馬少華，楊艷麗

（陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安710300）

降解含聚丙烯酰胺采油污水的菌種篩選*

馬少華，楊艷麗

（陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安710300）

生物降解法處理含聚丙烯酰胺（PAM）采油污水具有高效、成本低、環(huán)保等優(yōu)點。本文采用富集培養(yǎng)和平板分離的方法，并結(jié)合初篩和復(fù)篩實驗，以聚丙烯酰胺降解率為指標(biāo)從采油廢水中分離出了具有聚丙烯酰胺降解能力的三株菌株分別編號為4號、8號、11號。

聚丙烯酰胺；采油污水；生物降解

聚丙烯酰胺（PAM）是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的統(tǒng)稱，為線性水溶性高分子，能以各種濃度溶于水，不溶于大多數(shù)有機(jī)溶液[1]。PAM具有良好的吸附、絮凝、增稠作用，廣泛的被應(yīng)用于石油開采、廢水處理、紡織印染、造紙、冶金等行業(yè)。隨著聚丙烯酰胺在三次采油中應(yīng)用技術(shù)的推廣，含聚丙烯酰胺采油污水量也在逐年增加。PAM降解會產(chǎn)生大量的低聚物，低聚物進(jìn)一步降解會產(chǎn)生大量的丙烯酰胺單體，而丙烯酰胺是一種有毒化學(xué)物質(zhì)，對其毒性國內(nèi)外已進(jìn)行大量的研究[2]。由于其良好的水溶性，排入環(huán)境的丙烯酰胺基本上進(jìn)入地表水和地下水中，可以通過皮膚、黏膜、呼吸道和口腔被吸收，廣泛分布在人的體液中，也能進(jìn)入胚胎中，引起中毒。因此，含PAM采油污水的處理已成為油田環(huán)境污染面臨解決的一個重要問題。

據(jù)文獻(xiàn)[3]報道，目前處理含PAM廢水的方法主要物理化學(xué)法和生物降解法。而生物降解法具有高效、成本低、環(huán)保等優(yōu)點，已成為研究的重點。本文主要研究聚丙烯酰胺降解菌的分離、篩選，以聚丙烯酰胺降解率為指標(biāo)從含聚丙烯酰胺的采油廢水中篩選出高效降解聚丙烯酰胺的菌株。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

NaCl（AR）、CaCl2（AR）、（NH4）2·SO4（AR）、KH2PO4（AR）、K2HPO4（AR）、瓊脂（生化試劑）、酵母浸粉（生化試劑）、MgSO4（AR）、蛋白胨（生化試劑）、牛肉浸膏（生化試劑）、聚丙烯酰胺（400萬ppm）。

超凈工作臺；DHP030型恒溫培養(yǎng)箱；TF-1A型生化培養(yǎng)箱；ZDX-35B型座式電熱壓力蒸汽滅菌器；UV-2100型分光光度計；SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器；JA型系列電子精密天平；PHS-3C型數(shù)顯酸度計、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、刮鏟等。

1.2 實驗方法

首先，進(jìn)行樣品的采集，采集到的樣品中微生物的含量不一定很高，需要對其中的微生物進(jìn)行富集，使其大量繁殖。樣品中的微生物種類很多，需要對它們進(jìn)行分離。然后繼續(xù)分離、純化得到純種。再進(jìn)行降解實驗，以聚丙烯酰胺的降解率為指標(biāo)，篩選出能降解聚丙烯酰胺的菌株。圖1是聚丙烯酰胺降解菌的分離和篩選流程圖。

圖1 聚丙烯酰胺降解菌株的分離和篩選流程Fig.1 Isolation and screening process of polyacrylamide degradation strain

1.2.1 實驗樣品來源本實驗所用采油廢水樣品來自勝利油田聚合物驅(qū)采油廢水。

1.2.2 富集培養(yǎng)在無菌操作下，取1mL采油廢水加入到裝有50mL滅菌富集培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，然后在恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)（30℃，120 r· min-1）。待培養(yǎng)液發(fā)生混濁時，用無菌移液管吸取1mL，轉(zhuǎn)接到另一裝有50mL滅菌富集培養(yǎng)基的150mL三角瓶中培養(yǎng)，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3～6次，最后就得到富集培養(yǎng)目的菌占絕對優(yōu)勢的微生物混合培養(yǎng)物。本實驗每次接種后培養(yǎng)約24h，培養(yǎng)基即出現(xiàn)渾濁，再轉(zhuǎn)接到下一富集培養(yǎng)瓶中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。

