陸玉建， 張韓杰， 韓文瑜， 沈志強

( 1. 濱州學院 生命科學系， 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術研究中心， 山東 濱州256603； 2. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 博士后科研工作站， 山東 濱州 256600； 3. 吉林大學 博士后科研流動站， 長春 130062 )

紫茉莉不定芽誘導和植株再生

陸玉建1,2,3， 張韓杰1， 韓文瑜3， 沈志強2*

( 1. 濱州學院 生命科學系， 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術研究中心， 山東 濱州256603； 2. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 博士后科研工作站， 山東 濱州 256600； 3. 吉林大學 博士后科研流動站， 長春 130062 )

紫茉莉(Mirabilisjalapa)觀賞價值較高，是一種重要的污染修復植物。組織培養(yǎng)技術為植物品種改良和選育的重要途徑，但紫茉莉離體快繁方面的研究尚未見有相關報道。該研究以紫茉莉葉片和莖段為外植體，通過觀察和統(tǒng)計外植體愈傷組織和不定芽的誘導情況，分析不同植物生長物質對紫茉莉植株再生的影響。結果表明：紫茉莉帶芽莖段比較適合叢生芽的誘導，當帶芽莖段在MS+1.0 mg·L-16-BA + 1.5 mg·L-1KT + 1.0 mg·L-1NAA + 0.05 mg·L-1TDZ培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，不定芽的增殖系數(shù)較高。無論是MS或1/2MS培養(yǎng)基，都可誘導不定根的產(chǎn)生，其中生根效果較好的培養(yǎng)基為1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA。該研究結果探索了紫茉莉組織培養(yǎng)的最適條件，根據(jù)愈傷組織誘導率和不定芽的增殖系數(shù)篩選出了適宜不定芽誘導的培養(yǎng)基類型，根據(jù)不定芽生根情況確定了最佳的生根誘導培養(yǎng)基，為建立紫茉莉高效穩(wěn)定的再生和遺傳轉化體系奠定了基礎。

紫茉莉， 莖段， 不定芽， 誘導， 再生

紫茉莉(Mirabilisjalapa)又名草茉莉、胭脂花、地雷花、粉豆花等，為紫茉莉科紫茉莉屬多年生草本植物，原產(chǎn)南美熱帶地區(qū)，在我國廣為分布和種植(陳軍，2012)。紫茉莉花色豐富，觀賞價值較高，可作為植物色素的重要來源；胚乳白色，細膩，是天然的理想化妝品(蔣麗芳等，2007；張西西等，2016)。紫茉莉具有清熱解毒、利濕消腫、活血散瘀、調(diào)經(jīng)利尿等功效，還可用于抗菌、解痙和鎮(zhèn)痛(李光喜和楊培全，1994；Harrison，1998)。紫茉莉還富含抗病毒蛋白活性的化合物，抗病毒效果顯著(Vani et al，1997；Zachariah，2011)。紫茉莉是一種高生物量的重金屬富集植物，對鎘、鉛等重金屬具有較強的積累和轉運能力(葉晟，2009；陸成云等，2015；張杏麗，2015)；而且還對低濃度的非金屬元素砷表現(xiàn)出一定的耐受性(徐玲玲等，2015)。紫茉莉生長對根際土壤微生物群落結構及石油烴降解速率均具有較大影響，能明顯降低污染土壤中石油濃度及多環(huán)芳烴的含量，是一種重要的污染修復植物(劉家女等，2007；Peng et al，2009；焦海華等，2015)。此外，紫茉莉具有適應長期干旱等不良環(huán)境的能力，因此對于土地沙漠化和鹽堿化的治理具有重要意義(羅南書，2011)。目前國內(nèi)外關于紫茉莉的研究主要集中在生物修復方面，而有關紫茉莉再生體系建立方面的研究尚未見相關報道。本研究旨在探索紫茉莉離體快繁的最適條件，以期建立高效穩(wěn)定的再生體系，為進一步通過遺傳轉化技術改良紫茉莉的生物性狀奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

