德欽中蜂百花蜜的理化指標(biāo)及揮發(fā)性成分分析

陳夢迪1,3馬迎賓1,3董霞1,2黃艾祥2提布4王傳正4

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；4德欽縣品吉高原生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，德欽674503)

國內(nèi)外關(guān)于單花蜜的研究報(bào)道很多，然而對于百花蜜的研究報(bào)道并不多見。本研究以德欽中蜂百花蜜為主要研究對象，參照國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的方法測定理化指標(biāo)，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對其揮發(fā)性成分的種類和含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明：5個(gè)中蜂百花蜜樣的10個(gè)理化指標(biāo)檢測值均符合我國蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)GB 18796-2005的要求；通過對5個(gè)蜜樣的離子圖譜進(jìn)行檢索分析，共確定130種化合物，5個(gè)蜜樣雖為同一時(shí)段同一地區(qū)采集，但其揮發(fā)性成分存在較大差異；并發(fā)現(xiàn)異辛酸在德欽百花蜜中為主要揮發(fā)性成分,間乙酰氨基苯酚可能為德欽百花蜜的特有揮發(fā)成分。本研究旨在評價(jià)德欽中蜂百花蜂蜜的質(zhì)量和營養(yǎng)價(jià)值以及為百花蜂蜜的研究提供真實(shí)的科學(xué)依據(jù)，為當(dāng)?shù)胤洚a(chǎn)品的開發(fā)提供一定的幫助。

中蜂；百花蜜；理化成分；揮發(fā)性成分；固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

德欽縣是云南省迪慶藏族自治州下轄縣之一，位置處于云南省西北部橫斷山脈地段，滇、川、藏三?。▍^(qū)）結(jié)合部。獨(dú)特的地理位置使其境內(nèi)立體氣候明顯，蜜源植物資源極為豐富，為養(yǎng)蜂提供了理想的天然采花場所，很適合養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展。該地區(qū)多為野生蜜源植物，中蜂飼養(yǎng)也是采用最為原始的方式，該區(qū)域在保持蜂產(chǎn)品的天然無污染方面具有無可比擬的優(yōu)勢，是全國少有的生產(chǎn)高品質(zhì)優(yōu)良中蜂蜂產(chǎn)品的基地[1]，然而對于本地區(qū)產(chǎn)品的研究還未見報(bào)道。

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而貯存在巢脾里的天然甜物質(zhì)[2]。根據(jù)蜜蜂所采集蜜源植物的不同，把蜂蜜分為單花蜜和雜花蜜，單花蜜則根據(jù)采集的主要蜜源植物命名，雜花蜜又稱為百花蜜。蜂蜜所含成分較為復(fù)雜，即使同一地區(qū)來源或同一品種的蜂蜜，受地理環(huán)境、蜜源植物、采集蜂種等多種因素影響，使其成分也會(huì)存在差異[3]。蜂蜜中的化合物主要包括各種糖類物質(zhì)、水分、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、酚酸化合物、羥甲基糠醛以及揮發(fā)性物質(zhì)等,其中主要成分是水分、還原糖（葡萄糖和果糖）、蔗糖淀粉酶和酚類化合物等[4，5]。對于蜂蜜揮發(fā)性成分的研究已經(jīng)有很多年了，揮發(fā)性成分的差異是造就蜂蜜風(fēng)味的主要原因。然而揮發(fā)性化學(xué)成分的組成與蜜源植物的起源以及蜜蜂的覓食習(xí)慣存在很大關(guān)聯(lián)，從不同類型的蜂蜜中檢測出來并以確認(rèn)的揮發(fā)性化合物已超過600多種[6，7]。目前尚有多種蜂蜜類型未被研究，預(yù)計(jì)還會(huì)有大量新的揮發(fā)性化合物在將來被確定。本研究通過測定德欽百花蜂蜜的理化指標(biāo)以及揮發(fā)性化合物成分,探究百花蜜與單花蜜成分差異，評價(jià)德欽中蜂百花蜂蜜的質(zhì)量和營養(yǎng)價(jià)值以及為百花蜂蜜的研究提供真實(shí)的科學(xué)依據(jù)，為當(dāng)?shù)胤洚a(chǎn)品的開發(fā)提供一定的幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與實(shí)劑

實(shí)驗(yàn)材料：5個(gè)中蜂百花蜜樣品（德欽縣霞若鄉(xiāng)，2015年5月份）；

主要實(shí)劑：氫氧化鈉、硫酸銅、酒石硫酸鈉、葡萄糖等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

