張民山,蔡紅星,譚勇,辛敏思,苗馨卉

(長春理工大學,長春 130022)

帕拉米韋三水合物的拉曼光譜計算與分析

張民山,蔡紅星*,譚勇,辛敏思,苗馨卉

(長春理工大學,長春 130022)

為了提供基于拉曼光譜鑒定帕拉米韋三水合物的需要,本文通過微區(qū)拉曼光譜儀檢測了帕拉米韋三水合物標準化學對照品的自然拉曼光譜,利用密度泛函方法計算了兩種帕拉米韋三水合物同分異構體的理論拉曼光譜。提出了特征頻率取樣的拉曼光譜識別函數,并根據實驗結論對理論光譜進行校正,得到了與實驗匹配度較高的帕拉米韋三水合物的理論拉曼光譜。最后分析了實測光譜特征峰位的振動模式。

帕拉米韋三水合物；拉曼光譜；密度泛函；光譜識別

1 引言

禽流感(AVI)于1878年被發(fā)現,1955年被定性為A型流感,至今全球性疫情已多次被確認為由禽流感病毒及其變種引起[1]。神經氨酸酶NA抑制劑不僅適用于治療多種亞型流感[2],同時具有低耐藥性以及較好的患者耐受性等優(yōu)點,因此成為目前預防和治療HXNY型流感最主要的一類藥用物[3]。隨著H7N9禽流感疫情的擴散和傳播,帕拉米韋氯化鈉注射液獲批上市,其主要成分為帕拉米韋三水合物。

帕拉米韋三水合物(Peramivir trihydrat)分子量382.46,分子式為 C15H31N4O7。帕拉米韋具有異戊基團、乙酰氨基、羧基和胍基,能夠與流感病毒NA蛋白活性位點的多個殘基結合且不易解離,強烈抑制了NA活性,阻礙了病毒的擴散,達到預防和治療病癥的作用[4-5]。

近年來,由于劣質、偽造的藥用品在市場上流通,藥品的快速檢測關乎到我們的生命財產安全[6-7]。帕拉米韋的常規(guī)測定采用質譜分析法、液相色譜法[8-11]以及其衍生的X射線衍射法[12]與非水滴定法[13]等方法。由于常規(guī)質檢手段檢測周期長,技術要求高,不便于市場中應急檢驗,而拉曼光譜技術作為一項無損、快速的檢測技術,因其精準、便捷等優(yōu)點在藥品質檢領域得到普遍認同[14-16],已被修訂成檢定原則收入2010年的《中國藥典》[17]。

基于拉曼檢測技術,實現對藥物便捷準確的鑒別,首先需要獲得藥物的特征拉曼頻率。本文通過實驗檢測藥物主要成分帕拉米韋三水合物的拉曼光譜并標識峰位頻率；利用密度泛函方法優(yōu)化結構計算理論拉曼光譜,通過光譜校正辯識,指認了特征拉曼頻率的振動模式,為藥物的快速檢測提供參考依據。

2 實驗測量

實驗樣品：帕拉米韋三水合物(中國食品藥品檢定研究院JQM2-VRHF)；

實驗設備：微區(qū)拉曼光譜儀：TriVista TM-555CRS；光柵：1800 gr/ mm (HVIS)；激光器型號：LE-LS-532 -100TRaman,激光線寬：2 cm-1；物鏡：MPlanFLN -100x/0.90-∞/0/FN26.5；共焦攝像頭：1.3M-Pixel；CCD：PYLON(ID:PYL400BR- -NS-SM-Q-F-S-RU-I),液氮制冷環(huán)境-120 ℃；實驗室墻面反射率<3%,塵埃濃度：3×105(≥0.5m/m3)。

利用激光零波數校零光柵鏡組參數(Offset/nm),校驗標準硅片為520.7 cm-1；首先將3 mg樣品制成壓片,完成微區(qū)載物臺樣品共焦后,檢測帕拉米韋三水合物標準品的自然拉曼,并為了避免積分次數和儀器自身噪音干擾,誤差均在允許范圍(<1像元)。

