■王云超 米 軍 劉孟健 趙永紅 朱金珍 姚 峻

(中糧（昌吉）糧油工業(yè)有限公司，新疆昌吉 831100)

目前國內(nèi)大多發(fā)酵棉粕工業(yè)生產(chǎn)受設(shè)備限制，物料經(jīng)常置于發(fā)酵池或呼吸袋內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，其共同的特點為兼性厭氧環(huán)境或絕對厭氧環(huán)境發(fā)酵，所以對發(fā)酵菌種的篩選及配比提出了更加苛刻的要求[1]。通過以往的生產(chǎn)經(jīng)驗，可從芽孢桿菌屬、乳酸菌屬和酵母屬種中分別篩選出優(yōu)良菌株，作為棉粕發(fā)酵的生產(chǎn)菌種，其主要作用分別為降解大分子蛋白、游離棉酚、降低pH值及改善產(chǎn)品風(fēng)味、提高適口性[2-4]。

本章試驗結(jié)合目前流行的固態(tài)兼性厭氧發(fā)酵棉粕工藝，以相對應(yīng)的指標(biāo)分別對9種芽孢桿菌、9種乳酸菌和9種酵母菌進(jìn)行單菌種篩選，得到兼性厭氧高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌、產(chǎn)酸乳酸菌和高效降解游離棉酚酵母菌；隨后對已篩單菌種進(jìn)行正交試驗確定其最佳配比；最后按最優(yōu)配比復(fù)配菌種進(jìn)行棉粕發(fā)酵試驗，檢測樣品相關(guān)指標(biāo)。本試驗為棉粕混合菌種發(fā)酵劑相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌，由中糧（昌吉）糧油工業(yè)有限公司研發(fā)中心提供。

1.1.2 試驗培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏1.0 g/l、氯化鈉0.5 g/l、蛋白胨 1.0 g/l、瓊脂 15.0 g/l，pH 值 7.2，121～126℃滅菌30 min。

乳酸菌培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、酵母浸膏5.0 g/l、葡萄糖5.0 g/l、磷酸氫二鉀2.0 g/l、乙酸鈉 5.0 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、檸檬酸銨 2.0 g/l、硫酸錳0.05 g/l、吐溫80 1.0 g/l、瓊脂20.0 g/l，pH值6.8，121～126℃滅菌30 min。

酵母菌培養(yǎng)基：麥芽浸粉1.0 g/l、葡萄糖1.0 g/l、瓊脂20.0 g/l，在121～126 ℃滅菌30 min。

復(fù)合菌培養(yǎng)基：糖蜜40.0 g/l、蛋白胨10.0 g/l、葡萄糖 1.0 g/l、硫酸鎂 0.2 g/l、磷酸氫二鉀 0.5 g/l，121～126 ℃滅菌30 min[5]。

1.2 試驗方法

1.2.1 單菌種初篩

單菌種的篩選分為初篩和復(fù)篩，均為單因素試驗。單菌種的初篩在相對應(yīng)的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行；單菌種的復(fù)篩在棉粕中進(jìn)行，其棉粕底物的配比為棉粕∶玉米=9.5∶0.5，料水比1∶0.8。細(xì)菌培養(yǎng)條件為：37 ℃、48 h；酵母菌培養(yǎng)條件為：30 ℃、72 h。

其中，高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選指標(biāo)為：產(chǎn)酶性能、粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、小肽含量、活菌總數(shù)、風(fēng)味評分。乳酸菌的篩選指標(biāo)：pH值、有機酸含量、活菌總數(shù)、風(fēng)味評分。酵母菌的篩選指標(biāo)：游離棉酚含量、粗蛋白、酸溶蛋白、風(fēng)味評分。

1.2.1.1 高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌菌種的初篩

分別從待選芽孢桿菌菌種斜面中挑取一環(huán)接種于10 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h作為菌種液。然后將其稀釋至濃度10-7cfu/ml，并吸取100 μl加入酪蛋白篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布。此過程分別制作2組，每組3個重復(fù)，其中一組好氧培養(yǎng)72 h，另一組進(jìn)行厭氧培養(yǎng)72 h，最后檢測其水解圈直徑D（mm）和菌落直徑d（mm）。

1.2.1.2 乳酸菌菌種的初篩

分別從待選乳酸菌菌種斜面中挑取一環(huán)接種于10 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h作為菌種液。然后取1 ml接入200 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，最后檢測pH值、有機酸、活菌數(shù)、發(fā)酵風(fēng)味等指標(biāo)，每組處理3個重復(fù)。