紫茉莉(Mirabilisjalapa) 瘦果2014年9月采集于山東省濱州市濱城區(qū)新濱公園，由濱州學院生命科學系基因工程實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 通過正交試驗設計生長調(diào)節(jié)劑組合，根據(jù)預試驗的結果初步篩選出具有一定效果的培養(yǎng)基類型(表1)。其中，MG0為種子萌發(fā)培養(yǎng)基，MC1～MC8為愈傷組織誘導培養(yǎng)基，ML1～ML8為不定芽誘導和增殖培養(yǎng)基，MR1～MR4為生根誘導培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基中均添加3%的蔗糖和0.8%的瓊脂，pH5.8～6.0。

1.2.2 瘦果的消毒和培養(yǎng) 取成熟飽滿的紫茉莉瘦果，用自來水徹底沖洗干凈，4 ℃低溫浸泡2 d。經(jīng)50 ℃水浴30 min，70%酒精消毒10 min，0.1%升汞處理30 min后，無菌水清洗5次，除去果皮和種皮，剝離成熟胚，接種于MG0培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。紫茉莉生長條件為16 h光照、8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在25 ℃左右，光照強度為2 200 lx。

1.2.3 愈傷組織誘導 以生長3周的紫茉莉無菌苗為材料，切取葉片和莖段，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基MC1～MC8中，進行愈傷組織的誘導。15 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率：愈傷組織誘導率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)) × 100%。

1.2.4 不定芽誘導和增殖 取無菌苗帶芽莖段，接種于不定芽誘導培養(yǎng)基ML1～ML8中進行不定芽誘導，15 d后統(tǒng)計外植體上產(chǎn)生不定芽的數(shù)量，計算生殖系數(shù)。用相同的培養(yǎng)基進行不定芽的增殖培養(yǎng)。

1.2.5 不定芽生根 當不定芽長度為3～4 cm時，切取不定芽，接種于生根培養(yǎng)MR1～MR4中進行生根誘導，分別于21 d和30 d進行生根數(shù)量統(tǒng)計。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過Duncan多重比較進行顯著性測驗。

表 1 紫茉莉再生不同培養(yǎng)基的組成

2 結果與分析

2.1 紫茉莉成熟胚的培養(yǎng)

紫茉莉瘦果(圖1：A)黑色，堅硬，革質，表面褶皺，消毒困難，極易污染。直接用瘦果進行培養(yǎng)，種子萌發(fā)十分緩慢，大約需要3周 (圖1：B)；如果剝?nèi)ス?，培養(yǎng)成熟胚(圖1：C)，種子萌發(fā)迅速，大約1周即可獲得幼苗(圖1：D)。可見，致密堅韌的果皮是抑制紫茉莉種子萌發(fā)的關鍵因素。

2.2 植物生長物質對外植體愈傷組織誘導的影響

以葉片為外植體，在誘導培養(yǎng)的第7天，可觀察到葉片的邊緣處有少量乳白色的愈傷組織產(chǎn)生。繼續(xù)培養(yǎng)至第15天，葉片表面產(chǎn)生大量的不定根，而愈傷組織生長停滯，幾乎難以分辨(圖1：E)。以莖段為外植體，接種后第15天，莖段膨脹，兩端開始有愈傷組織產(chǎn)生(圖1：F)。在不同培養(yǎng)基中，莖段愈傷組織誘導率存在明顯差異(圖2)。MC1～MC4誘導愈傷組織的效果均好于MC5～MC8，其中MC2愈傷組織誘導率在90%以上，與其他培養(yǎng)基的誘導效果之間差異非常顯著(P<0.01)?？梢?，在培養(yǎng)基中僅添加2,4-D，并不適合愈傷組織的誘導，而需要2,4-D、KT和NAA等多種植物生長物質的共同作用，其中2.0 mg·L-12,4-D誘導紫茉莉細胞脫分化的能力更強。雖然莖段產(chǎn)生愈傷組織的效果優(yōu)于葉片，但愈傷組織的量少而差，增殖困難；分化培養(yǎng)時仍然出現(xiàn)大量不定根，而未見不定芽的產(chǎn)生。

