李元，劉珊，祝俊

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

PPK和GMAS共表達(dá)重組菌株的構(gòu)建及其在L-茶氨酸合成中的應(yīng)用

李元*，劉珊*，?？?/p>

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

李元, 劉珊, ?？? PPK和GMAS共表達(dá)重組菌株的構(gòu)建及其在L-茶氨酸合成中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(12): 1745-1749.

Li Y, Liu S, Zhu J. Construction of recombinant strains co-expressing PPK and GMAS for the synthesis of L-theanine. Chin J Biotech, 2016, 32(12): 1745-1749.

構(gòu)建了共表達(dá)ATP再生和L-茶氨酸合成酶的重組大腸桿菌菌株，并將其應(yīng)用于L-茶氨酸的合成中。合成多聚磷酸鹽激酶 (PPK) 和γ-谷氨酰甲胺合成酶 (GMAS) 基因序列，分別利用pETDuet-1和pET-21a(+)載體，構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒pETDuet-ppk+gmas和pET21a-ppk+gmas。將上述兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3) 中，獲得重組菌株TPG和APG。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE結(jié)果表明，PPK和GMAS在兩種重組菌中均可溶性表達(dá)。當(dāng)用于催化L-茶氨酸合成時，來自APG的GMAS-PPK要優(yōu)于TPG。利用APG所產(chǎn)的酶進(jìn)行L-茶氨酸合成，在37 ℃、pH 7.0條件下，使用催化量ATP可實現(xiàn)L-茶氨酸的摩爾產(chǎn)率為86.0%。該結(jié)果一方面擴展了酶法ATP再生系統(tǒng)的應(yīng)用，另一方面為生物催化合成L-茶氨酸提供了一種有效方法。

ATP再生，γ-谷氨酰甲胺合成酶，多聚磷酸鹽激酶，L-茶氨酸，共表達(dá)，雙酶偶聯(lián)

腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP) 是一種高能磷酸化合物，是生物體內(nèi)最直接的能量來源。在工業(yè)中，ATP常常用于生物合成酶催化生產(chǎn)高附加值化學(xué)品的反應(yīng)中。由于ATP價格昂貴，直接在反應(yīng)過程中添加ATP從經(jīng)濟(jì)角度考慮是不允許的。因此，ATP再生系統(tǒng)[1]是提高生物合成酶反應(yīng)經(jīng)濟(jì)性的一個有效措施。文獻(xiàn)已報道多種酶可以用于ATP再生，例如，丙酮酸激酶、乙酸激酶和多聚磷酸鹽激酶 (PPK)等[2]。其中，PPK由于其底物多聚磷酸鹽 (polyP) 廉價易得[3]，廣泛應(yīng)用于ATP再生。基于PPK的ATP再生系統(tǒng)已用于多種高附加值化學(xué)品的合成，如D-氨基酸二肽[4]、甘油三磷酸[5]和D-木酮糖-5-磷酸[6]等。

L-茶氨酸是一種茶葉中的游離氨基酸，決定茶葉的風(fēng)味和品質(zhì)。其具有放松減壓、提高學(xué)習(xí)能力和抗腫瘤等多種重要的生理功能[7]，因此廣泛應(yīng)用于食品、保健品及醫(yī)藥行業(yè)。γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS) 由于其對乙胺的高活性，可用于L-茶氨酸的合成[8-9]。然而，該反應(yīng)需要ATP的參與。因此，本研究構(gòu)建了共表達(dá)PPK和GMAS的重組菌株，并將其應(yīng)用于L-茶氨酸的合成，路線如圖1所示。通過共表達(dá)PPK和GMAS，有效實現(xiàn)了基于PPK的ATP再生系統(tǒng)在合成L-茶氨酸中的應(yīng)用，也為L-茶氨酸的生物合成提供了新的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌 (Escherichia coli) Top10、BL21 (DE3)與表達(dá)載體pETDuet-1、pET-21a (+) 為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶購于Thermo公司；TaqDNA聚合酶、Primer STARTMDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于寶生物工程 (大連) 有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購于天根生化科技 (北京)有限公司；L-茶氨酸和γ-谷氨酰羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma-Aldrich公司；ATP和ADP購于北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 共表達(dá)重組載體的構(gòu)建