1.2.1.3 酵母菌菌種的初篩

分別從待選酵母菌種斜面中挑取一環(huán)接種于10 ml、0.2%醋酸棉酚YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h作為菌種液。然后分別于0.2%和0.4%的醋酸棉酚YPD固體培養(yǎng)皿上進(jìn)行點種，培養(yǎng)96 h，檢測其菌落生長狀況。菌落最優(yōu)為+++，菌落沒有生長為-，每組處理3個重復(fù)，取其平均值。

1.2.2 單菌種復(fù)篩

將已初篩的菌種進(jìn)行斜面保存。然后分別從菌種斜面挑取一環(huán)接種于10 ml對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中作為菌種液。細(xì)菌培養(yǎng)48 h、真菌培養(yǎng)72 h后，取菌種液5 ml均勻噴灑至500 g棉粕底物中，并按料水比使其物料充分?jǐn)嚢杈鶆颍?0℃固態(tài)厭氧靜止發(fā)酵72 h，最終檢測各樣品對應(yīng)指標(biāo)，每組處理3個重復(fù)。

1.2.3 復(fù)合菌種最優(yōu)配比

復(fù)合菌種配比優(yōu)化為3因素2水平正交試驗。其所選用底物配比為棉粕∶玉米=9.5∶0.5；其中粗蛋白含量為45.81%，料水比1∶0.8，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72 h，固態(tài)厭氧靜置發(fā)酵。

如表1所示，按照此表3因素2水平的正交方案設(shè)計試驗。將已篩選出的菌種按計劃表進(jìn)行復(fù)配，使各組復(fù)配菌種液分別與無菌水按比例混勻，接入2 kg底物中，30℃固態(tài)厭氧靜止發(fā)酵72 h，最終測其各項指標(biāo)。

表1 復(fù)配菌種比例正交方案設(shè)計

1.3 指標(biāo)檢測

粗蛋白含量測定：參照GB/T5009.5-1985的方法進(jìn)行；酸溶蛋白含量測定：參照QB/T2653-2004的方法進(jìn)行；有機酸含量測定：參照GB/T5009.157-2003的方法進(jìn)行；小肽含量測定：參照GB/T 22492-2008的方法進(jìn)行；pH值：采用pH酸度計進(jìn)行測定；活菌總數(shù)：參照GB13093-91的方法進(jìn)行[6]；游離棉酚含量：參照GB/T 5009.148-2003的方法進(jìn)行；菌落生長情況測定：菌落生長情況采用工具測量菌落直徑，每個培養(yǎng)皿所有菌落測量取平均值，菌落直徑超過2 cm記做“+++”，菌落直徑在1～2 cm記做“++”，菌落直徑在0～1 cm記做“+”，沒有菌落生長記做“-”；

風(fēng)味評分方法：風(fēng)味評分的測定采用-5至5分制，-5分為刺鼻惡臭難以接受、5分為酸香適宜風(fēng)味令人愉快。評分人員選用10名具有相關(guān)風(fēng)味評價經(jīng)驗人員，每人評分后取平均值[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Office EXCEL初步整理數(shù)據(jù)及SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著；數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌的篩選

2.1.1 兼性厭氧芽孢桿菌的篩選

表2、表3分別為有氧與厭氧條件下不同芽孢桿菌菌種的菌落直徑與酪素水解圈的大小情況。表2可見，在有氧培養(yǎng)條件下，3種芽孢桿菌均較好生長并能產(chǎn)生抑菌圈，其中KC-1、KC-2、LZ-2、LZ-3的透明圈直徑達(dá)到了10 mm以上，且直徑比（D/d）達(dá)到了3.0以上，表現(xiàn)出較好產(chǎn)蛋白酶特性；在厭氧厭氧培養(yǎng)條件下，只有KC-1、KC-2、LZ-2、DY-3出現(xiàn)菌落生長，其中KC-1與LZ-2的透明圈直徑達(dá)到了10 mm以上，且直徑比（D/d）達(dá)到了4.5以上，表現(xiàn)出較強的厭氧環(huán)境生長能力，說明2種芽孢桿菌在厭氧條件下產(chǎn)蛋白酶特性良好。綜上所述，KC-1與LZ-2在有氧和厭氧條件下均能較好生長并有相似產(chǎn)酶特性，將其作為復(fù)篩菌種。