2.3 植物生長物質對紫茉莉不定芽誘導的影響

以葉片和莖段為外植體，經(jīng)多次正交試驗，發(fā)現(xiàn)無論是否經(jīng)過愈傷組織階段，均難以誘導不定芽的再生。以帶芽莖段為外植體(圖1：G)，接種1周后，可觀察到在莖段的葉腋部位，開始有芽抽出。到了第15天，莖段上芽的數(shù)量明顯增多。接種后的第30天，芽伸長顯著，生長旺盛(圖1：H)。將產(chǎn)生的芽進行切割，接種到培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后，不定芽生長迅速，數(shù)量極多，成簇分布，形成叢生芽(圖： I)。分別對ML1～ML8培養(yǎng)基中莖段產(chǎn)生芽的數(shù)量進行統(tǒng)計分析(圖3)。圖3結果表明，雖然這8種培養(yǎng)基均可誘導芽的形成，但產(chǎn)生的數(shù)量和速度存在差異。其中，ML7效果最好，生芽速度快而多，增殖系數(shù)最高，達到17.09；而ML6效果最差，增殖系數(shù)只有3.67。通過對數(shù)據(jù)進行顯著性分析可以看出，ML7和其他培養(yǎng)基的誘導效果之間差異極其顯著(P<0.01)，并且用ML7對獲得的芽進行增殖培養(yǎng)可誘導產(chǎn)生大量的叢生芽。

2.4 生根誘導

切取長3～4 cm不定芽，接種到MR培養(yǎng)基中進行生根誘導(圖1：J)。3周后，不定芽的基部已產(chǎn)生明顯的不定根(圖1：K)。通過對不定芽生根情況進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在選用的4種生根培養(yǎng)基中，不定芽均可生根，但效果存在一定的差異(圖4)。其中，MR4培養(yǎng)基中，不定根生長迅速，數(shù)量較多，尤其在生根誘導30 d后表現(xiàn)的更為明顯，增殖系數(shù)達到38.3，而MR1只有8.9。顯著性分析表明，MR4和其他生根培養(yǎng)基的誘導效果間差異非常顯著(P<0.01)。由此可見，紫茉莉比較容易生根， 其中1/2MS培養(yǎng)基效果要好于MS，附加0.5 mg·L-1NAA對于不定芽的生根有明顯的促進作用。

2.5 馴化與移栽

當試管苗的根系布滿瓶底、幼苗高8～10 cm時便可進行移栽。通過馴化，可使試管苗逐步適應溫室環(huán)境。將試管苗從瓶內(nèi)小心取出，洗去根上附著的培養(yǎng)基，移栽到合適的基質中。紫茉莉的移栽基質由泥炭土和珍珠巖組成，比例約為1∶1。移栽的初期，花盆覆蓋一層保鮮膜。隨著紫茉莉對培養(yǎng)條件的適應，逐步打開至最終完全去掉保鮮膜。在適宜的生長條件下(見方法1.2.2)，紫茉莉的幼苗生長迅速 (圖1：L)。本研究結果表明，紫茉莉試管苗極易成活，移栽成活率在90%以上。

圖 1 紫茉莉的不定芽誘導和植株再生 A. 紫茉莉的瘦果； B. 培養(yǎng)3周后萌發(fā)的紫茉莉； C. 紫茉莉的成熟胚； D. 生長1周的幼苗； E. 接種到MC2培養(yǎng)基中15 d的葉片； F. 接種到MC2培養(yǎng)基中15 d的莖段； G. 接種到ML7培養(yǎng)基中的帶芽莖段； H. 接種后第30天的莖段； I. 不定芽的增殖培養(yǎng)； J. 生根誘導； K. 大量不定根的形成； L. 試管苗移栽30 d后的生長情況。Fig. 1 Adventitious shoots induction and plant regeneration of Mirabilis jalapa A. Achenes of M. jalapa; B. Achenes in culture for 3 weeks; C. Mature embryos; D. Mature embryos cultured for 1 week have developed into seedlings; E. Callus induction of leaves after 15 d of culture; F. Callus induction of stem segments after 15 d; G. Nodal stem segments of M. jalapa as explants; H. Nodal stem segments producing adventitious shoots on the induction medium after 30 d of culture; I. Proliferation of cultured adventitious shoots; J. Shoots transferred to rooting medium; K. Plantlet with well developed adventitious roots after 21 d of culture; L. Regenerated plants growing in pot soil for 30 d.