檢測帕拉米韋三水合物標準化學對照品的自然拉曼,得到200～4000 cm-1范圍內拉曼光譜(曝光時間2 s,積分次數5,單級分辨率0.5 cm-1；三級分辨率0.01 cm-1)并標識拉曼活性峰位,如圖1所示。

Fig.1 Experimental peramivir trihydrate Raman spectrum in the 200～4000 cm-1 spectral range

3 理論計算

帕拉米韋三水合物的兩種同分異構體分子結構圖如圖2,本文中將其記作P1t[18]和P2t[19],其對應的無水結構分別記作P1與P2。

分子表面靜電勢參數與結構的關系被PoIitzer首次提出[20]以后,被廣泛應用于溶液中分子相互作用及分子結構與性質關系的研究中[21-23]。因此,我們參考表面靜電勢構建帕拉米韋三水合物的空間結構。

密度泛函理論具有充分考慮電子相關同時不會顯著提高計算量的優(yōu)點[24],對無水模型初始結構的優(yōu)化使用B3LYP泛函實現,這是一個研究輕元素分子的可靠方法[25-26]。而在處理結晶水合物的分子結構問題時,M062X泛函的精度更為出色[27-29]。已有研究表明,采用6-311+g**基組計算能夠得到帕拉米韋較為合理的結構[30],而水合結構的計算涉及氫鍵作用,因此為了得到更準確的結果,我們在基組中引入了彌散函數[31-32]。

首先構建P1、P2的初始模型,使用B3LYP泛函6-311+g**基組對其進行初步優(yōu)化,并繪制表面靜電勢(圖3)。本文中均使用Gaussian09[33]軟件進行分析。

Fig.2 Peramivir trihydrate molecule of isomers

Fig.3 The surface electrostatic potential of peramivir molecular

圖3中區(qū)域電子密度越低呈現紅越深,電子所處的能級最高,區(qū)域電子密度越高；反之電子所處的能級越低,呈現藍色越深。水中的氧受氫鍵影響,核對孤對電子的束縛減弱,電子疏離致使密度降低,靜電勢呈現紅色。而水分子中的氫原子失去電荷,核對孤對電子束縛增大,電子密度增加,因此靜電勢呈現藍色。圖3中紅色越深表示該位點更容易吸附水分子中的氫原子,藍色越深則表示與水分子中的氧原子親和性越強。因此,我們將水分子吸附在電子密度極值點區(qū)域,構建初始模型,記作P(1,2)t-abc,a、b、c為圖3中區(qū)域標號。

基于M062X泛函6-31++g**基組對不同吸附位點的初始結構進行優(yōu)化處理,結果見表1。根據不同結構間的相對能量,我們確定了最穩(wěn)定的帕拉米韋三水合物中理論結晶水分布,這與文獻[34]報道吻合。隨后基于同樣的方法進行頻率計算,得到了P1t-045、P2t-046結構的理論光譜。

Tab.1 The molecular structure of Peramivir trihydrate optimized (M062X/6-31++g**)

(續(xù)表)

StructureP1t-abcHartree(arb.unit)Relativeenergy(eV)StructureP2t-abcHartree(arb.unit)Relativeenergy(eV)P1t-025-1337.27489650.24P2t-026-1337.26713630.45P1t-034-1337.2784580.14P2t-034-1337.27648550.20P1t-035-1337.26426460.53P2t-036-1337.27870630.14P1t-045-1337.28367350.00P2t-046-1337.28020870.09P1t-123-1337.26765160.44P2t-123-1337.25648440.74P1t-124-1337.25001400.92P2t-124-1337.26848080.41P1t-125-1337.26134040.61P2t-126-1337.26023010.64P1t-134-1337.24657861.01P2t-134-1337.2468721.00P1t-135-1337.26267210.57P2t-136-1337.26454480.52P1t-145-1337.26946830.39P2t-146-1337.27414130.26P1t-234-1337.25943800.66P2t-234-1337.26693310.46P1t-235-1337.26372670.54P2t-236-1337.26464740.52P1t-245-1337.26183310.59P2t-246-1337.27538320.23P1t-345-1337.26765160.44P2t-346-1337.27126890.34SupplementaryCalculationP2t-125-1337.25347390.73P2t-015-1337.26505670.41P2t-145-1337.26613390.38P2t-025-1337.27248400.21P2t-245-1337.26675770.37P2t-045-1337.28009670.10P2t-345-1337.26890280.31P2t-056-1337.27396200.17P2t-456-1337.2800970.10