表2 初篩芽孢桿菌菌種好氧培養(yǎng)結(jié)果

表3 初篩芽孢桿菌菌種厭氧培養(yǎng)結(jié)果

表4為KC-1與LZ-2的復(fù)篩結(jié)果。表4可見，KC-1發(fā)酵底物的4項指標(biāo)與對照組相比均差異顯著(P＜0.05)，并且經(jīng)KC-1發(fā)酵的底物中粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、小肽含量及活菌總數(shù)均高于LZ-2，其中兩試驗組中的酸溶蛋白含量及活菌總數(shù)差異顯著。由此可以看出，在厭氧發(fā)酵條件下，KC-1產(chǎn)出的蛋白酶更適合棉粕高分子蛋白的水解，形成更多的低分子酸溶蛋白，并且其自身所需營養(yǎng)物質(zhì)和代謝水平較低。從發(fā)酵后底物的風(fēng)味來看，雖然兩種芽孢桿菌均產(chǎn)生了類似揮發(fā)性氨類、硫化氫類等不愉快的揮發(fā)性物質(zhì)，但KC-1的風(fēng)味評價優(yōu)于LZ-2，對發(fā)酵棉粕風(fēng)味影響較小。在復(fù)篩試驗中發(fā)現(xiàn)，LZ-2發(fā)酵后的棉粕出現(xiàn)粘黏、粘絲的情況，這對后續(xù)的產(chǎn)品工藝造成不利影響。綜上所述，KC-1作為兼性厭氧芽孢桿菌的篩選菌種。

表4 復(fù)篩芽孢桿菌菌種固態(tài)厭氧發(fā)酵樣品結(jié)果

2.1.2 產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

表5為乳酸菌屬的初篩結(jié)果。如表所示，從產(chǎn)酸性能上看，ZR-1、ZR-2、ZR-3總體的產(chǎn)酸性能高，有機酸均達(dá)到2.5%以上，pH值在3.2～3.51之間，使得發(fā)酵條件pH值過低、酸度過高；BR-1、BR-2、BR-3總體的產(chǎn)酸性能低，有機酸含量均在2.0%以下，pH值在4.38以上，不能滿足菌種產(chǎn)酸要求；SS-1、SS-2、SS-3總體產(chǎn)酸性能居中，有機酸含量和pH值分別介于2.0%～2.2%和3.42%～3.65%之間，可以滿足菌種產(chǎn)酸要求。從風(fēng)味評分上來，雖然ZR的產(chǎn)酸性能高，但其代謝產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)酸味刺鼻，令人不快，菌種不能達(dá)到改善產(chǎn)品風(fēng)味的要求；而BR的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)酸香適中，能感受到菌種發(fā)酵后的揮發(fā)性酯類物質(zhì)；SS的pH值指標(biāo)適中，并且其揮發(fā)性風(fēng)味有輕微酯香，風(fēng)味柔和不刺鼻，菌種可以達(dá)到改善產(chǎn)品風(fēng)味的要求。因此初篩菌種為SS-1、SS-2、SS-3。

表6為乳酸菌的復(fù)篩結(jié)果。從產(chǎn)酸性能上說，SS-1、SS-2、SS-3的有機酸含量都為1%～2%，其中SS-1有機酸含量最高，為1.73%，SS-3有機酸含量最低，為1.26%，SS-2的有機酸含量居中，為1.62%，此三組差異不顯著，均能滿足菌種產(chǎn)酸要求；從活菌總數(shù)來說，發(fā)酵后SS-2的活菌數(shù)最高，為4.95×108cfu/g、SS-3的活菌數(shù)最低，為9.58×107cfu/g，3組的活菌總數(shù)差異不顯著；從風(fēng)味評分來說，3種乳酸菌風(fēng)味相差不大，但SS-1有輕微的刺鼻性揮發(fā)性酸，SS-3揮發(fā)性酸味較低，SS-2具有明顯的揮發(fā)性酸香，適合底物風(fēng)味物質(zhì)的呈現(xiàn)。綜上所述，由三組試驗結(jié)果相比，SS-2的產(chǎn)酸性能居中，在活菌總數(shù)和揮發(fā)性風(fēng)味上優(yōu)于SS-1、SS-3，因此將SS-2作為乳酸菌的篩選菌種。

