劉方，孟麗華，楊淑英，時(shí)彥民*，孟蝶，徐毅

(1.濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測站，山東 濟(jì)寧272000； 2.任城區(qū)水產(chǎn)局，山東 濟(jì)寧 272000；3. 北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站魚病科,北京100001)

黃顙魚肌肉腐爛病研究及治療技術(shù)初探

劉方1，孟麗華1，楊淑英2，時(shí)彥民1*，孟蝶3，徐毅1

(1.濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測站，山東 濟(jì)寧272000； 2.任城區(qū)水產(chǎn)局，山東 濟(jì)寧 272000；3. 北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站魚病科,北京100001)

以肌肉腐爛的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)為研究對象，從發(fā)病魚體的肝、脾中分離出了一株致病菌(命名為JY-03)，經(jīng)革蘭氏染色、顯微觀察、API生理生化實(shí)驗(yàn)24～48 h，最終鑒定該病原菌為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。通過感染實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)黃顙魚肌肉腐爛的致病菌為溫和氣單胞菌。對發(fā)病池塘水質(zhì)分析表明，養(yǎng)殖水體中存在大量微囊藻，加速了水體中致病菌繁殖速度，致使發(fā)病池塘中黃顙魚暴發(fā)肌肉腐爛病。藥物的治療實(shí)驗(yàn)表明，10%諾氟沙星與10%恩諾沙星分別與飼料按照1∶1 000(m/m)比例拌料，每日按照魚體重1%投喂飼料1次，兩種藥物對該病均有明顯治療效果，魚體皮膚潰爛征狀逐步消失，死亡數(shù)量顯著下降，疫病得到有效控制，用藥2周后基本治愈；同等的用藥劑量下，恩諾沙星治療效果相對更好。本研究提供了黃顙養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中肌肉腐爛病發(fā)病原因的鑒定方法和治療方案，對黃顙魚的健康養(yǎng)殖及相關(guān)研究均具有一定的參考意義。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(1):63-70]

黃顙魚；溫和氣單胞菌；API生理生化實(shí)驗(yàn)；鑒定；腐爛；治療

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)是中國江河湖泊中常見的一種小型經(jīng)濟(jì)魚類。它無肌間刺，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，廣泛受到消費(fèi)者的青睞，市場價(jià)格一直居高不下[1]。黃顙魚對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，在中國很多省、市均可養(yǎng)殖，且在國內(nèi)市場上屬中檔魚中價(jià)格較高的淡水養(yǎng)殖品種，經(jīng)濟(jì)效益較高，具有較大的發(fā)展?jié)摿?。肌肉腐爛病(潰瘍病)是魚類疾病中最常見的一種細(xì)菌性疫病，也是黃顙魚養(yǎng)殖過程中常見的疫病，但有關(guān)黃顙魚體表潰瘍病研究的報(bào)道相對較少。2013年9月25日，濟(jì)寧市某黃顙魚養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的黃顙魚暴發(fā)肌肉腐爛病，主要表現(xiàn)為嘴部、背部、尾部等處的皮膚出現(xiàn)不同程度腐爛，大批黃顙魚因病死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。本研究針對黃顙魚肌肉腐爛病原菌進(jìn)行了分離鑒定與治療技術(shù)初探，以期為黃顙養(yǎng)殖過程有效防治該疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)(Olympus Cx31)、恒溫培養(yǎng)箱(三海三發(fā)DNP-9082)、高壓滅菌鍋(上海博訊YXQ-LS-50SII)、連續(xù)注射器、4-5號無菌針頭、25#浮游生物網(wǎng)。

材料：MHA、MHB培養(yǎng)基(北京路橋)、革蘭氏染色試劑盒(北京路橋)、API20NE試劑條(法國梅里埃)、0.65%無菌生理鹽水、氧化酶試劑、魯戈試劑、恩諾沙星(北京漁經(jīng)生物技術(shù)有限公司，其恩諾沙星含量為10%)、魚菌凈(商品名，其諾氟沙星含量為10%，北京漁經(jīng)生物技術(shù)有限公司)、溫和氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(國家微生物菌種保藏中心)、沉型料(山東德海三易生物科技有限公司，顆粒直徑為2.5 mm)。