編碼PPK的基因ppk(來源于類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides，GenBank登錄號：GZ485151)委托華大基因合成，并進(jìn)行密碼子優(yōu)化以適合在E. coli中外源表達(dá)。基因的兩端分別添加NcoⅠ和SalⅠ酶切位點。用NcoⅠ/SalⅠ雙酶切，將膠回收后的基因片段與同樣酶切的pETDuet-1連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-ppk。編碼GMAS的基因gmas(來源于噬甲基菌Methylovorus mays，GenBank登錄號：AB333782) 同樣由華大基因合成并進(jìn)行密碼子優(yōu)化，基因兩端分別添加NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點。用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切后克隆入pETDuet-ppk中，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ppk+gmas。

圖1 偶聯(lián)ATP再生酶法合成L-茶氨酸Fig. 1 Enzymatic synthesis of L-theanine coupled with ATP regeneration.

以pETDuet-ppk為模板，使用引物PPK-F和PPK-R (表1) 擴增ppk基因，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化并用NdeⅠ/SalⅠ雙酶切后克隆入pET-21a (+) 中以構(gòu)建重組質(zhì)粒pET21a-ppk。使用引物GMAS-F和GMAS-R (表1)，從pETDuet-ppk+gmas擴增gmas基因，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用Hind Ⅲ消化后，將gmas基因片段插入pET21a-ppk中ppk基因的下游，構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒pET21a-ppk+gmas。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)及酶活測定

將構(gòu)建成功的共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliBL21 (DE3) 中，挑取轉(zhuǎn)化子接種到含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物以1%的接種量轉(zhuǎn)接入另一搖瓶中培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8，加入IPTG誘導(dǎo)過夜，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白表達(dá)情況。

誘導(dǎo)完成后8 000 r/min離心收集菌體，用無菌水洗滌一次，按10 mL/g濕菌體的比例加入20 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 8.0) 重懸，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。將上清液凍干，獲得重組蛋白的粗酶粉并進(jìn)行酶活測定，GMAS和PPK的酶活測定方法分別參照文獻(xiàn)[8]和[4]。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.2.3 雙酶共表達(dá)合成L-茶氨酸

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：200 mmol/L谷氨酸鈉、200 mmol/L乙胺鹽酸鹽、5 mmol/L ATP、150 mmol/L MgCl2·6H2O、75 mmol/L六偏磷酸鈉和10 mL咪唑緩沖液 (75 mmol/L，pH 8.0)。用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)pH至7.0，加入5 g/L GMAS-PPK粗酶粉，于30 ℃反應(yīng)。

1.2.4 HPLC測定L-茶氨酸含量

反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)-茶氨酸使用HPLC檢測。HPLC檢測條件：色譜柱為Astec chirobiotic?TAG (250 mm× 4.6 mm×5 μm)，柱溫30 ℃，以醋酸銨緩沖液(5 mmol/L，pH 6.0) 與甲醇 (25∶75，V∶V) 為流動相，流速為0.8 mL/min，等梯度洗脫，紫外檢測器，檢測波長為215 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ppk+gmas的構(gòu)建

將合成的ppk基因插入pETDuet-1載體的第一個多克隆位點，得到重組質(zhì)粒pETDuet-ppk。NcoⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2A所示，酶切產(chǎn)生分子量與ppk基因大小一致的條帶。合成的gmas基因插入pETDuet-ppk中的第2個多克隆位點，獲得PPK與GMAS的共表達(dá)質(zhì)粒pETDuet-ppk+gmas，其中每個基因處于獨立的T7啟動子控制下。用NcoⅠ/SalⅠ/XhoⅠ三酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果見圖2B。酶切產(chǎn)生三條帶，分子量最小的為ppk片段，分子量約1 500 bp的為含有T7啟動子的gmas片段。經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒由華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果與合成序列一致，表明構(gòu)建成功。