1.2.3 菌株分離采用平板劃線分離法[4]對聚丙烯降解菌株進(jìn)行分離。將融化并冷至約50℃的培養(yǎng)基在無菌操作下倒入無菌的空培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋，輕輕轉(zhuǎn)動平板，凝固后即成所需的平板。以無菌操作進(jìn)行劃線接種，劃線完畢后，將培養(yǎng)皿蓋好。倒置培養(yǎng)皿于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)觀察結(jié)果。接種環(huán)用過后應(yīng)立即經(jīng)燒灼滅菌才能放于桌面或再進(jìn)行接種操作。

培養(yǎng)48h后，發(fā)現(xiàn)接種平板上有菌落長出。選取菌落濕潤、圓整、表面光滑、邊緣整齊、凸出且個體較大的菌落進(jìn)行二次平板劃線分離，二次平板劃線培養(yǎng)基選用分離培養(yǎng)基。二次平板劃線時，將培養(yǎng)基一分為二并編號。每一半培養(yǎng)基上接種上述具有明顯特征的菌落，共接種11個單菌落，再將接種平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48h后發(fā)現(xiàn)有菌落長出。

1.2.4 菌株篩選將上述經(jīng)平板劃線分離獲得的菌種，培養(yǎng)一段時間后，選擇培養(yǎng)液比較混濁的培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步篩選。找到較混濁的培養(yǎng)基后，采用淀粉-碘化鎘分光光度法測定溶液中聚丙烯酰胺的濃度[5]，以聚丙烯酰胺的降解率為指標(biāo)，篩選出降解能力高的菌株。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚丙烯酰胺降解菌株的分離

觀察樣品富集后的菌液在第二次平板劃線分離時各接種菌落在24h和48h的生長情況。所分離的各菌株在分離培養(yǎng)基上的生長狀況差異較大，選取其中的11株生長較快，且其菌落濕潤、圓整、表面光滑、邊緣整齊、凸出且個體較大的菌落進(jìn)行初篩實驗。

2.2 聚丙烯酰胺降解菌株的篩選

2.2.1 初篩從樣品中分離出的11種菌株中，選取生長旺盛的菌株進(jìn)行初篩實驗。其中將編號為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11號的菌株分別接入到50mL液體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)實驗，接種液置于30℃恒溫?fù)u床（120r·min-1）培養(yǎng)72h。然后目測培養(yǎng)基混濁程度。聚丙烯酰胺降解菌株的初篩實驗結(jié)果見表1。

表1 聚丙烯酰胺降解菌株的初篩實驗結(jié)果Tab.1 Screening results of polyacrylamide degradation strain

由表1可見，3、4、5、8、11號菌株能夠在以聚丙烯酰胺為唯一的碳源，氮源中生長，可以初步判斷這5種菌株具有一定聚丙烯酰胺降解能力。

2.2.2 復(fù)篩將初篩選出的5種菌株分別接種到50mL的液體篩選培養(yǎng)基中，在30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)72h。測定各菌株的培養(yǎng)菌液接種后培養(yǎng)前后聚丙烯酰胺的濃度，計算出聚丙烯酰胺降解率，結(jié)果見表2。

表2 聚丙烯酰胺降解菌株的復(fù)篩實驗結(jié)果Tab.2 Rescreening results of polyacrylamide degradation strain

由表2可見，4#、8#和11#菌株的降解率較高。為了對比這3種菌株，重新對這3種菌株進(jìn)行復(fù)篩實驗（50mL篩選培養(yǎng)基，30℃恒溫?fù)u床，120r·min-1，培養(yǎng)時間為72h），且每種菌株設(shè)3次平行。復(fù)篩對比實驗結(jié)果見表3所示。

表3 聚丙烯酰胺降解菌株的復(fù)篩對比實驗結(jié)果Tab.3 Comparative rescreening results of polyacrylamide degradation strain