1.2 致病菌的分離和鑒定

1.2.1 池塘水體調(diào)查及病魚樣本采集

首先對發(fā)病池塘進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查，測量水溫并記錄，取5 L水樣用25#浮游生物網(wǎng)過濾濃縮至10 mL,并添加0.1 mL魯哥氏液固定，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行顯微觀察。病魚樣本由發(fā)病池塘(濟(jì)寧市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場)現(xiàn)場采集，典型癥狀的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)5尾用于解剖實(shí)驗(yàn)，經(jīng)測量體長(12±1.5)cm。

1.2.2 病魚的觀察與解剖

取具有典型病癥的發(fā)病黃顙魚，進(jìn)行解剖，對發(fā)病樣本體表特征及臟器進(jìn)行觀察。

1.2.3 細(xì)菌的分離純化

用75%酒精棉消毒體表后，無菌操作剪開其腹部，用接種環(huán)挑取脾、腹水，分別劃線于MHA瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行分離純培養(yǎng)2～3次，獲得純化的可疑致病菌JY-03，保種后于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4 鏡檢觀察

將分離純化的出的JY-03進(jìn)行革蘭染色，并在1 000倍油鏡下進(jìn)行顯微觀察[2-4]。

1.2.5 生理生化實(shí)驗(yàn)

將分離出的純培養(yǎng)株，制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，接種于API細(xì)菌分析鑒定試劑條中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過apiwebTM軟件(法國梅里埃)進(jìn)行鑒定。

1.2.6 致病菌人工感染實(shí)驗(yàn)

市場購得黃顙魚(110±10)g在水族箱暫養(yǎng)15 d，確認(rèn)健康無疫病后，作為感染實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)用魚。實(shí)驗(yàn)水族箱規(guī)格：長80 cm，寬60 cm，高70 cm。水族箱盛水90 L，水溫保持在(25±1)℃，暫養(yǎng)期間保持充氣，少量投食，每2～3天換水1次，每次換水量1/3。感染實(shí)驗(yàn)中共設(shè)有4個水族箱，每個水族箱養(yǎng)殖黃顙80尾左右，包括1個作為對照組(2號水族箱)和3個實(shí)驗(yàn)組(即1號、3號、4號水族箱)。

將無菌操作挑取培養(yǎng)24～36 h的JY-03，制成約0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，? mL菌懸液接種于100 mL MHB液體培養(yǎng)基，于28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24～36 h，取新鮮的菌液，5 000 r/min離心30 min去培養(yǎng)基，細(xì)菌沉淀用0.65%無菌生理鹽水充分的混勻，制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?。使用無菌的連續(xù)注射器注射實(shí)驗(yàn)魚背部肌肉，注射劑量為每尾0.2 mL，觀察魚體發(fā)病情況。對照組只注射0.65%無菌生理鹽水，3個實(shí)驗(yàn)組全部進(jìn)行感染注射。連續(xù)觀察7 d，觀察發(fā)病征狀。背部注射完成后如發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)魚發(fā)病，取病樣進(jìn)行解剖并進(jìn)行病原菌的再分離及鑒定。

1.2.7 發(fā)病魚體治療實(shí)驗(yàn)