2.2 共表達(dá)質(zhì)粒pET21a-ppk+gmas的構(gòu)建

用末端分別含有NdeⅠ和SalⅠ酶切位點的引物擴增ppk基因，并插入pET-21a(+) 中，得到重組質(zhì)粒pET21a-ppk，NdeⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3A所示，其中分子量較小的條帶為ppk基因。PCR擴增gmas基因，其中在5′引物的上游序列中添加核糖體結(jié)合位點序列。將得到的gmas片段插入ppk的下游，獲得另一共表達(dá)質(zhì)粒pET21a-ppk+gmas，其中ppk與gmas基因處于同一啟動子控制下。用NdeⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果見圖3B。除載體條帶外，酶切產(chǎn)生另外兩條較小的帶，其分子量分別與gmas和ppk基因大小相符。經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒同樣進(jìn)行測序驗證，經(jīng)比對無突變，表明構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的表達(dá)及酶活測定

將兩種共表達(dá)重組質(zhì)粒pETDuet-ppk+gmas和pET21a-ppk+gmas分別轉(zhuǎn)入BL21 (DE3) 中，得到重組菌株TPG和APG。將TPG和APG分別用終濃度0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mmol/L的IPTG于20 ℃誘導(dǎo)過夜，電泳檢測蛋白表達(dá)。結(jié)果表明誘導(dǎo)后GMAS和PPK在兩個重組菌株中均成功過表達(dá)，并且大部分目的蛋白存在于上清液中；對于各個IPTG誘導(dǎo)濃度，蛋白的表達(dá)水平無明顯差異。其中，在TPG的表達(dá)產(chǎn)物中，存在大量GMAS，但僅微量的PPK；與TPG相比，APG中GMAS的表達(dá)量明顯降低，而PPK的量增加。同時，在0.1 mmol/L IPTG下考察了不同誘導(dǎo)溫度 (20 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃)對目的蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明20 ℃時重組蛋白的可溶性表達(dá)最好。0.1 mmol/L IPTG于20 ℃誘導(dǎo)過夜后蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖4。

圖2 重組質(zhì)粒pETDuet-ppk (A) 和pETDuet-ppk+gmas (B) 的酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant plasmids. (A) Identification of pETDuet-ppk. M: DNA marker; 1: digestion of plasmid pETDuet-ppk byNcoⅠ/SalⅠ; 2: recombinant plasmid pETDuet-ppk. (B) Identification of pETDuet-ppk+gmas. M: DNA marker; 1: recombinant plasmid pETDuet-ppk+gmas; 2: digestion of plasmid pETDuet-ppk+gmas byNcoⅠ/SalⅠ/XhoⅠ.

圖3 重組質(zhì)粒pET21a-ppk (A) 和pET21a-ppk+gmas (B) 的酶切鑒定Fig. 3 Identification of recombinant plasmids. (A) Identification of pET21a-ppk. M: DNA marker; 1: digestion of plasmid pET21a-ppk byNdeⅠ/SalⅠ; 2: recombinant plasmid pET21a-ppk. (B) Identification of pET21a-ppk+gmas. M: DNA marker; 1: digestion of plasmid pET21a-ppk+gmas byNdeⅠ/Hind Ⅲ; 2: recombinant plasmid pET21a-ppk+gmas.

用終濃度0.1 mmol/L的IPTG于20 ℃誘導(dǎo)過夜后，離心收集TPG和APG菌體，重懸后超聲破碎。4 ℃離心細(xì)胞裂解液，將上清凍干，得到GMAS-PPK粗酶粉。對兩種粗酶粉進(jìn)行酶活測定，從TPG和APG制備的GMAS-PPK粗酶粉的GMAS酶活分別為1.25 U/mg和0.51 U/mg，PPK酶活分別為0.14 U/mg和0.34 U/mg。

2.4 共表達(dá)GMAS-PPK催化活性比較

使用相同量的來自TPG和APG的GMAS-PPK粗酶粉合成L-茶氨酸，結(jié)果如圖5所示，6.5 h后L-茶氨酸的產(chǎn)率分別達(dá)到34.1%和47.9%。與APG相比，來自TPG的GMAS-PPK所催化反應(yīng)的初始速率明顯降低。因此，選用來自APG的GMAS-PPK進(jìn)行L-茶氨酸合成反應(yīng)研究。

圖4 TPG和APG裂解物的SDS-PAGE分析 (A：TPG表達(dá)產(chǎn)物；B：APG表達(dá)產(chǎn)物)Fig. 4. SDS-PAGE analysis of the TPG and APG lysate. (A) TPG expression products. M: protein marker; 1: control ofE. coliBL21(DE3) (pETDuet-1) after induction; 2: control of TPG which is not induced; 3: TPG after induction; 4: supernate of TPG after induction; 5: precipitate of TPG after induction. (B) APG expression products. M: protein marker; 1: control ofE. coliBL21(DE3) (pET-21a(+)) after induction; 2: APG after induction; 3: control of APG which is not induced; 4: supernate of APG after induction; 5: precipitate of APG after induction.