*The lowest Relative energy structure(P1t-045) as the Zero point energy(0.00 eV)

4 校正分析

校正光譜的過程即光譜差異分析的過程,若將拉曼光譜峰位看成多個振動頻率耦合平滑后的曲線,其相對強度隨波數變化曲線呈正態(tài)分布,即拉曼偏移與相對強度變化率成正比。

(1)

基于這種設想,以相對強度為I0的活性位點為例,通過公式(1)歸一化,即可得到相對于全波段的一個比例關系。若忽略外力場微擾,則可將同一物質的特征拉曼位移的相對峰位強度視為定值,而比例系數的變化則認為是外力場的影響,即檢測環(huán)境的變化或結構的質變。此時,通過計算兩譜線各波數相對強度的殘差,即可得到大致的光譜差異度。但是當拉曼活性位點不為一時,其大程度偏移時簡略的大量取樣可能導致誤判,因此通常采用權重系數。由于拉曼譜線特征頻率的特殊性,因此,我們提出以特征頻率(活性峰位)的平均相對強度殘差平方和為底,取樣數n為指數的冪,簡單計算光譜匹配度M(X)：

(2)

通過公式(2)計算時,可以根據特征拉曼峰位的數目進行單頻或波段的取樣辯識,而取樣的增加也能夠進一步提高光譜辯識的準確度。

M062X泛函中6-31+g**的基組的Fundamentals校正因子為0.940[35],而相近基組的校正因子受到彌散函數影響較小,因此我們采用此修正因子進行校正。結果如圖4(b)所示,在高頻波數區(qū)域具有良好的匹配度,而在低頻區(qū)200～1500 cm-1存在一定的誤差,因此我們選取理論與實驗光譜的特征峰位進行擬合校正。多次在200～1500 cm-1波段取樣計算M(X),取最大M(X)校正系數約為0.967,校正后體現了理論與實驗更優(yōu)秀的對應關系如圖4(a),這將有利于振動譜的指認。同時,P2結構計算光譜與實驗光譜匹配度M(X)更高,符合實際情況。

5 光譜指認

由于弱相互作用,優(yōu)化后的帕拉米韋三水合物分子在C24-N8、C25-N9、C25-N10均形成半鍵(圖5),優(yōu)化結構與波函數均達到穩(wěn)定收斂。

如圖5為帕拉米韋三水合物分子優(yōu)化后空間結構,圖中紅色原子序號1-7為氧原子(O),藍色序號8-11為氮原子(N)；序號12-26為碳原子(C)；未標序號均為氫原子(H);其中序號5、6、7為結晶水上的氧原子(O),鍵能關系為O5-H-N8、O7-H-N11、O6-H-O4,且O7-H-O5之間同樣存在氫鍵。

Fig.4 Comparison between experimental Raman and theoretical Raman

Fig.5 Optimozed geometry peramivir trihydrate(P2t-046) at M062X method 6-31++g**basis set