圖 2 不同培養(yǎng)基中紫茉莉莖段愈傷組織誘導率不同大寫字母表示在P<0.01水平上差異顯著；不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。Fig. 2 Callus induction frequency of stem segments was determined in different media after 15 d in culture Different capital letters indicate significant differences at P<0.01 level; Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level. The same below.

圖 3 不同培養(yǎng)基中紫茉莉帶芽莖段產(chǎn)生的不定芽數(shù)Fig. 3 Number of shoots formed in different media after 15 d in culture

圖 4 不同培養(yǎng)基中紫茉莉不定芽生根數(shù)Fig. 4 Number of roots formed in different media after 21 and 30 d in culture

3 討論與結論

在植物組織培養(yǎng)過程中，不同外植體往往再生能力不同。本研究結果表明，以紫茉莉葉片為外植體，產(chǎn)生的愈傷組織的量極少，以至于難以進行不定芽的誘導，而且葉片上極易產(chǎn)生不定根，培養(yǎng)時間越長，不定根的數(shù)量越多。這與白玉等(2012)和趙倩等(2013)的結果并不一致。植物生長物質是植物細胞生長最適宜的調(diào)節(jié)物質。生長素類常用來誘導愈傷組織形成和根的分化；細胞分裂素類的生理作用主要是促進細胞分裂，誘導芽的形成，促進芽生長(王慧英，2010)。2,4-D對啟動植物細胞脫分化十分重要，一般隨著2,4-D濃度的提高，植物細胞脫分化能力逐漸增強，但超過一定濃度時，反而對愈傷組織的誘導起抑制作用。本研究結果顯示，莖段愈傷組織誘導最適的2,4-D濃度為2.0 mg·L-1，這時細胞脫分化的能力較強，細胞分裂較為旺盛。KT是細胞分裂素的一種，能促進脫分化的細胞保持旺盛的分裂能力，因此在培養(yǎng)基中添加低濃度的KT，有助于愈傷組織的生長和增殖，但KT的濃度不宜過高，否則會對細胞分裂起抑制作用。此外，培養(yǎng)基中添加一定濃度的NAA有利于愈傷組織的產(chǎn)生。雖然莖段產(chǎn)生愈傷組織的效果優(yōu)于葉片，但產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量與質量并不十分理想，分化培養(yǎng)時未見不定芽的產(chǎn)生；隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)現(xiàn)莖段的兩端依然會有大量不定根產(chǎn)生。因此，通過誘導葉片或莖段產(chǎn)生質量較高的愈傷組織，利用愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽的條件還有待于進一步探索。以葉片或莖段為外植體直接進行不定芽的誘導，雖然嘗試了多次正交試驗，均難以誘導不定芽的產(chǎn)生。以帶芽莖段為外植體，則較容易誘導叢生芽的形成，通過增殖培養(yǎng)，不定芽的數(shù)量可以急劇增加。對照各培養(yǎng)基的成分發(fā)現(xiàn)，在6-BA和KT存在的情況下，TDZ含量的變化對不定芽的誘導率影響較大。TDZ是具有很強細胞分裂素活性的苯基衍生物，對植物芽的增殖和再生具有重要作用，在附加TDZ的培養(yǎng)基中加入適量的細胞分裂素或生長素時，能增加芽的增殖率(Murthy et al, 1995)。培養(yǎng)基中添加合適濃度的TDZ時，紫茉莉不定芽產(chǎn)生的效果較好，表明TDZ在此過程中是起關鍵作用的生長調(diào)節(jié)物質，但仍需和其他植物生長物質協(xié)同作用。對于生根誘導，發(fā)現(xiàn)紫茉莉的生根能力極強，多種類型的培養(yǎng)基均可誘導不定芽生根，甚至葉片和莖段也能誘導根的形成，但不同培養(yǎng)基生根效果不同，其中在1/2MS培養(yǎng)基中添加一定量的NAA更適宜根的形成。