臺(tái)式pH酸度計(jì)、手持糖量計(jì)、電子天平、分光光度計(jì)、箱式電阻爐、多頭磁力加熱攪拌器、恒溫水浴鍋、7890A/5975C氣/質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent，美國）；色譜柱：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25um，Agilent，美國）固相微萃取頭（75μm Carboxen-PDMS，Supelco，美國）等。

1.3實(shí)驗(yàn)與方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

在此部分實(shí)驗(yàn)中，共測定10個(gè)理化指標(biāo)，包括pH值、水分、總酸度、灰分、還原糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉酶活性和羥甲基糠醛，其測定方法主要參考進(jìn)出口蜂蜜檢驗(yàn)方法(SN/T 0852-2000)[4]和劉意秋主編的蜂學(xué)專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)教程[5]。

1.3.2 揮發(fā)性成分測定

樣品萃?。喝悠? g于20 ml頂空瓶中。將頂空瓶放置于80℃水浴中，用固相微萃取頭置于頂空瓶中進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為30 min,之后將固相微萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)樣，時(shí)間為2 min，隨后經(jīng)氣相色譜分離后用質(zhì)譜鑒定。

色譜條件：色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細(xì)管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為280℃，程序升溫，起始溫度50℃，保持2 min，以5℃/min升溫至140℃，保持1 min，以10℃/min升溫至280℃，保持10 min，高純氦(99.999%)，流速為1ml/min，分流比為10∶1。

質(zhì)譜條件：GC/MS接口溫度為280℃，離子源為EI源，電子能量為70eV，離子源溫度為250℃，掃描范圍為29～350 amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 5個(gè)德欽百花蜜樣理化指標(biāo)測定結(jié)果

5個(gè)德欽中蜂百花蜜的10個(gè)理化指標(biāo)測定結(jié)果見表1所示。實(shí)驗(yàn)測得5個(gè)蜜樣的pH值最大為5.32，最小為4.83，與前人研究單花蜜的pH值多為弱酸性這一結(jié)論相符。蜂蜜中的水分含量是評價(jià)蜂蜜質(zhì)量的一個(gè)重用標(biāo)準(zhǔn)，水分含量的多少常被用于評價(jià)蜂蜜是否達(dá)到自然成熟[2，3]。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定水分含量低于20%的蜂蜜為優(yōu)級(jí)蜜，水分含量不高于24%的蜂蜜為合格蜜，結(jié)果表明，5種蜂蜜水分含量均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，1號(hào)蜜樣和2號(hào)蜜樣已達(dá)到優(yōu)級(jí)蜜的規(guī)格。蜂蜜的灰分含量受多種因素影響，且與蜜樣中的蛋白含量及其礦物元素含量相關(guān)，實(shí)驗(yàn)中測得5種蜜樣的灰分含量在0.18～0.42%范圍內(nèi)，均值為0.27%，結(jié)果表明，雖然5個(gè)蜜樣均采于德欽縣霞若鄉(xiāng)，但也受小環(huán)境的影響存在差異。5種百花蜜的總酸度存在差異，但差異不顯著，25.05～32.38 meq/kg,平均值為28.52 meq/kg，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但與前人研究的單花蜜的酸度值相比明顯較低，也已證實(shí)蜜源植物對酸度值有較大的的影響，并且與地理?xiàng)l件、采集過程以及存儲(chǔ)條件有關(guān)。

不管是單花蜜還是百花蜜，蜂蜜的主要成分均是糖類物質(zhì)[6]，本實(shí)驗(yàn)測得5個(gè)蜜樣的還原糖（葡萄糖和果糖）和蔗糖含量見表1。5個(gè)樣品的還原糖含量均超過70%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)級(jí)蜜的要求，其中還原糖含量最高的是果糖，這與前人研究單花蜜的結(jié)論相符。葡萄糖、果糖、蔗糖三者在5個(gè)蜜樣的含量分別是27.63～33.65%、41.36～44.21%、2.53～3.79%。一般情況下，成熟蜂蜜的蔗糖含量不應(yīng)過高，如果過高說明蜂蜜還未達(dá)到成熟蜜就被收獲，蔗糖還沒有經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為還原糖，5個(gè)樣品蔗糖含量均符合標(biāo)準(zhǔn)，由此可判斷為成熟蜜。