我們指認了200～3500 cm-1波數區(qū)間中分子極性結構與拉曼活性歸屬。其中,在314.36 cm-1處結晶水上的氫原子(O6-H58)作搖擺振動帶動胍基團扭動,而827.97 cm-1處結晶水另一個氫原子(O6-H57)做搖擺振動,異戊基團(C-C)有輕微扭動。在1041.01 cm-1處異戊基團與乙酰氨基上的碳原子(C-C)做扭擺振動,帶動相應氫原子做扭擺振動,1108.93 cm-1主要為胍基上的氮原子與相應的氫原子(N-H)作扭動振動。在1452.16 cm-1處,異戊基團上的碳原子與相應的氫原子(C-H)形成剪式振動。帕拉米韋三水合物分子標志性的峰值出現在1634.46 cm-1處,胍基上的氮原子與相應的氫原子(N-H)、碳原子(N-C)做剪式振動,相鄰結晶水分子O5、O6、O7也于相對應的氫原子參與剪式振動,而該區(qū)域峰值點主要由于C25-N11存在拉伸振動,產生較強的拉曼活性。而紅外標志峰位在2736.63、3298.91 cm-1處,兩者為理論紅外最強兩點,均有由O7-H-N11與O7-H-O5之間氫原子拉伸振動,且均為一強一弱,前者主要是O7-H-N11,后者主要為O7-H-O5,同時還含有O6-H-O4的拉伸振動,而該波數區(qū)域耦合峰位均由(N-H)或(O-H)的伸縮振動產生。在2881.05、2936.44、2969.33 cm-1處主要為異戊基團(C-H)分子做伸縮振動。

Fig.6 Experimental peramivir trihydrate Raman spectrum in the 200～4000 cm-1 spectral range

6 結論

本文實驗測量了帕拉米韋三水合物在200～4000 cm-1范圍內的特征拉曼頻率；基于密度泛函方法計算確定了帕拉米韋三水合物較為穩(wěn)定的結晶水吸附位點以及相應的理論拉曼光譜。通過提出的特征頻率取樣識別函數校正,得到200～1500 cm-1范圍內的理論光譜校正系數約為0.967。分析兩種異構結構拉曼識別峰位主要在1108.93 cm-1,同時給出了帕拉米韋三水合物314.36 cm-1、1041.01 cm-1、1452.16 cm-1、1634.46 cm-1、2736.63 cm-1、2881.05 cm-1、2936.44 cm-1、2969.33 cm-1與3298.91 cm-1等特征頻率對應的的振動模式。本工作將有利于拉曼檢測技術在醫(yī)藥領域的研究與應用。

致謝

感謝吉林大學超算中心與吉林省計算中心HPC的支持。

[1] Lin Y P,Shaw M,Gregory V,etal. Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses:Relationship between H9N2 and H5N1 human isolates.Proc Natl Acad Sci USA[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(17):9654-9658.

[2] Moscona A.Neuraminidase inhibitors for influenza[J].N Engl J Med,2005,353(13):1363-1373.

[3] Sheu T G,Deyde V M,Okomo-Adhiambo M,etal. Surveillance for neuraminidase inhibitor resistance among human influenza A and B viruses circulating worldwide from 2004 to 2008.[J].Antimicrob Agents Ch,2008,52(9):3284-3292.

[4] Chand P,Kotian P L,Dehghani A,etal.Systematic structure-base design and stereoselective synthesis of novel multisubstituted cyclopentane derivatives with potent antiinfluenza activity[J].J Med Chem,2001,44(25):4379-4392.

[5] 趙麗嘉,王利華,胡雅萍,等.A/B型流感病毒治療藥物——帕拉米韋水合物[J].藥物評價研究,2010:400-406(Zhao Lijia,Wang Lihua,Ya Ping Hu,etal.A / B type influenza virus drugs--Peramivir trihydrate [J].Drug Evaluation Research,2010:400-406).

深圳市佳士科技股份有限公司高級副總裁羅衛(wèi)紅先生、杭州華光焊接新材料股份有限公司董事長金李梅、南京大地水刀股份有限公司技術總監(jiān)蔣鎮(zhèn)漢、伏能士智能設備（上海）有限公司中國技術支持總監(jiān)Gerd Holzschuh分別做了題目為“持續(xù)追求技術發(fā)展 全面打造佳士質量”、“面向綠色智能制造的釬焊技術展望”、“超高壓水射流技術的應用”、“TPS/i-基于焊接工藝和用戶設計的智能平臺”的精彩報告。

[6] 王文杰,韓宏才.當前藥品打假治劣動態(tài)分析[J].中國食品藥品監(jiān)管,2005,11(10):44-45(Wang wenjie,Han hongcai.The current drug dajiazhilie dynamic analysis[J].China Food Drug Administrion,2005,11(10):44-45).

