韓云霞 李德鑫 趙海

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，貴州 貴陽(yáng)550003；2.貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550081)

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香虎清婦炎顆粒對(duì)子宮肌瘤模型大鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究

韓云霞1#李德鑫2#趙海1△

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，貴州 貴陽(yáng)550003；2.貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550081)

目的 研究香虎清婦炎顆粒(XHQFYKL)對(duì)子宮肌瘤的治療作用，探討其部分作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法給大鼠肌注雌激素及孕激素造成子宮肌瘤模型，觀察XHQFYKL對(duì)大鼠子宮肌瘤的病理增生、肌瘤組織中孕激素受體(PR)和雌激素受體(ER)表達(dá)的影響，從而探討XHQFYKL治療子宮肌瘤的作用機(jī)制。結(jié)果XHQFYKL有調(diào)節(jié)卵巢激素的作用，并可抑制子宮平滑肌的增生，能顯著減少肌瘤組織中ER、PR的含量。結(jié)論XHQFYKL可通過調(diào)節(jié)卵巢激素治療子宮肌瘤。

香虎清婦炎顆粒； 子宮肌瘤; 雌激素受體; 孕激素受體

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)中較常見的良性腫瘤，也是導(dǎo)致女性切除子宮的重要因素之一。據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，育齡期婦女子宮肌瘤的發(fā)病率在20%～25%[1]。目前臨床治療子宮肌瘤多以手術(shù)治療為主，但手術(shù)治療往往具有一定的適應(yīng)證，且患者的接受程度也限制了其應(yīng)用，常規(guī)的藥物治療大多療效欠佳[2]。米非司酮是臨床中常用于治療子宮肌瘤的新型抗孕激素，能與孕酮受體及糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，可使子宮肌瘤體積明顯縮小[3]。但臨床研究發(fā)現(xiàn)米非司酮有較多的不良反應(yīng)，且治療后常易復(fù)發(fā)[4]。該病屬中醫(yī)癥瘕范疇，因患者氣血不和、血瘀凝滯及久瘀成癥等因素而引發(fā)。我們認(rèn)為子宮肌瘤正氣虛弱是病變基礎(chǔ)，血瘀胞宮是病變本質(zhì)，氣虛血瘀是子宮肌瘤的主要病機(jī)。香虎清婦炎顆粒是經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院治療子宮肌瘤的經(jīng)驗(yàn)方香虎湯加工制備而得，在臨床使用有效的基礎(chǔ)上，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究以雌激素及孕激素造成子宮肌瘤模型，選以具有相近作用的桂枝茯苓膠囊(GZFLJN)為陽(yáng)性對(duì)照。研究香虎清婦炎顆粒對(duì)其的干預(yù)，觀察子宮形態(tài)學(xué)改變，以及對(duì)血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平的影響，子宮系數(shù)及子宮橫徑的影響，XHQFYKL對(duì)大鼠子宮肌組織中ER、PR表達(dá)水平的影響，探討XHQFYKL治療子宮肌瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

香虎清婦炎顆粒(XHQFYKL)由貴州順健制藥有限公司提供，5 g×10袋/包，批號(hào)140601；桂枝茯苓膠囊(GZFLJN)：0.31 g/粒，購(gòu)自江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)Z130801；已烯雌酚注射液：2 mg/1 mL，購(gòu)自廣州明興制藥廠，批號(hào)MB130201；黃體酮注射液：20 mg/1 mL，購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)121201。

1.2 試驗(yàn)試劑

雌二醇放射免疫分析藥盒、孕酮放射免疫分析藥盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；兔抗大鼠ER、PR多克隆抗體、即用型鏈霉素親和過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒、DAB顯色劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠,雌性,體質(zhì)量180 ～220 g，合格證號(hào)SCXK(黔)2010-0001。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 取SD大鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只，即正常對(duì)照組、模型組、XHQFYKL低[0.375 g/(kg·d)]、中[(0.75g/(kg·d)]、高[(1.125 g/(kg·d)]劑量組、陽(yáng)性藥對(duì)照組[(桂枝茯苓膠囊0.3 g/(kg·d)]。模型組及各給藥組大鼠隔日肌注已烯雌酚0.04 mg/只，另每周肌注黃體酮1 mg/只；對(duì)照組大鼠隔日肌注花生油0.1 mL/只，共20周。造模第11周起，各給藥組及陽(yáng)性藥對(duì)照組按上述劑量分別灌胃給予XHQFYKL及GZFLJN；模型組、正常對(duì)照組灌胃給予蒸餾水2 mL/只，每天1次，每周6 d，連續(xù)10周。

