靶向敲除[22]。但鋅指核酸酶技術(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計復(fù)雜，成本高，且特異性不高[25]，TALENs可以靶向更長的基因序列[26]，并且相對更易構(gòu)建，能識別任意目標(biāo)基因序列，不受上下游序列影響，只需要構(gòu)建特定的轉(zhuǎn)錄激活因子。TALENs序列越長，對細(xì)胞產(chǎn)生毒副效應(yīng)的可能性就越小，因?yàn)樵蕉痰腡ALENs越有可能結(jié)合和改變目標(biāo)基因位點(diǎn)[22]。TALEN技術(shù)不受物種的限制，剪切效率高及脫靶效率低[25]，至今已經(jīng)被成功應(yīng)用于細(xì)胞、斑馬魚、果蠅、大鼠、小鼠及植物上，并且被研究者不斷地嘗試應(yīng)用到其他更多的物種中[22]。

本文通過構(gòu)建TALENs表達(dá)載體，高效獲得了缺失L-periaxin基因的細(xì)胞克隆，同時初步分析了L-periaxin基因的缺失對細(xì)胞生長的影響及原因，為進(jìn)一步研究periaxin在細(xì)胞生長及髓鞘形成中的作用奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)體外模擬髓鞘化過程的實(shí)驗(yàn)提供了必要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Establishment of L-periaxin gene knock-out RSC96 cell line

Min Liang, Tingting Peng, and Yawei Shi
Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi, China

Periaxin, a protein of noncompact myelin, is specifically expressed in the peripheral nervous system (PNS).There are two protein isoform L-periaxin and S-Periaxin by alternative splicing of periaxin gene, playing an important role in the initiation of myelin formation. So far, 18 different mutation sites in L-periaxin gene have been found to induce the peripheral demyelinating neurological charcot-marie-tooth diseases subtype 4F (CMT4F). The technique of activation of transcription activator-like effector nucleases (TALENS) was used to knock out the L-periaxin gene in RSC 96 cell line of Rattus. According to the design principle, the knock-out site of L-periaxin was assured to NLS domain of L-periaxin, which is target sequence of left and right arms of TALEN. The knock-out vectors of TALEN-L and TALEN-R were established and transfected into RSC96 cell. After puromycin screening, L-periaxin was knocked out successfully in RSC96 cell, which is confirmed by DNA sequence. The mutation efficiency is 21.6%. S-periaxin, not L-periaxin can be detected by Western blotting in L-periaxin gene knock-out RSC96 cell. The cell growth rate was decreased and the number of cells in G1 increased and decreased in S phase in L-periaxin gene knock-out RSC96 cell by flow cytometry and MTT assay.

periaxin, gene knock-out, RSC96 cell, TALENs

Yawei Shi. Tel: +86-13803451349; E-mail: yaweishi@sxu.edu.cn

Received:April 25, 2016;Accepted:September 6, 2016

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31170748), the Graduate Education and Innovation Program of Shanxi Province (No. 2016BY025).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31170748)，山西省研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目 (No. 2016BY025) 資助。

時間：2016-09-23

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160923.1417.003.html