取3個水族箱(1號、3號、4號)進(jìn)行發(fā)病魚體治療實(shí)驗(yàn)。將3號水族箱作為陽性對照組，即黃顙在注射致病菌發(fā)病后，不添加任何藥物，投餌料量根據(jù)魚吃食情況而定，盡量不增加水體負(fù)擔(dān)，死魚及時(shí)撈出，不采取其他治療措施。1號水族箱拌料藥物為魚菌凈(含10%諾氟沙星)，4號水族箱拌料藥物為恩諾沙星(含量10%)，拌料方法按照每1 kg飼料中添加1 g實(shí)驗(yàn)藥物，進(jìn)行充分拌勻。飼料選擇沉型料，飼料每日投喂1次，投喂量為實(shí)驗(yàn)魚總體重的1%，不可過量投喂。實(shí)驗(yàn)連續(xù)觀察14 d，每日觀察魚體康復(fù)情況，并及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。治療時(shí)間選擇實(shí)驗(yàn)魚出現(xiàn)輕微發(fā)病癥狀2 d后，開始拌料投喂。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖池塘環(huán)境調(diào)查

2013年9月25日實(shí)地調(diào)查發(fā)病養(yǎng)殖池塘，中午11時(shí)現(xiàn)場測量池塘水溫為(26±0.1) ℃，另見池塘內(nèi)大量餌料漂浮于水面，池塘內(nèi)部分黃顙魚死亡并漂浮于水面(圖1中A、B、C處均為死亡的黃顙魚)，同時(shí)池塘內(nèi)有大量藻類出現(xiàn)。水樣采集固定后經(jīng)顯微觀察，藻類以微囊藻居多(圖2E)，同時(shí)伴有裸藻出現(xiàn)(圖2F)。水體表面漂浮有魚體的糞便，顏色青綠，成條狀，經(jīng)顯微觀察為不易被消化吸收而排出體外的微囊藻。

圖1 黃顙魚養(yǎng)殖發(fā)病池塘外觀圖A、B和C：死亡的黃顙魚；D：漂浮的魚糞便。Fig.1 The appearance of pondsfarming the yellow catfishA、B and C :The yellow catfish of death. D: Floating fish feces.

圖2 發(fā)病池塘水體中漂浮藻類顯微觀察圖E:微囊藻；F:裸藻。Fig.2 Microscopic observation offloating algae in pond waterE：Microcystis;F:Euglena.

2.2 病魚的觀察與解剖

發(fā)病的黃顙魚皮膚和鰭上會出現(xiàn)了針狀小點(diǎn)的充血，病魚眼球外凸、渾濁，大部分病魚口腔周圍潰爛(圖3-1)；背部肌肉腐爛，部分病樣魚骨外漏，同時(shí)伴隨腹部膨大，鰭條、下頜、鰓蓋、腹部可見充血；剪開腹腔內(nèi)有大量清亮的液體，肝腫大變白，肝上毛細(xì)血管腫大充血，血管變大外漏明顯(圖3-2)。

圖3 發(fā)病黃顙魚的形態(tài)特征圖3-1：外觀形態(tài)；圖3-2：解剖后的腹腔。Fig.3 The morphological characteristics of the sick yellow catfishFig.3-1:Appearance shape; Fig.3-2:The abdominal cavity after dissection.

2.3 致病菌分離純化與顯微觀察

從肝、脾及以及腹水中分離得到一批形態(tài)一致的優(yōu)勢菌株(命名為JY-03)，將該菌株在MHA培養(yǎng)基上劃線并于28 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)為圓形、光滑、濕潤、半透明灰白色的小菌落(圖4-1)；經(jīng)過革蘭氏染色和油鏡顯微觀察，確定該菌為革蘭氏陰性短桿菌(圖4-2)。

圖4 致病菌分離純化及顯微觀察圖圖4-1:分離純化的菌落；圖4-2:革蘭染色后顯微鏡下菌體。Fig.4 The isolation and purification of pathogenic bacteria and microscopic observationFig.4-1: The colonies of isolation and purification; Fig.4-2:The Gram-staining bacteria in microscope.

