李嘉欣， 解彩霞， 劉瑞剛， 蘇 燕

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060； 2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

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應(yīng)用血紅蛋白釋放試驗(yàn)研究紅細(xì)胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氫鈉對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用*

李嘉欣1， 解彩霞1， 劉瑞剛2， 蘇 燕1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060； 2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)

為了研究紅細(xì)胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氫鈉(mannitol adenine sodium dihydrogen phosphate,MAP)對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用，將紅細(xì)胞懸液分為對(duì)照組和MAP組，將對(duì)照組加入等體積生理鹽水和紅細(xì)胞懸液，將MAP組加入等體積MAP液和紅細(xì)胞懸液，4℃保存。取作用不同時(shí)間的兩組反應(yīng)液，利用血紅蛋白釋放試驗(yàn)(hemoglobin releasing test，HRT)比較血紅蛋白釋放差異，并測(cè)定相對(duì)溶解度。結(jié)果顯示，相同時(shí)間MAP組的Hb釋放量明顯弱于對(duì)照組，紅細(xì)胞的相對(duì)溶解度也較對(duì)照組顯著降低。說(shuō)明紅細(xì)胞保存液能減弱Hb再釋放，降低紅細(xì)胞破膜率，保護(hù)紅細(xì)胞。

紅細(xì)胞保存液；血紅蛋白釋放實(shí)驗(yàn)；生理鹽水；紅細(xì)胞懸液

包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室于20世紀(jì)80年代初創(chuàng)建了淀粉-瓊脂糖混合凝膠電泳，用來(lái)觀察Hb的電泳行為。實(shí)驗(yàn)時(shí)直接用全血進(jìn)行電泳觀察，無(wú)需制備紅細(xì)胞裂解液，大大提高了研究效率[1]。2007年，血紅蛋白研究組在進(jìn)行1例輕型β-地中海貧血患者的紅細(xì)胞電泳過(guò)程中偶然發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白再釋放現(xiàn)象，依此創(chuàng)建了血紅蛋白釋放試驗(yàn)(hemoglobin release test，HRT)[2]，并將這一技術(shù)不斷發(fā)展，應(yīng)用于對(duì)多種臨床病例的研究和抗氧化物維生素C對(duì)紅細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)作用的研究。本研究旨在將HRT應(yīng)用于研究紅細(xì)胞保存液對(duì)紅細(xì)胞的持續(xù)性保護(hù)作用，擴(kuò)大HRT的適用范圍。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血液標(biāo)本 40份正常成人新鮮肝素抗凝靜脈血，取自包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科的健康體檢者，4 ℃保存。

1.1.2主要儀器與試劑 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；水平電泳槽(DYY-III型)和穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(DYY-2C)，北京市六一儀器廠出品；17 cm×17 cm玻璃板等。四氯化碳、淀粉、硼酸、冰醋酸、甲醇、氨基黑等均為國(guó)產(chǎn)，分析純；瓊脂糖，西班牙進(jìn)口分裝品；紅細(xì)胞保存液甘露醇腺嘌呤磷酸二氫鈉(mannitol adenine sodium dihydrogen phosphate,MAP)，北京博德桑特輸采血器材科技開(kāi)發(fā)中心產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1紅細(xì)胞懸液和溶血液的制備 按照本室常規(guī)方法制備紅細(xì)胞懸液和溶血液，將紅細(xì)胞懸液分為兩組，每組5份。每日各取2份，將對(duì)照組加入等體積生理鹽水，MAP組加入等體積MAP液，置于4 ℃保存。取作用2 h、1 d、2 d、3 d、4 d樣品檢測(cè)。

1.2.2血紅蛋白釋放試驗(yàn) 按照本室常規(guī)方法配制淀粉瓊脂糖混合凝膠，將各樣品紅細(xì)胞懸液分別吸取10 μL加在10 mm×2 mm濾紙條上，將其插入距玻璃板邊緣1.5 cm的凝膠中，置于陰極。第一次120 V電泳65 min，斷電5 min，通電繼續(xù)電泳60 min。泳畢，氨基黑10 B染色過(guò)夜，次日，用5 %冰醋酸溶液浸泡至背景無(wú)色，觀察結(jié)果。

1.2.3紅細(xì)胞相對(duì)溶解度測(cè)定 將樣品經(jīng)3000 r/min離心5 min，吸取30 μL上清液，用生理鹽水稀釋10倍，調(diào)波長(zhǎng)至540 nm處，測(cè)定吸光度值。以稀釋50倍的溶血液吸光度平均值為參照吸光值，計(jì)算相對(duì)溶解度。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0軟件處理，結(jié)果用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用Two-way ANOVA檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1紅細(xì)胞相對(duì)溶解度測(cè)定

2.1.1參照吸光值 將溶血液稀釋50倍，置于540 nm處測(cè)得的吸光值是紅細(xì)胞全部溶解后釋放出的Hb的吸光值，取5次測(cè)定結(jié)果分別為0.622、0.624、0.618、0.626、0.631，取平均值0.624作為參照吸光值。