[7] 方來英.藥品安全事故危機與對策的研究(一)[J].中國藥事,2009,23:203-213(Fang Laiying.Chinese Drug Sefety Risk and Crisis Control,Achievement Problems and Solutions[J].Chinese Pharmaceutical Affairs,2009,23:203-213).

[8] 李迎,王莉莉,張振清.衍生化LC-MS/MS測定大鼠血漿中新型抗流感藥物帕拉米韋及其在藥代動力學研究中的應用[J].軍事醫(yī)學,2009,33:539-542(Li Ying,Wang Lili,Zhang Zhengqing.Quantification of peramivir in rat plasma by liquid chromatography/ tandem mass spectrometry employing precolumn derivation and its application in pharmacokinetics[J].Bull Acad Mil Med Sci,2009,33:539-542).

[9] Li Y,Zhang X Z,Zhang Z Q,etal．Quantification of peramivir(a novel anti-influenza drug in human plasma by hydrophilic interaction chromatography/ tandem mass spectrometry[J]．J Chromatogr B,2009,877(1 0)：933-8．

[10] Lindegardha N,Hanpithakpong W,Phakdeeraj A,etal．Development and validation of a high-throughput zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography solid-phase extraction liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of the anti-influenza drug peramivir in plasma[J] Chromatogr A,2008,1215(1-2):145-51．

[11] 晉欣,王志強,杭太俊,等.HPLC法測定帕拉米韋的含量及其有關物質[J].藥學與臨床研究,2013,21(2):140-142(Jin Xin,Wang Zhiqiang,Hang Taijun,etal.Determination of peramivir and its related substances by HPLC [J].Pharmaceutical and clinical Research,2013,21(2):140-142).

[12] 呂麗娟,張村子,蘭靜,等.帕拉米韋及其中間體酯化物結構的X射線衍射分析[J].現代藥物與臨床,2012,27:347-350(Lu Lijuan,Zhang Cunzi,Lan Jing,etal.X-ray diffraction analysis of peramivir and its esterized intermediate[J].Drugs & Clinic,2012,27:347-350).

[13] 姜瑛,呂麗娟,代奕,等.非水滴定法測定帕拉米韋原料藥中帕拉米韋[J].現代藥物與臨床,2013,28:200-202(Jiang Ying,Lv Lijuan,Dai Yi,etal.Determination of peramivir in peramivir bulks drug by nonaqueous titration [J].Drugs & Clinic,2013,28:200-202).

[15] Hargreaves M D,Page K,Munshi T,etal.Analysis of seized drugs using portable Raman spectroscopy in an airport environment—a proof of principle study[J].J Raman Spectrosc,2008,39(7):873-880.

[16] Day J S,Edwards H G M,Dobrowski S A,etal.The detection of drugs of abuse in fingerprints using Raman spectroscopy I:latent fingerprints[J].Spectrochim Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2004,60(3):563-568.

[17] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[ M ].二部.北京:化學工業(yè)出版社,2010(National Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[M].Part 2,2010).

[18] National Center for Biotechnology Information.PubChem Compound Database; CID=11954371,http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/11954371 (accessed May 9,2015).

[19] Sudhakar Babu Y,Chand P,Bantia S,etal.BCX-1812 (RWJ-270201):Discovery of a novel,highly potent,orally active,and selective influenza neuraminidase inhibitor through structure-based drug design[J].J Med Chem,2000,43(19):3482-3486.

[20] Murray J S,Brinck T,Lane P,etal.Statistically-based interaction indices derived from molecular surface electrostatic potentials:a general interaction properties function (GIPF)[J].J Mol Struc-Theochem,1994,307:55-64.

[21] Haeberlein M,Brinck T.Prediction of water-octanol partition coefficients using theoretical descriptors derived from the molecular surface area and the electrostatic potential[J].J Chem Soc,Perkin Trans 2,1997 (2):289-294.

[22] Murray J S,Abu-Awwad F,Politzer P.Prediction of aqueous solvation free energies from properties of solute molecular surface electrostatic potentials[J].J Phys Chem A,1999,103(12):1853-1856.