圖5 來自TPG和APG的GMAS-PPK催化活性比較Fig. 5 Comparison of catalytic activity of GMAS-PPK from TPG and APG. The reaction was carried out with the standard reaction using GMAS-PPK from TPG or APG. The concentration of L-theanine was determined by HPLC at different time.

2.5 共表達(dá)GMAS-PPK用于合成L-茶氨酸

使用來自APG的GMAS-PPK在不同溫度下或不同pH下合成L-茶氨酸，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適反應(yīng)pH為7.0-7.5。

在上述最優(yōu)反應(yīng)溫度和pH下，于200 mL反應(yīng)體系中合成L-茶氨酸。以200 mmol/L L-谷氨酸鈉和200 mmol/L乙胺鹽酸鹽為底物，偶聯(lián)以六偏磷酸鈉為磷酸供體的ATP再生體系，使用共表達(dá)的GMAS-PPK作催化劑，反應(yīng)過程中使用2 mol/L NaOH將反應(yīng)pH維持到7.0，反應(yīng)進(jìn)程如圖7所示。在最初6 h內(nèi)，反應(yīng)速度較快，隨后反應(yīng)速度變緩。在24 h后，L-茶氨酸的摩爾產(chǎn)率可達(dá)86.0%，含量為26.8 g/L。

3 討論

在ATP作為能量供體的酶催化反應(yīng)中，如何高效且低成本地提供ATP循環(huán)再生是需要解決的主要問題[10]。本研究構(gòu)建了共表達(dá)PPK和GMAS的重組菌株，并使用從其制備的GMAS-PPK粗酶粉催化反應(yīng)，建立了一個雙酶偶聯(lián)的催化系統(tǒng)，可在催化量ATP的存在下實現(xiàn)L-茶氨酸的高效合成。

圖6 溫度和pH對GMAS-PPK催化合成L-茶氨酸的影響(A：溫度的影響；B：pH的影響)Fig. 6 Effect of temperature and pH on the production of L-theanine catalyzed by GMAS-PPK. The reaction was carried out with the standard reaction at various temperatures (A) and pHs (B). The concentration of L-theanine was determined by HPLC after 24 h.

圖7 雙酶偶聯(lián)合成L-茶氨酸反應(yīng)進(jìn)程Fig. 7 Time course of the dual-enzyme coupled synthesis of L-theanine.

在本研究中將gmas和ppk基因分別同時插入pETDuet-1和pET-21a(+)中，獲得兩個共表達(dá)菌株TPG和APG。在兩個重組菌株中GMAS和PPK均成功地以可溶性形式表達(dá)。然而，在TPG的表達(dá)產(chǎn)物中GMAS的量遠(yuǎn)大于PPK。在之前的研究中，當(dāng)分別在E. coli中重組表達(dá)時，GMAS的表達(dá)水平明顯高于PPK，說明GMAS可能更適應(yīng)在E. coli中外源表達(dá)。因此，當(dāng)gmas和ppk在各自獨立的啟動子控制下在E. coli中共表達(dá)時，宿主會優(yōu)先合成GMAS。而將gmas基因插入pET21a-ppk中與ppk共用一個啟動子時，由于遠(yuǎn)離啟動子，GMAS的表達(dá)量大大降低，同時PPK的表達(dá)水平明顯上升。相應(yīng)地，TPG中GMAS的活性比APG中高約1倍，而PPK活性比APG低60%。由于GMAS與PPK活性的失調(diào)，當(dāng)將來自TPG的GMAS-PPK用作催化劑時，ATP再生成為限速步驟，導(dǎo)致其催化合成L-茶氨酸的能力降低。這說明當(dāng)共表達(dá)PPK和GMAS用于L-茶氨酸合成時，重組菌株APG要優(yōu)于TPG。