1.4.2 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間觀察動(dòng)物的一般狀況。實(shí)驗(yàn)開始至第20周結(jié)束后，股動(dòng)脈取血并處死動(dòng)物。取血及子宮進(jìn)行以下指標(biāo)檢查：(1)血清雌二醇、孕酮： 取血，靜置后分離血清，放免法測(cè)雌二醇、孕酮水平。(2)子宮系數(shù)、子宮橫徑： 取子宮，電子天平稱重，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮重量 mg/大鼠體質(zhì)量 g)，游標(biāo)卡尺測(cè)量子宮分角下(子宮頸以上)及分角根部(一側(cè)分角子宮根部)橫徑。(3)病理組織檢查：對(duì)各組大鼠子宮進(jìn)行肉眼觀察，再取子宮分角以上相同部位0.5 cm一段子宮，中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下行子宮組織病理檢查。

1.4.3 免疫組化方法 檢測(cè)ER和PR在子宮內(nèi)膜的表達(dá)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)： ER和PR陽(yáng)性表達(dá)主要定位于局部組織的表面上皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的胞漿，陽(yáng)性效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒。采用Fromowitz組織化學(xué)評(píng)分法(H-score)[5]，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同的高倍視野(×400)，據(jù)染色程度(淺、中、深)及范圍分別計(jì)分，進(jìn)行結(jié)果判定。染色程度：0分，細(xì)胞無著色記；1分，細(xì)胞輕度著色呈淡黃色記；2分，細(xì)胞著色呈棕黃色記；3分，細(xì)胞明顯著色呈棕褐色記。染色范圍：0分，染色范圍<5%；1分，染色范圍5%～25%；2分，染色范圍25%～50%；3分，染色范圍>50%。累積上述計(jì)分判定結(jié)果，0～1分為陰性(-)；2～3分為弱陽(yáng)性(+)；4～5分為陽(yáng)性(++)；6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 XHQFYKL對(duì)血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平的影響

模型組血清E2、P水平均明顯增高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。XHQFYKL各治療組給藥后血清E2、P水平與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(高、中劑量組P<0.01，低劑量組、GZFLJN組P<0.05)。見表1。

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 XHQFYKL對(duì)子宮系數(shù)及子宮橫徑的影響

模型組子宮重量增加，子宮系數(shù)增大，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。XHQFYKL灌胃給藥可不同程度降低子宮系數(shù)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，XHQFYKL高、中劑量組(P<0.01)，低劑量組(P<0.05)。見表2。模型組子宮分角下及分角根部宮橫徑較對(duì)照組增加(P<0.01)；XHQFYKL各治療組兩處子宮橫徑均小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(高劑量組P<0.01，中劑量組、GZFLJN組P<0.05)。見表3。

組別劑量/(g/kg)動(dòng)物數(shù)/只子宮重量/mg子宮系數(shù)/(mg/g)正常對(duì)照組—11719.88±163.292.95±0.65模型組—111652.15±296.15▲7.47±1.46▲低0.375111486.76±164.07*7.04±0.81*XHQFYKL組中0.75121465.61±93.58**5.89±0.66**高1.125121191.90±137.36**5.33±0.54**GZFLJN組0.3101520.75±58.817.22±0.51

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

組別劑量/(g/kg)n分角下子宮/cm分角根部子宮/cm正常對(duì)照組-110.63±0.140.30±0.06模型組-111.05±0.16▲0.49±0.06▲低0.375110.94±0.14**0.45±0.05XHQFYKL組中0.75120.85±0.12*0.41±0.05*高1.125120.78±0.09**0.36±0.05**GZFLJN組0.3100.85±0.07**0.42±0.07*

注：與對(duì)照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

2.3 組織形態(tài)學(xué)影響

肉眼觀察模型組子宮較正常對(duì)照組體積增大，質(zhì)地厚實(shí)，呈暗紅色，部分區(qū)域水腫呈空泡狀。治療組子宮體積、顏色與正常對(duì)照組接近，呈鮮紅色。