2.4 生理生化實(shí)驗(yàn)

通過對分離的菌株JY-03進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，如圖5-1中A、B所示顯示該菌株氧化酶實(shí)驗(yàn)為陽性。根據(jù)氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用API20NE細(xì)菌分析鑒定試劑條進(jìn)行鑒定培養(yǎng)，在28 ℃培養(yǎng)24～36 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒定結(jié)果為：7177755(圖5-2)。經(jīng)apiwebTM軟件分析，確定分離的菌株JY-03為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)，軟件顯示鑒定準(zhǔn)確率(ID)達(dá)到99%，說明濟(jì)寧某養(yǎng)殖場內(nèi)黃顙魚肌肉腐爛病是由溫和氣單胞菌感染引起的，具體鑒定結(jié)果見表1。

圖5 氧化酶實(shí)驗(yàn)及API細(xì)菌鑒定結(jié)果圖5-1：A為脾中分離的菌落，B為腹水中分離的菌落，C氧化酶試劑反應(yīng)結(jié)果；圖5-2：API試劑條鑒定結(jié)果。Fig.5 The results of oxidase test and API bacteria identification Fig.5-1:A：The colonies isolated from the spleen，B：The colonies isolated from the ascites，C：The results of oxidase test; Fig.5-2:The resultsof API bacteria identification.

表1 API細(xì)菌鑒定結(jié)果

Tab.1 The results of API bacteria identification

鑒定項(xiàng)目Item分離菌株Isolatedstrain標(biāo)準(zhǔn)菌株Standardstrain鑒定項(xiàng)目Item分離菌株Isolatedstrain標(biāo)準(zhǔn)菌株Standardstrain硝酸鉀++甘露糖++吲哚產(chǎn)物++右旋甘露醇++發(fā)酵葡萄糖++乙酰葡萄糖++精氨酸利用++麥芽糖++尿素--葡萄糖酸鉀++七葉苷--羊蠟酸++明膠液化++乙二酸--半乳糖苷酶++蘋果酸++葡萄糖同化++枸櫞酸鈉++阿拉伯糖--苯乙酸--

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.5 致病菌感染實(shí)驗(yàn)

在致病菌感染實(shí)驗(yàn)中，對照組(2號水族箱)內(nèi)的黃顙魚沒有出現(xiàn)異常癥狀，吃食正常。在1號、3號、4號水族箱3個感染組中，感染2 d后，黃顙魚吃食量明顯下降，活動遲緩；背部及尾部出現(xiàn)白色腐皮(圖6)，且嘴部、鰭條充血；感染3 d后水族箱內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；感染實(shí)驗(yàn)魚7 d， 1號、3號、4號等3個水族箱實(shí)驗(yàn)魚死亡率分別達(dá)到91.50%、91.10%、90.40%，3個感染組死亡率均達(dá)到90%以上，可見該致病菌毒力較高。

圖6 致病菌感染健康黃顙魚結(jié)果Fig.6 The results of health yellow catfishinfected by pathogenic bacteria

2.6 治療實(shí)驗(yàn)

在治療實(shí)驗(yàn)中，3個水族箱內(nèi)黃顙魚隨用藥時(shí)間延長的變化情況見表2。兩種治療藥物同時(shí)治療發(fā)病的黃顙魚，在同等濃度的藥物劑量下，通過14 d的治療觀察，病情都能得到有效控制并逐步好轉(zhuǎn)，其中4號水族箱在養(yǎng)殖7 d后已經(jīng)無病魚繼續(xù)死亡；通過諾氟沙星治療的1號水族箱，病情也得到好轉(zhuǎn)和控制，但實(shí)驗(yàn)魚仍有個別死亡現(xiàn)象，在養(yǎng)殖14 d時(shí)仍有1條實(shí)驗(yàn)魚背部皮膚仍有輕微腐皮征狀。綜合比較兩種用藥方案，在同等藥物劑量下，在治療黃顙魚肌肉腐爛病選擇恩諾沙星比諾氟沙星的治療效果要明顯。如圖7-1中A所示用藥治療前，1號水族箱內(nèi)大部分黃顙魚發(fā)病，體表出現(xiàn)白色腐皮的典型癥狀；圖7-2中B所示用藥10 d治療后，1號魚缸大部分黃顙魚發(fā)病典型癥狀消失，魚體活力充沛。