[23] Hagelin H,Murray J S,Politzer P,etal.Family-independent relationships between computed molecular surface quantities and solute hydrogen bond acidity/basicity and solute-induced methanol O-H infrared frequency shifts[J].Can J Chem,2011,73(4):483-488.

[24] Kohn W,Sham L J.Self-consistent equations including exchange and correlation effects[J].Phys Rev,1965,140(4A):A1133.

[25] Keeffe J R,Scott G,Colvin M E,etal.Identity proton-transfer reactions from C-H,N-H,and O-H acids.An ab initio,DFT,and CPCM-B3LYP aqueous solvent model study.[J].J Am Chem Soc,2003,125(38):11730-11745.

[26] Chéron N,Jacquemin D,Fleurat-Lessard P.A qualitative failure of B3LYP for textbook organic reactions[J].Physical Chemistry Chemical Physics,2012,14(19):7170-7175.

[27] Rayne S,Forest K,Rayne S,etal.Performance of the M062X density functional against the ISOL set of benchmark isomerization energies for large organic molecules[J].Nature Precedings,2010.Doi:10.1038/npre.2010.5183.1

[28] Zhao Y,Truhlar D G.The M06 suite of density functionals for main group thermochemistry,thermochemical kinetics,noncovalent interactions,excited states,and transition elements:two new functionals and systematic testing of four M06-class functionals and 12 other functionals[J].Theor Chem Acc,2008,120(1-3):215-241.

[29] Yan Bingfei,Xiao Cuiping,Li Wenzuo,etal.Density functional theory study on peramivir[J].Journal of Yantai University (Natural Science and Engineering Edition),2015,28(1):18-23.

[30] Markham G D,Glusker J P,Bock C W.The arrangement of first-and second-sphere water molecules in divalent magnesium complexes:Results from molecular orbital and density functional theory and from structural crystallography[J].J Phys Chem B,2002,106(19):5118-5134.

[31] Smets J,Adamowicz L,Maes G.Combined matrix-isolation FT-IR and ab initio 6-31++G** study of H-bonded complexes between water and molecules modelling cytosine or isocytosine[J].Journal of Molecular Structure,1994,322:113-130.

[32] Frisch M J,Trucks G W,Schlegel H B,etal. Gaussian 09(Revision B.01)[CP].Gaussian,Inc.,Wallingford CT,2010.

[33] Keller E,Kr?mer V.Crystal structure of the trihydrate of the neuraminidase inhibitor C15H28N4O4(Peramivir),a potential influenza A/B and avian-influenza (H5N1) drug[J].Zeitschrift Für Naturforschung B,2014,62.

[34] Alecu I M,Zheng J,Zhao Y,etal. Computational thermochemistry:scale factor databases and scale factors for vibrational frequencies obtained from electronic model chemistries[J].J Chem Theory Comput,2010,6(9):2872-2887.

Raman Spectrum Calculation and Analysis of Peramivir Trihydrate

ZHANG Min-shan,CAI Hong-xing*,TAN Yong,XIN Min-si,MIAO Xin-hui

(ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

In order to provide the need for the identification peramivir trihydrate by Raman.In this paper,we used the micro Raman spectrometer to detect the natural Raman spectrum of the standard peramivir trihydrate,we also used density functional theory method optimized two kinds isomers molecular structure and given theoretical Raman spectrum of peramivir trihydrate.We propose a function to recognition Raman spectrum by what their feature frequency determine,through the correction,we obtain a better theoretical spectrum.Finally,the vibration mode of the characteristic peaks of the measured spectra is analyzed.

peramivir trihydrate；density functional theory；Raman spectrum；spectral recognition

2016-02-02; 修改稿日期:2016-03-10

吉林省自然科學基金(201105053)

張民山(1990-),碩士,研究方向：非線性光學.E-mail：Focus_exceed@163.com

蔡紅星(1975-),教授,主要從事光譜技術和生物光子學等方面的研究工作.E-mail：ciomsz@126.com

1004-5929(2016)04-0339-07

O437.3

A

10.13883/j.issn1004-5929.201604010