由表3可見，3種菌株的平行樣品間聚丙烯酰胺的降解能力有所差別，這主要可能與在接種時采用接種環(huán)直接挑取斜面菌株的接種方法有關(guān)。因為在挑取菌株時，挑取菌量不同，直接導(dǎo)致菌液中的細(xì)菌生長繁殖的程度有所不同，造成各菌株平行樣間的有所差異。三空白樣降解率的差異不大。

由第二次復(fù)篩結(jié)果可見，3種菌株都有一定的聚丙烯酰胺降解能力，可見第一次復(fù)篩選出的4#、8#、11#菌株的確具有能力降解聚丙烯酰胺。

2.3 聚丙烯酰胺降解菌在樣品廢水中的應(yīng)用

將4#，8#，11#菌株菌液接種到50mL樣品來源水中，即勝利油田采油廢水中，在30℃下培養(yǎng)72h，測定采油廢水中聚丙烯酰胺的降解率，平行做3組試驗，實驗結(jié)果見下表4。

表4 采油廢水中聚丙烯酰胺的降解率Tab.4 Polyacrylamide degradation rate of oil production wastewater

由表4可以看出，所篩選的3株聚丙烯酰胺降解菌在采油廢水中都有降解聚丙烯酰胺的能力，但它們的降解率都不高。這與培養(yǎng)基實驗所得結(jié)果相差較大，原因可能是采油廢水中的營養(yǎng)條件與培養(yǎng)基的不同，如礦化度，碳源、氮源等；還有采油廢水中可能有對聚丙烯酰胺降解菌不利的物質(zhì)。

3 結(jié)論

本實驗采用富集培養(yǎng)、平板分離以及初篩和復(fù)篩方法，以聚丙烯酰胺降解率為指標(biāo)從采油廢水中分離出有聚丙烯酰胺降解能力的3種菌株，分別編號為4#、8#、11#。這3種菌株在以聚丙烯酰胺為唯一碳源、氮源的培養(yǎng)基中生長并且具有一定的PAM降解能力。實驗中聚丙烯酰胺降解菌對PAM降解率有20%左右，在實際應(yīng)用上最高才達(dá)到7.8%，比一些資料的50%要低一些。我們在后續(xù)的研究工作中，將重點進(jìn)行以下研究：（1）考察培養(yǎng)時間、pH、溫度等條件對菌株降解能力的影響，優(yōu)化培養(yǎng)條件；（2）對所篩選的菌株進(jìn)行一定的鑒定與分類，并對降解能力做理論研究與優(yōu)化工作。

［1］嚴(yán)瑞瑄.水溶性高分子［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998.84-178.

［2］黃君禮.丙烯酰胺的毒性及其分析方法［J］.環(huán)境科學(xué)叢刊，1991，12（4）：37-43.

［3］溫沁雪，趙曄.油田含聚丙烯酰胺廢水處理研究進(jìn)展［J］.化工環(huán)保，2009,29（1）：39-42.

［4］周群英，高廷耀.環(huán)境工程微生物學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2004.122-132.

［5］田利,鄒明珠,許宏鼎,等.采油污水中部分水解聚丙烯酰胺濃度的測定［J］.吉林大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版）,2003,41（2）:224-227.

Strain screening of degradation of oil production sewage containing polyacrylamide

MA Shao-hua，YANG Yan-li
（Department of Chemical Engineering,Shaanxi Guofang Institute of Technology,Xi'an 710300,China）

The advantage of biodegradable processes used for treatment of polyacrylamide（PAM）contained in oil production sewage is high efficiency,low cost,and environmental protection.In this paper,using enrichment culture and the separation of the plate and,combined with first and second screen experiment,to polyacrylamide degradation rate of oil production from wastewater indicators were isolated with the ability of polyacrylamide degradation of the three bacteria,No.4,8,and 11 respectively.

polyacrylamide；oil production sewage；biodegradable processes

X52

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20161206

2016-09-08

陜西國防工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院研究與開發(fā)項目（Gfy16-37）

馬少華（1986-），女，漢族，河南省許昌市人，講師，碩士，從事石油化工與安全環(huán)保方面研究工作。