表2 發(fā)病魚體隨用藥時(shí)間延長的變化情況

Tab.2 The occurrence of the sick fish with the extension of time under the drug treatment

水族箱Aquari-um養(yǎng)殖數(shù)量/尾Breedquanti-ty水溫/℃Watertemper-ature感染后發(fā)病數(shù)量/尾Morbidfishnumbersafterinfec-tion發(fā)病率/%Mor-bidity養(yǎng)殖3dCulturefor3d養(yǎng)殖7dCulturefor7d養(yǎng)殖10dCulturefor10d養(yǎng)殖14dCulturefor14d1號7025±16992.8死亡1條,其征狀表現(xiàn)為肌肉嚴(yán)重潰爛。其他皮膚潰爛較輕。死亡1條,征狀表現(xiàn)為皮膚潰爛嚴(yán)重。其他體表魚明顯好轉(zhuǎn),表現(xiàn)為體表發(fā)病面積縮小。死亡2條。大部分治療情況明顯,3條體表仍有輕微發(fā)病癥狀。1條實(shí)驗(yàn)魚背部仍有輕微腐皮征狀,其他體表發(fā)病癥狀消失,巡游正常。4號7225±17198.6死亡2條,其征狀表現(xiàn)為肌肉嚴(yán)重潰爛。其他皮膚潰爛較輕。大部分體表正常,活力充沛,腐皮明顯好轉(zhuǎn),皮膚潰爛嚴(yán)重者仍能巡游,無死亡現(xiàn)象。有1條表現(xiàn)為皮膚潰爛,其他體表發(fā)病征狀消失,巡游正常。實(shí)驗(yàn)魚發(fā)病癥狀消失,正常巡游,也無死亡現(xiàn)象發(fā)生。3號8425±17690.4死亡5尾,其征狀表現(xiàn)為肌肉嚴(yán)重潰爛。死亡70條,其癥狀表現(xiàn)為肌肉潰爛,部分嚴(yán)重者脊椎骨外漏。實(shí)驗(yàn)魚全部死亡,及時(shí)清理并消毒。無

注：1號水族箱為使用含10%諾氟沙星與飼料1∶1 000比例混合后，按照體重1%的量連續(xù)投喂黃顙魚14 d；4號水族箱為使用含10%恩諾沙星與飼料1∶1 000比例混合后，按照體重1%的量連續(xù)投喂黃顙魚14 d；3號水族箱為陽性對照對照組，按同樣的量投喂飼料，但飼料中不添加任何藥物。

圖7 藥物治療前與治療10 d后的實(shí)驗(yàn)魚體態(tài)特征對比圖7-1：藥物治療前的發(fā)病實(shí)驗(yàn)魚；圖7-2：治療10 d后的實(shí)驗(yàn)魚。Fig.7 Comparison of the experimental fish between before and after 10 d drug treatmentFig.7-1：The experimental fish before drug treatment; Fig.7-2: The experimental fish after 10 d drug treatment.