當前，我國土壤鹽漬化和石油、重金屬等污染嚴重，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生極大的威脅。紫茉莉生長迅速，生物量大，適應性強，已成為污染土壤修復的常用植物。但野生紫茉莉生物修復能力仍需進一步提高，將具有修復功能的外源基因引入紫茉莉，則是增強紫茉莉生物修復功能的有效手段。穩(wěn)定高效再生體系的建立是植物遺傳轉化的基礎，本研究通過優(yōu)化紫茉莉再生條件，首次建立起紫茉莉再生體系，試驗結果對于今后通過基因工程技術對紫茉莉進行遺傳轉化和性狀改良具有一定的參考價值。

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Adventitious shoot induction and plant regeneration ofMirabilisjalapa

LU Yu-Jian1,2,3, ZHANG Han-Jie1, HAN Wen-Yu3, SHEN Zhi-Qiang2*

( 1. Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of YellowRiverDelta,DepartmentofLifeSciences,BinzhouUniversity, Binzhou 256603, Shandong, China; 2.PostdoctoralProgramme,ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy, Binzhou 256600, Shandong, China;3.PostdoctoralProgramme,JilinUniversity, Changchun 130062, China )

Mirabilisjalapais a perennial herb of Nyctaginaceae, native to South America. It grows faster and can reproduce itself. Not only is it a high-value ornamental flowering and greening plant, but also can be used as medicine. In addition, the recent studies show thatMirabilisjalapahas good bioremediation function. Plant tissue culture technology provides an important way to improve and breed new varieties for horticultural plants. However, the research related toM.jalapais still relatively little, and there are no reports on plant regeneration ofM.jalapaat present. In this study, the achenes ofM.jalapawere sterilized and inoculated into basal MS medium containing 0.1 mg·L-1NAA for the sterile seedlings obtained. Then the leaves and stems of the sterile seedlings were as explants to study the effects of different plant regulators on the buds induction and plant regeneration. According to frequency of callus induction, average number of buds and roots, the optimal media for inducing adventitious buds and rooting were screened respectively. The results showed that most of leaf explants did not produce calli, none of which formed adventitious buds. Moreover, with the prolongation of culture time, leaves began to produce adventitious roots, and gradually became more and more. The nodal stem segments of vegetative branches of sterile seedlings were more suitable for the induction of buds. Micropropogated shoots were quickly induced from axillary buds of nodes on an induction medium consisting of basal MS medium supplemented with different concentrations of 2,4-D, NAA, KT, 6-BA, and TDZ. Among them, the optimal medium for the explant cultureinvitroofM.jalapawas MS + 1.0 mg·L-16-BA + 1.5 mg·L-1KT + 1.0 mg·L-1NAA + 0.05 mg·L-1TDZ, the number of adventitious shoots were more and growth robust. For rooting induction, either MS or 1/2MS medium could induce the adventitious buds to produce roots, and the optimal medium was 1/2MS + 0.5 mg·L-1NAA. This study was designed to explore the optimal conditions for tissue culture ofM.jalapa, which provides the information for the future establishment of an efficient regeneration system ofM.jalapatissue culture and genetic transformation system. Key words:Mirabilisjalapa, stem, bud, induction, regeneration

10.11931/guihaia.gxzw201510032

2015-10-25

2016-03-23

山東省自然科學基金(ZR2012CL14)；濱州學院博士基金(2010Y08) [Supported by the Natural Science Foundation of Shandong (ZR2012CL14); the Doctoral Fund of Binzhou University (2010Y08)]。

陸玉建(1979-)，男，河南南陽市人，博士，講師，主要從事細胞工程及分子生物學研究，(E-mail) luyujian79@163.com。

*通訊作者： 沈志強，博士，研究員，研究方向為預防獸醫(yī)學，(E-mail) bzshenzq@163.com。

Q945

A

1000-3142(2016)12-1439-06

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