鏡下觀察模型組子宮肌纖維明顯增生肥大，肌層明顯增厚，肌纖維排列紊亂，呈輕微編織狀，出現(xiàn)穿插現(xiàn)象，病變近似平滑肌瘤樣增生。見圖1。正常對(duì)照組子宮肌層薄,肌纖維無增生肥大,內(nèi)環(huán)肌、外縱肌規(guī)則排列，見圖2。XHQFYKL高、中劑量組子宮肌層明顯變薄,肌纖維細(xì)長(zhǎng)或稍肥大,排列規(guī)則,偶見或未見內(nèi)環(huán)肌和外縱肌穿插現(xiàn)象。見圖3，4。

圖1 模型組 (HE×100) 圖2 正常對(duì)照組 (HE×100)

圖3 高劑量組 (HE×100) 圖4 中劑量組 (HE×100)

2.4 XHQFYKL對(duì)大鼠子宮肌組織中ER表達(dá)的影響

對(duì)照組子宮內(nèi)膜有大量ER陽(yáng)性表達(dá)；模型組ER表達(dá)量略低于對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中都可見棕黃色顆粒狀或絲網(wǎng)狀陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物；XHQFYKL高、中、低劑量組ER表達(dá)量均明顯降低，僅部分細(xì)胞有少量棕黃色表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別nER-++++++Z值對(duì)照組111640-模型組1134400.000GZFLJN組105500-2.090△高劑量組128400-2.494△中劑量組127410-2.140△低劑量組116410-2.084△

注：與模型組比較，△P<0.05。

2.5 XHQFYKL對(duì)大鼠子宮肌組織中PR表達(dá)的影響

對(duì)照組子宮內(nèi)膜有PR表達(dá)；模型組PR表達(dá)量略低于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在表面上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和腺體的上皮細(xì)胞的胞漿中都可見棕黃色顆粒狀或絲網(wǎng)狀陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物；XHQFYKL高、中、低劑量組PR表達(dá)量均較模型組明顯降低，僅部分細(xì)胞有少量棕黃色表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

組別nER(-)(+)(++)(+++)Z值對(duì)照組112540-模型組113620-0.505GZFLJN組106400-2.182△高劑量組128400-2.248△中劑量組127500-1.996△低劑量組117310-2.060△

注：與模型組比較，△P<0.05。

3 討 論

傳統(tǒng)認(rèn)為雌激素有誘發(fā)并促進(jìn)子宮肌瘤生長(zhǎng)的作用，生物化學(xué)測(cè)定證實(shí)，子宮肌瘤較正常肌層中雌二醇(E2)的濃度明顯增高, E2向雌酮(E1)的轉(zhuǎn)化率也低于正常肌組織，提示局部高E2環(huán)境的存在可刺激肌瘤的生長(zhǎng)[6]。近年來發(fā)現(xiàn)孕激素在子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展中也有重要作用。分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí),子宮平滑肌瘤組織孕激素受體蛋白和孕激素受體mRNA表達(dá)水平比鄰近肌層增加,增殖抗原Ki-67明顯升高,提示增強(qiáng)的孕激素受體介導(dǎo)的信號(hào)與肌瘤生長(zhǎng)有關(guān)。雌、孕激素與其相應(yīng)受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用,雌激素和孕激素通過自分泌或旁分泌互相調(diào)節(jié),雌激素和孕激素的聯(lián)合作用使細(xì)胞DNA合成及有絲分裂能力進(jìn)一步增強(qiáng)[7]。孕激素可提高子宮肌瘤細(xì)胞上的雌激素受體含量,并通過提高上皮生長(zhǎng)因子樣蛋白和上皮生長(zhǎng)因子受體的含量,間接刺激子宮肌細(xì)胞的增生[8]。本實(shí)驗(yàn)通過給予大鼠注射外源性雌、孕激素，HE染色顯示子宮平滑肌層增生,平滑肌排列紊亂,細(xì)胞增大,病理改變與人子宮肌瘤病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似,子宮系數(shù)增大，子宮橫徑增粗，說明模型成功。本模型的成功也說明了高水平雌、孕激素是子宮肌瘤發(fā)生的主要原因之一。造模后予XHQFYKL進(jìn)行治療，并以桂枝茯苓膠囊作為對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)子宮系數(shù)、子宮橫徑以及組織病理變化對(duì)比發(fā)現(xiàn)XHQFYKL能抑制子宮平滑肌瘤樣增生。檢測(cè)血清雌、孕激素水平，結(jié)果顯示，XHQFYKL有調(diào)節(jié)雌、孕激素的作用，這可能是其治療子宮肌瘤的機(jī)制之一。