3 討論

3.1 發(fā)病原因分析

現(xiàn)場調(diào)查發(fā)病池塘，測量水溫為26 ℃，池塘周圍無樹木遮蔭，陽光直射，水深保持1.5 m，放養(yǎng)黃顙“水花”密度達(dá)到30尾/m2。發(fā)病池塘畝投放黃顙魚“水花”密度過大，早期由于“水花”體積和食量偏小對水體的種群結(jié)構(gòu)影響不是太大，但隨著黃顙魚逐漸長大，水體中的浮游動物被作為餌料而大量消滅[5]，浮游動物的缺失致使浮游植物因缺少天敵而暴發(fā)性生長。因此，該池塘內(nèi)疫病的暴發(fā)與水體內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的破壞存在密切的關(guān)系，正是由于生態(tài)系統(tǒng)的破壞，致使微囊藻大量繁殖，水華暴發(fā)。潘高山等[6]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒微囊藻培養(yǎng)液和微囊藻毒素粗提液均能促進(jìn)致病微生物中VBNC(活的不可培養(yǎng)狀態(tài))細(xì)菌與可培養(yǎng)細(xì)菌之間的狀態(tài)轉(zhuǎn)換，說明微囊藻的出現(xiàn)為水環(huán)境中細(xì)菌VBNC狀態(tài)的轉(zhuǎn)換提供了條件。本研究中水質(zhì)觀察結(jié)果顯示，水體中微囊藻大量存在，分析認(rèn)為由于微囊藻的存在致使致病菌由VBNC(活的不可培養(yǎng)狀態(tài))向可培養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行了轉(zhuǎn)換，致病菌大量繁殖使水體中病菌濃度進(jìn)一步增高，黃顙魚染病機(jī)率大大提高。另外，關(guān)于溫和氣單胞菌致病機(jī)理的文獻(xiàn)也有報(bào)道，溫和氣單胞菌對機(jī)體細(xì)胞的侵襲起始于細(xì)菌對上皮細(xì)胞的黏附，緊接著是細(xì)菌的內(nèi)化和繁殖，進(jìn)而會引起細(xì)胞的溶解和組織的損傷[7]。致病菌在侵入到機(jī)體內(nèi)之后，大量繁殖，奪取機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)，使得機(jī)體的抵抗力進(jìn)一步下降，造成更多細(xì)菌的侵入；同時(shí)大最繁殖的細(xì)菌會產(chǎn)生大量的毒力因子，破壞機(jī)體。這些毒力因子發(fā)揮毒性作用，使腸道積液分泌增多，紅細(xì)胞裂解，吞噬白細(xì)胞，損壞毛細(xì)血管，從而引起了敗血、出血，細(xì)胞毒素侵入實(shí)質(zhì)組織器官，使組織細(xì)胞溶解[8]。

3.2 溫和氣單胞菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的危害分析

溫和氣單胞菌屬于嗜溫有動力氣單胞菌，是一種典型的人、獸、魚共患病原菌，是中國養(yǎng)殖淡水魚類最常見的氣單胞菌屬的條件致病菌，具有發(fā)病率高、感染快、傳播快、死亡快的特點(diǎn)[9]。其外毒素是溫和氣單胞菌的重要致病因子之一，包括有溶血素(hemolysin)、氣溶素(aemlysin)、細(xì)胞毒性腸毒素(cytolyticenterotoxin)等[10]。近年來由溫和氣單胞菌引起的各種漁業(yè)病害報(bào)道日益增多，給中國淡水養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟(jì)損失。陳言峰等[11]報(bào)道了廣東佛山某養(yǎng)殖場內(nèi)高體革暴發(fā)體表潰爛病，經(jīng)分離鑒定致病菌為溫和氣單胞菌；張曉君等[12]報(bào)道了江蘇連云港東?？h多家漁場泥鰍大量潰爛死亡，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化及分子水平鑒定致病菌為溫和氣單胞菌；蔡完其等[13]報(bào)道了由溫和氣單胞菌引起的羅非魚出血性敗血??；劉敏等[14]報(bào)道了溫和氣單胞菌引起鯉體表潰爛?。煌跤览さ萚17]報(bào)道了溫和氣單胞菌引起的鱉紅底板病、紅脖子病；陳曉風(fēng)等[15]報(bào)道了溫和氣單胞菌引起的鱉肝水腫??；王斌等[16]對溫和氣單胞菌引起紅鰭東方鮑發(fā)病進(jìn)行了報(bào)道?？梢?，該病原菌對中國水產(chǎn)動物的危害相當(dāng)廣泛，對淡水養(yǎng)殖的魚類、蛙類和龜鱉類[18]等均有很強(qiáng)的致病性，具有流行區(qū)域廣、流行季節(jié)長、暴發(fā)性流行和死亡率高等特點(diǎn)，是淡水養(yǎng)殖中最為常見的病原菌之一，應(yīng)該引起足夠重視。