蜂蜜中有很多活性酶，然而淀粉酶是穩(wěn)定性較差的一種酶，有研究表明，淀粉酶活性可作為判斷蜂蜜的新鮮程度、是否摻假以及是否經(jīng)過熱處理等加工的依據(jù)[10]。國際法和中國食品法規(guī)定，淀粉酶活性最小值是8［ml/(g.h)］，本實(shí)驗(yàn)測得5個(gè)百花蜜樣的淀粉酶值在10.95～21.42［ml/(g.h)］之間，均值為16.28［ml/(g.h)］。羥甲基糠醛是蜂蜜中的有害成分[10]，它的存在會(huì)導(dǎo)致蜂蜜的口感變差,嚴(yán)重影響蜂蜜的感官質(zhì)量和市場價(jià)值。新鮮蜂蜜中羥甲基糠醛含量不應(yīng)超過40mg/kg,德欽百花蜜樣中羥甲基糠醛的含量在10.43～29.50mg/kg之間，均值為16.53mg/kg，符合國家標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)級(jí)蜜的要求。

2.2德欽百花蜜揮發(fā)性成分分析

2.2.1 5種百花蜜樣的離子圖譜比較

本實(shí)驗(yàn)通過氣相色譜-質(zhì)譜法對德欽5個(gè)中蜂百花蜜樣的揮發(fā)性香味成分進(jìn)行了分析。圖1為5種蜂蜜香味成分氣相色譜-質(zhì)譜分析的離子圖譜，對色譜圖進(jìn)行積分，峰位置以色譜峰最高點(diǎn)確定，應(yīng)用NIST05和WILEY275譜庫進(jìn)行物質(zhì)檢索定性，用峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的相對含量見表2所示。

2.2.2 5種百花蜜樣揮發(fā)性成分分析

通過對5種德欽百花蜜的離子圖譜進(jìn)行檢索分析，以及資料查閱[6-9,11-15]共確定了130個(gè)化合物，5種蜜樣分別鑒定出53種、65種、39種、37種、40種，分別占總峰面積的91.93%、85.01%、98.56%、90.37%、93.79%，具體揮發(fā)性成分見表2所示。

德欽中蜂百花蜜與前人研究過的單花蜜樣品揮發(fā)性成分[11-13]進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各蜂蜜揮發(fā)性化學(xué)成分差異很大，即使同一季節(jié)同一地區(qū)采集的百花蜜其揮發(fā)性化學(xué)成分在種類和含量上也有較大的差異；如若參照有機(jī)化學(xué)的分類方法，按官能團(tuán)將各蜂蜜樣品間所含揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)物質(zhì)種類并沒有太大差別，其中主要包括醇、醛、酯、酮、酸、酚、雜環(huán)以及各種烴類，但是各類物質(zhì)間所呈現(xiàn)的味閾值不同，致使不同蜂蜜風(fēng)味存在明顯的差異[8,9]。130種揮發(fā)性成分中醇類和烷烴類種類最多，這一結(jié)論與前人研究單花蜜的揮發(fā)性成分結(jié)果相吻合。張麗珍等[12]分析了野桂花蜂蜜的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)醇類在野桂花蜂蜜、油菜蜂蜜、有機(jī)洋槐蜂蜜三種蜂蜜中醇類幾乎占據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)比例的一半，由此可見，醇類物質(zhì)在蜂蜜風(fēng)味形成中起著重要作用，至于作用機(jī)制還有待研究發(fā)現(xiàn)。其次，含量較高的就是脂類和醛類，兩者都是食品中相當(dāng)重要的香味物質(zhì)，并且其風(fēng)味閾值與醇類相比一般都很低，即使含量較低時(shí)，也可使食品產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味[7]。

圖1 5種德欽白花蜂蜜香味成分的氣相色譜-質(zhì)譜離子流圖

表1 5個(gè)蜜樣的理化指標(biāo)及參數(shù)

由表2可知，5個(gè)蜜樣雖然揮發(fā)性成分差異很大，但也有很多共同化合物存在。乙醇、乙酸、己酸、異辛酸、辛酸、十二烷、十三烷、三醋酸甘油酯、十四烷在5個(gè)蜂蜜樣品的揮發(fā)性成分中都存在，辛酸在醫(yī)學(xué)上具有抗真菌的作用[16]。1,1-二甲基硅二醇、糠醇、萘乙酸、十一烷、苯乙醛、壬酸、十五烷、二十烷、二十一烷在4個(gè)樣品中被檢出?？啡?,5-呋喃二甲醛等14種揮發(fā)性成分在3個(gè)樣品中被檢出。1號(hào)、2號(hào)和4號(hào)樣品中含量最高的均是異辛酸，2號(hào)和5號(hào)兩個(gè)樣品中異辛酸的含量雖然不是最高，但也達(dá)到8.11%和17.91%，可見異辛酸在德欽百花蜜中為主要揮發(fā)性成分，是否能夠作為該地區(qū)蜜源標(biāo)記物之一還有待后期研究。值得注意的是，3號(hào)樣品中含量最高的揮發(fā)性化合物是5-羥甲基糠醛，含量高達(dá)44.99%。間醋氨酚又名間乙酰氨基苯酚，在3個(gè)樣品中被檢測出，然而任佳淼等人[13]對17種單花蜜的揮發(fā)性成分研究，李成斌等[14]分析研究的8種蜂蜜（紫云英蜜、苜蓿蜜、龍眼蜜、洋槐蜜、藿香蜜、枸杞蜜、油菜蜜和瑞苓草蜜）和粟有志等[15]分析新疆地區(qū)的油菜蜜、沙棗蜜、葵花蜜、棉花蜜中并未檢測到此種化合物，本實(shí)驗(yàn)研究對象為德欽百花蜜，間乙酰氨基苯酚是否為百花蜜的特有成分還有待證實(shí)。