當(dāng)將來自APG的GMAS-PPK用于L-茶氨酸合成時，最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適pH為7.0-7.5，反應(yīng)條件溫和。在最適反應(yīng)條件下，底物L(fēng)-谷氨酸鈉濃度為200 mmol/L時，反應(yīng)混合物中加入約為底物初始量四十分之一的ATP即可使L-茶氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%以上；反應(yīng)中ATP循環(huán)了約35次。因此，通過酶法ATP再生，反應(yīng)體系中ATP的量大大降低。

除PPK之外，文獻(xiàn)[2]中還報道了基于丙酮酸激酶或乙酸激酶的ATP再生系統(tǒng)。然而，丙酮酸激酶所用磷酸供體為磷酸烯醇式丙酮酸，其價格昂貴，不易保存；此外，產(chǎn)物丙酮酸累積后會對丙酮酸激酶產(chǎn)生抑制作用。乙酸激酶催化乙酰磷酸和ADP生成乙酸和ATP，乙酰磷酸不易市售獲得，因而限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的使用。與之相比，本研究中使用穩(wěn)定性好且價格便宜的六偏磷酸鈉作為磷酸供體有效實現(xiàn)了ATP的再生，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

在文獻(xiàn)報道的利用L-谷氨酰胺酶 (GLS)[11-12]和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 (GGT)[13-16]催化合成L-茶氨酸的反應(yīng)體系中，需要以價格較昂貴的L-谷氨酰胺(70-100元/kg)為底物，還需要添加大大過量的乙胺(多達(dá)10倍) 防止L-谷氨酰胺水解。另外，此類反應(yīng)體系一般是在堿性條件下進(jìn)行，在工業(yè)生產(chǎn)中會增加設(shè)備維護(hù)的成本。相比之下，雖然本研究中需要添加少量ATP (5 mmol/L)，但是該反應(yīng)以廉價的L-谷氨酸鈉 (15-30元/kg) 為原料，無需考慮L-谷氨酰胺水解帶來的副產(chǎn)物問題。另外，反應(yīng)中只需要等當(dāng)量的乙胺鹽酸鹽，大大降低了其用量。此外，該反應(yīng)在中性條件下進(jìn)行，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了便利條件。有關(guān)L-茶氨酸酶法合成途徑的具體參數(shù)見表2。

為了提高該雙酶偶聯(lián)系統(tǒng)的催化效率，需要進(jìn)一步改造GMAS和PPK，以期提高兩種酶在同一菌株中的表達(dá)量和酶活，并進(jìn)一步增加合成L-茶氨酸的底物濃度和產(chǎn)率。

表2 酶法合成L-茶氨酸方法的比較Table 2 Comparison of production conditions and yields with enzymes used in L-theanine production.

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Construction of recombinant strains co-expressing PPK and GMAS for the synthesis of L-theanine

Yuan Li＊, Shan Liu＊, and Jun Zhu
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

Recombinant strains expressing enzymes for ATP regeneration and L-theanine production were constructed and used for the synthesis of L-theanine. Theppkgene encoding polyphosphate kinase (PPK) fromRhodobacter sphaeroidesandgmasgene encoding γ-glutamylmethylamide synthetase (GMAS) fromMethylovorus mayswere synthesized, and two recombinant plasmids, pETDuet-ppk+gmas and pET21a-ppk+gmas were constructed for co-expression of PPK and GMAS inEscherichia coliBL21(DE3). SDS-PAGE analysis showed that PPK and GMAS were overexpressed in soluble form in both recombinant strains. GMAS-PPK obtained from the recombinant strain containing pET21a-ppk+gmas was more efficient to synthesize L-theanine. After 24 h at 37 ℃ and pH at 7.0, 86.0% yield of L-theanine was achieved with catalytic amount of ATP. This study extends the application of enzymatic ATP regeneration system. In addition, it provides an efficient method for the biosynthesis of L-theanine.

ATP regeneration, γ-glutamylmethylamide synthetase, polyphosphate kinase, L-theanine, co-expression, dual-enzyme coupled reaction

Jun Zhu. Tel/Fax: +86-22-24828771; E-mail: zhu_j@tib.cas.cn

Received:June 2, 2016;Accepted:July 8, 2016

Supported by:Science and Technology Projects of Tianjin (No. 14ZCZDSY00064).

*These authors contributed equally to this study.

天津市科技計劃項目 (No. 14ZCZDSY00064) 資助。