本研究分離鑒定了黃顙肌肉腐爛病的致病菌為溫和氣單胞菌，并對染病魚體進(jìn)行了相應(yīng)的治療研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恩諾沙星和諾氟沙星均能有效控制該病情，同等的用藥劑量恩諾沙星效果相對較好。與文獻(xiàn)[5,19]報(bào)道的用藥治療情況進(jìn)行分析比較，其多側(cè)重池塘內(nèi)用藥情況，沒有藥物之間的效果比較，對治療效果也沒有達(dá)到量化分析和比較。

綜上所述，本研究具有以下3個特點(diǎn)。首先，在調(diào)查發(fā)病原因時(shí)側(cè)重從發(fā)病池塘的養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行調(diào)查，推斷微囊藻大量出現(xiàn)對水體中致病菌繁殖速度的影響。其次，另外在治療實(shí)驗(yàn)過程中詳細(xì)記錄了黃顙魚發(fā)病的整個過程，黃顙發(fā)病率均在90%以上(表2)，說明該致病菌的致病力較高。另外，與同類報(bào)道[19]相比，本研究中使用的鑒定方法用時(shí)較短(一般需要24～48 h)，效率高，更有利于快速指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。但本研究中，由于實(shí)驗(yàn)條件原因，未采取分子水平(如16sRNA)進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證，這有待進(jìn)一步完善。

4 結(jié)論

本研究從患病黃顙魚體內(nèi)分離純化到一株致病菌，并通過形態(tài)學(xué)特征以及API細(xì)菌分析鑒定為溫和氣單胞菌，API技術(shù)的應(yīng)用大大提高了致病菌鑒定的效率(一般需要24～48 h)，為漁業(yè)養(yǎng)殖病害的診斷和及時(shí)治療贏得了時(shí)間，對漁業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)具有很好的現(xiàn)實(shí)意義。抗生素治療實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)黃顙發(fā)生肌肉腐爛病時(shí)，可以選擇恩諾沙星或諾氟沙星拌料投喂進(jìn)行治療，有利于避免發(fā)生大規(guī)模的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。但值得注意的是，漁業(yè)養(yǎng)殖的疫病預(yù)防過程中應(yīng)該側(cè)重生態(tài)系統(tǒng)的綜合調(diào)控，應(yīng)以預(yù)防為主，而不應(yīng)把抗生素作為魚體發(fā)病后治療的唯一手段而濫用，從而避免對水產(chǎn)品質(zhì)量、生態(tài)環(huán)境及人體健康造成危害。

[1] 王文彬, 羅玉雙, 曾伯平. 黃顙魚的微生物病及其防治[J]. 內(nèi)陸水產(chǎn), 2006,31 (9):35-37.

[2] 鄭福濤, 陳紹銘. 水生微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)法[M]. 北京:海洋出版社, 1990.

[3] 東秀株, 蔡妙英. 常見細(xì)菌鑒定手冊[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2001.

[4] 周德慶. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊[M]. 上海:上?？萍汲霭嫔? 1986.

[5] 劉德建. 夏季黃顙魚“一點(diǎn)紅”的診斷與防治[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚, 2013(12):59-60.

[6] 潘高山, 胡章立, 雷安平, 等. 微囊藻毒素粗提物對水環(huán)境中溫和氣單胞菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的影響[J]. 湖泊科學(xué), 2008,20(1):105-109.

[7] 朱大玲, 李愛華, 汀建國, 等. 嗜水氣單胞菌毒力與毒力基因分布的相關(guān)性[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006,45(1)：82-85.

[8] Galindo C L, Fadl A A, Sha J, et al.AeromonashydroPhilacytotoxic enterotoxin activates mitogen- activated protein kinases and induces apoptosis in murine macrophages and human intestinal epithelial cells [J]. Biol Chem, 2004,279(36):37597-37612.

[9] 胡琳琳, 房文紅, 梁思成, 等. 金魚溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,17(3):285-290.