2.1.2不同作用時(shí)間對(duì)紅細(xì)胞膜的影響 選取不同作用時(shí)間的MAP組和對(duì)照組紅細(xì)胞懸液，測(cè)定相對(duì)溶解度。結(jié)果顯示，MAP組破膜程度與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組隨時(shí)間增加，破膜程度也依次增強(qiáng)，MAP組破膜程度變化微小，對(duì)照組的相對(duì)溶解度為MAP組的1.3～1.7倍(圖1)。

3 討論

紅細(xì)胞中的重要成分Hb作為呼吸載體攜帶氧氣輸送至全身各組織,并參與維持酸堿平衡。紅細(xì)胞無(wú)核，主要能量供應(yīng)依賴于糖酵解。在液態(tài)保存過(guò)程中的紅細(xì)胞的損壞主要與Hb與氧的結(jié)合能力下降、ATP含量下降、代謝調(diào)節(jié)作用喪失以及膜表面磷脂酰絲氨酸的暴露有關(guān)。1990年日本研發(fā)出的紅細(xì)胞保存液MAP液[3]在原有紅細(xì)胞保存液的基礎(chǔ)上加大了甘露醇的含量，使紅細(xì)胞膜滲透壓和膜抗性增強(qiáng)，減少了因膜破壞發(fā)生的溶血，可有效保存紅細(xì)胞長(zhǎng)達(dá)42 d[4]。目前MAP液被廣泛用于紅細(xì)胞保存，其成分主要包含甘露醇、葡萄糖、枸櫞酸鹽、腺嘌呤、磷酸鹽等。紅細(xì)胞在保存前需要洗滌，去除白細(xì)胞和血漿蛋白等物質(zhì)。前期研究結(jié)果表明，MAP液洗滌使紅細(xì)胞pH下降顯著，而生理鹽水洗滌后紅細(xì)胞pH下降較前者小，MAP液洗滌效果不如生理鹽水效果好。本研究中所用紅細(xì)胞均為生理鹽水洗滌。

紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)是將未裂解的完整紅細(xì)胞懸液加在濾紙片上，置于淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳。電泳過(guò)程包括通電-斷電-再通電，染色后會(huì)出現(xiàn)Hb的再釋放區(qū)帶。研究表明再釋放的Hb是與紅細(xì)胞膜結(jié)合的Hb，當(dāng)紅細(xì)胞膜破損增多時(shí)，Hb再釋放區(qū)帶增強(qiáng)。MAP液中的多種成分維持了紅細(xì)胞代謝的完整性，有效延長(zhǎng)了紅細(xì)胞的壽命，降低溶血率。其中所含的葡萄糖可以為紅細(xì)胞糖酵解提供原料，使紅細(xì)胞維持一定濃度的腺苷三磷酸，維持血影蛋白磷酸化,保持了膜的變形能力，減少膜損傷。MAP液中的腺嘌呤可通過(guò)紅細(xì)胞的代謝,生成磷酸丙糖和磷酸果糖,參與糖酵解途徑,生成腺苷三磷酸并減少腺苷三磷酸的破壞,降低膜損傷。本研究將HRT應(yīng)用于紅細(xì)胞保存液對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用中，隨著保存天數(shù)的增多，懸浮于生理鹽水中紅細(xì)胞的Hb再釋放量增強(qiáng)顯著，而懸浮于MAP液中的Hb再釋放沒(méi)有明顯增加，從而有效反映出MAP液降低了紅細(xì)胞膜的破損，為紅細(xì)胞保存技術(shù)的研究提供了新的方法和依據(jù)。

[1] 李嘉欣，蘇燕.紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)的臨床研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(10):104-107.

[2] 李嘉欣，錢(qián)多，解彩霞，等.維生素C對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37(5):60-62.

[3] 孔令宜,趙桂珍,劉鳳玲,等.紅細(xì)胞MAP[J].中國(guó)輸血雜志，1996，(2):105-107.

[4] Knight JA,Searles DA,Clayton FC.The effect of desferrioxamine on stored erythrocytes:lipid peroxidation,deformability,and morphology[J].Ann Clin Lab Sci,1996,26(4):283-290.

Study of the protective effect of erythrocyte preserve fluid (MAP) on erythrocytes by using hemoglobin release test

LI Jiaxin1, XIE Caixia1, LIU Ruigang2, SU Yan1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularofBaotouMedicalCollege,Baotou014060,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofBaotouMedicalCollege,Baotou014030,China)

To study the protective effect of erythrocyte preserve fluid (mannitol adenine sodium dihydrogen phosphate, MAP) on erythrocytes.Methods: Erythrocyte suspension was divided into control group and MAP group, physiological saline added in the control group and the equal volume of MAP added in the MAP group, both of which were kept at 4 ℃. Hemoglobin releasing test (HRT) was adopted to compare the difference of Hb release at different time in the two reaction groups, and to measure the relative solubility.Results:Hb release in the MAP group was significantly less than that in the control group(P<0.05), and the relative solubility of erythrocyte was significantly lower than that in the control group(P<0.01).Conclusion:Erythrocyte preserve fluid can weaken Hb release, reduce the rate of erythrocyte rupture and protect erythrocyte.

Erythrocyte preserve fluid; Hemoglobin release test (HRT); Physiological saline; Erythrocyte suspension

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160214)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2016MS0801)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZY14265)；內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010056)；包頭市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C2006-16)；秦文斌科技教育基金項(xiàng)目(201309)

蘇 燕

2016-05-10)