子宮肌瘤是雌激素敏感性腫瘤，多見于性激素功能活躍的育齡婦女，少見于絕經(jīng)后婦女。臨床發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予外源性雌激素或妊娠時(shí)，子宮肌瘤迅速增大；而絕經(jīng)后出現(xiàn)的低雌二醇(E2)、低孕酮(P)狀態(tài)則可引起肌瘤的縮小甚至消失。故長(zhǎng)期以來雌激素一直被認(rèn)為是子宮肌瘤發(fā)生和發(fā)展的促進(jìn)劑。激素主要的生物學(xué)效應(yīng)是靠與受體結(jié)合后才能得以實(shí)現(xiàn)。靶組織保留激素的多少取決于其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)受體的含量；在同一激素水平下，激素在靶組織中產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱也取決于靶細(xì)胞受體的含量，說明肌瘤的生長(zhǎng)與ER、PR的水平密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠模型組子宮肌組織均有ER、PR表達(dá)，但表達(dá)量略低于對(duì)照組。ER、PR受雌激素調(diào)節(jié)，雌激素上調(diào)ER與PR的表達(dá)，孕激素對(duì)ER與PR有降調(diào)作用。XHQFYKL高、中、低劑量組子宮肌組織中ER、PR表達(dá)較模型組均明顯減少，表明降低子宮肌瘤組織中ER、PR的表達(dá)水平是XHQFYKL治療子宮肌瘤的可能機(jī)制之一。

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讀者·作者·編者

醫(yī)學(xué)出版物中部分約定俗成的字詞

(1)“癥”：用于“癥狀”、“并發(fā)癥”、“病癥”。(2)“證”：用于“適應(yīng)證”、“禁忌證”、“證候”。(3)“征”：用于“綜合征”、“體征”、“指征”、“征象”。(4)“堿”：用于“酸堿平衡”、“堿性磷酸酶”、“氨茶堿”，不用“鹼”。(5)“瘀”：用于“瘀血”、“瘀斑”、“瘀點(diǎn)”，不用“淤”字，中醫(yī)使用“瘀”、西醫(yī)多用“淤”。

貴州醫(yī)藥雜志社

Xiang Hu Qing Fu Yan granule experimental study of the effect of the granule on the model of uterine leiomyoma in rats

HanYunxia1#,LiDexin2#,ZhaoHai1.

1.PharmacyDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China. 2.PharmaceuticalLaboratoryofCareerTechnicalCollegeGuiyang，Guiyang550081,Guizhou,China.

Objective To study the fragrant tiger clear therapeutic effect of Fuyan particles (XHQFYKL) on uterine myoma and to explore the action mechanism and for its clinical application to provide experimental basis. Methods Rats intramuscular injection of estrogen and progesterone caused by uterine myoma model to observe XHQFYKL on rat uterine smooth muscle tumor pathological proliferation, leiomyoma progesterone receptor (PR), the effect of expression of estrogen receptor (ER), so as to explore the mechanism of treatment of uterine fibroids XHQFYKL. Results XHQFYKL there was the role of regulation of ovarian hormones, and can inhibit the proliferation of uterine smooth muscle, can significantly reduce the amount of PR, ER in the uterine leiomyoma tissue.Conclusion XHQFYKL can regulate ovarian hormone treatment of uterine fibroids.

XHQFYKL； Uterine leiomyoma； Estrogen receptor； Progesterone receptor

貴州省科技廳中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目[黔科合中藥字(2013)5015號(hào)

R737.33

A

1000-744X(2016)10-1028-04

2016-07-11)

#均為本課題主要負(fù)責(zé)人

△通信作者,E-mail:670082381@qq.com