[10] Donta S T, Haddow A D. Cytotoxic activity ofAeromonashydroPhila[J]. Infect Immun, 1978,21(3):989-993.

[11] 陳言峰, 馮偉強(qiáng), 張輝華, 等. 高體革鯻溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015,43(3):133-135.

[12] 張曉君, 邴旭文, 姚東瑞, 等. 泥鰍潰瘍病及病原溫和氣單胞菌生物學(xué)及分子特征研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2010,29(12):696-702.

[13] 蔡完其, 孫佩芳. 羅非魚溫和氣單胞菌病病原研究及藥敏試驗(yàn)[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2002,9 (3)：223-246.

[14] 劉敏, 韓英. 鯉魚溫和氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002 , 36 (4):486-489.

[15] 陳曉風(fēng), 周常義. 稚鱉“肝水腫癥”病原及防治研究[J]. 廈門水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996,19, 18(2)：13-17.

[16] 王斌, 于蘭萍, 胡亮. 紅鰭東方鮑皮膚潰爛病病原菌的分離與鑒定[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15(2)：352-358.

[17] 王永坤, 李智健, 朱國強(qiáng). 甲魚爆發(fā)性傳染病的病原研究[J]. 魚類病害研究，1997, 19(1/2):18-24.

[18] 韓繼衛(wèi), 羅文, 鄭大恒. 黃顙魚溫和氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J]. 紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,31(9):19-21.

[19] 何義進(jìn), 錢源磊. 黃顙魚細(xì)菌性潰瘍病的綜合治療對策[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2010(8):57.

The study of yellow catfish muscle decay and its therapy technique

LIU Fang1, MENG Lihua1, YANG Shuying2, SHI Yanmin1*, MENG Die3, XU Yi1

(1.Fisheries Monitoring Stationof Jining, Jining 272000, China；2.Bureau of Aquatic Products of Rencheng District,Jining 272000, China;3.Fisheries Technology Extension Station of fish diseases of Beijing City, Beijing 100001， China)

The muscle decay of yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco) was studied in this experiment. A strain of pathogenic bacteria (named JY-03) was isolated from the fish liver and spleen. The pathogenic bacteria was finally identified to be theAeromonassobriaby Gram staining, microscopy, API physiological and biochemical experiments. Furthermore, this bacteria caused yellow catfish muscle decay was also confirmed to beAeromonassobriaby the infection experiment. The analysis of water quality showed that numerious microcystis accelerated pathogenic bacteria proliferation in aquacultural water, which caused muscle decay ofPelteobagrusfulvidracoin the incidence pond. The therapeutic trial was implemented using norfloxacin and enrofloxacin in fish tanks. 10% norfloxacin and 10% enrofloxacin were mixed separately with feed in accordance with 1∶1000 scale, and the fish were fed once a day according to the 1% fish weight, It was found that both drugs had obvious therapeutic effects. The results showed that the symptom of skin decay disappeared gradually, the number of death was markedly decreased, and the spread of epidemic disease was prevented. The fish were almost cured after 2 weeks drugs treatment. Thereinto, enrofloxacin has a better effect than norfloxacin at the same dose. This study offered the identification and therapy method of muscle decay ofPelteobagrusfulvidracoin aquaculture process, and provided some references for healthy aquaculture of yellow catfish and other related research.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(1):63-70]Key words:yellow catfish；Aeromonassobria；API； identification；decay； therapyCorresponding author:SHI Yanmin，shiyanmin000@163.com

2015-08-12；接收日期：2015-12-10

2012年山東省級常規(guī)專家項(xiàng)目(370020120042)

劉方(1983-),男，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)闈O業(yè)病害防治和水產(chǎn)品安全分析，liufang123f@163.com 通信作者：時(shí)彥民，研究員，研究方向?yàn)闈O業(yè)病害防治和水資源及生態(tài)環(huán)境監(jiān)測，shiyanmin000@163.com

S942

A

2095-1833(2016)01-0063-08