表2 5個(gè)百花蜜樣揮發(fā)性成分及含量

3 結(jié)論

本研究測定了德欽5個(gè)中蜂百花蜜樣的10個(gè)理化指標(biāo)，包括pH值、水分、總酸度、灰分、還原糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉酶活性和羥甲基糠醛（HMF）,所有的理化指標(biāo)檢測值均符合我國蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)GB 18796-2005的要求。

通過對5種德欽中蜂百花蜜的離子圖譜進(jìn)行檢索分析，共確定了130個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性化合成分存在明顯差異。雖然蜜樣為同一縣區(qū)同一時(shí)間采集，由于德欽縣霞若鄉(xiāng)地質(zhì)特征復(fù)雜，蜜源植物豐富，還有很多未被開發(fā)利用的野生蜜源，從而造就了蜂蜜之間揮發(fā)性成分存在很大的差異，這也充分證明蜜源是決定蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)組成的主要因素之一。通過研究發(fā)現(xiàn)，異辛酸在德欽中蜂百花蜜中為主要揮發(fā)性成分，是否能夠作為該地區(qū)蜜源標(biāo)記物之一還有待后期研究。間乙酰氨基苯酚是否為百花蜜的特有成分，這還需要采集更多的百花蜜進(jìn)行分析確證。

本研究通過測定德欽中蜂百花蜂蜜的理化指標(biāo)以及揮發(fā)性化合物成分發(fā)現(xiàn)成熟百花蜜與成熟單花蜜在理化指標(biāo)上并沒有太大差異，揮發(fā)性成分因蜜源植物、地理環(huán)境等因素的影響存在較大差異。德欽中蜂百花蜜其他指標(biāo)及成分還有待進(jìn)一步研究，為當(dāng)?shù)胤洚a(chǎn)品開發(fā)提供堅(jiān)實(shí)可靠的依據(jù)。

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Physicochemical characterization and Volatile components of multifloral, honey of Apis cerana cerana in Deqin

Chen Mengdi1，3，Ma Yingbin1，3，Dong Xia1，2，Huang Aixiang2，Ti Bu4，Wang Chuangzheng4
(1 Eastern Bee Research Institute,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;2 College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;3 College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;4 Deqin County Pinji Plateau Ecological Agriculture Limited Liability Company,Deqin 674503)

In spite of lots of research about monofloral honry at home and abroad,the reports on multifloral honey are seldom.The study assessed multifloral honey of Apis cerana cerana grown in Deqin and determinated the physical and chemical indicators base on interrelated national standards.Afterward,the volatile components of this honey were analyzed with solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry(SPME-GC-MS).The results showed that the ten physical and chemical indicators of five kinds of multifloral honey consistented with national standards(GB 18796-2005).We identified 130 chemical compounds by searching and analyzing the Ion spectrum from the five kinds of multifloral honey.Although the five honey samples were gathered in the same time in the same area, there was great difference in volatile components of these honey samples.And found that the main volatile components was 2-ethyl-hexanoic acid in the multifloral honey of Apis cerana cerana grown in Deqin.Moreover,metacetamol might be the specific volatile components in this honey.This paper is aimed to evaluate the quality and nutritional value of multifloral honey of Apis cerana cerana grown in Deqin,and provide some scientific basis for further studies on multifloral flowers honey.This would be helpful for the development of local bee products.

Apis cerana cerana；Multifloral honey;physicochemical characterization;volatile compounds;SPMEGC-MS

云南省高校食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金

陳夢迪（1988-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品質(zhì)量控制及揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)分析。

董霞（1965-），教授，E-mail：dxia0709@126.com