表5 初篩乳酸菌菌種液體靜置培養(yǎng)結(jié)果

表6 復(fù)篩乳酸菌菌種固態(tài)發(fā)酵樣品結(jié)果

2.1.3 高效降解游離棉酚酵母菌的篩選

表7為高效降解游離棉酚酵母菌的篩選結(jié)果。如表所示JS-1、JS-2、JS-3在0.2%和0.4%醋酸棉酚YPD篩選培養(yǎng)基上都有良好的生長性能，說明棉酚對其生長的抑制較小，脫酚能力較強；NJ-2、NJ-3、PJ-2雖然能在0.4%醋酸棉酚YPD篩選培養(yǎng)基有所生長，但單菌落直徑較小、菌落形態(tài)不規(guī)則，說明棉酚對其生長的抑制較大，脫酚能力不強。NJ-1、PJ-1、PJ-3在0.4%醋酸棉酚YPD篩選培養(yǎng)基上沒有生長，不能做作為降解游離棉酚的酵母菌種。

表7 醋酸棉酚YPD固體培養(yǎng)基篩選菌種生長情況

表8為復(fù)篩酵母菌菌種固態(tài)發(fā)酵樣品結(jié)果。從游離棉酚含量來看，7個樣品均低于對照組，說明7種酵母菌菌種均有降解游離棉酚的能力，其中JS-1的降解能力最高，物料發(fā)酵后其游離棉酚含量為370.18 mg/kg，除JS-3以外，顯著低于其他組；從粗蛋白含量來看，發(fā)酵后JS-1和PJ-2的含量較高，分別為48.62%和48.74%，除PJ-1以外，顯著高于其他組；從酸溶蛋白含量來看，JS-1的含量最高，為12.80%，顯著高于其他組；從風(fēng)味評分來看，JS-1、NJ-2、PJ-1、PJ-2的風(fēng)味較好，均在3分以上，均有明顯的醇和酯的揮發(fā)性風(fēng)味，可以達(dá)到改善產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味的效果。綜上所述，雖然JS-3和PJ-1分別在降解游離棉酚和提高粗蛋白含量的效果較強，但降解棉粕中大分子蛋白的性能較低；JS-1降解游離棉酚性能最強，且其他指標(biāo)均能滿足發(fā)酵需要。綜上所述，確定JS-1作為發(fā)酵棉粕的酵母菌種。

表8 復(fù)篩酵母菌固態(tài)發(fā)酵樣品檢測結(jié)果

2.2 復(fù)配菌種最優(yōu)配比確定

表9為復(fù)配菌種配比正交試驗結(jié)果表，通過表1的3因素2水平試驗設(shè)計，分別測定了各組的游離棉酚、酸溶蛋白、有機酸、活菌數(shù)和風(fēng)味指標(biāo)，通過綜合分析來確定復(fù)配菌種最優(yōu)配比。

分析游離棉酚指標(biāo)，影響其指標(biāo)的因素從大到小依次為KC-1＞JS-1＞SS-2，最佳配比方案為：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2，即按此比例復(fù)配菌種發(fā)酵棉粕后游離棉酚含量最低；分析酸溶蛋白指標(biāo)，影響其指標(biāo)的因素從大到小依次為KC-1＞SS-2＞JS-1，最佳配比方案為：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2，即按此比例復(fù)配菌種發(fā)酵棉粕酸溶蛋白含量最高；分析有機酸指標(biāo)，影響其指標(biāo)的因素從大到小依次為SS-2＞KC-1＞JS-1，最佳配比方案為：KC-1∶SS-2∶JS-1=1∶2∶2，即按此比例復(fù)配菌種發(fā)酵棉粕有機酸含量最高；分析活菌數(shù)指標(biāo)，響其指標(biāo)的因素從大到小依次為SS-2＞KC-1＞JS-1，最佳配比方案為：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2，即按此比例復(fù)配菌種發(fā)酵棉粕活菌總數(shù)最高；分析風(fēng)味指標(biāo)，影響其指標(biāo)的因素從大到小依次為SS-2＞KC-1＞JS-1，其最佳配比方案為：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2。

表9 復(fù)配菌種配比正交試驗結(jié)果（3因素2水平）

通過有機酸和活菌數(shù)指標(biāo)分析，由于底物是通過厭氧的條件發(fā)酵，有利于乳酸菌的生長，此條件不僅會產(chǎn)生過多有機酸影響產(chǎn)品風(fēng)味，還會過快降低發(fā)酵環(huán)境pH值，抑制芽孢桿菌特別是酵母菌的生長，所以有機酸并不是越高越好，影響有機酸的最大因素為乳酸菌，所以為了適當(dāng)降低有機酸含量，可適當(dāng)降低乳酸菌比例。通過發(fā)酵棉粕最重要的游離棉酚指標(biāo)、酸溶蛋白指標(biāo)及風(fēng)味指標(biāo)綜合分析，棉粕發(fā)酵的最優(yōu)復(fù)合菌種配比即為：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2。

2.3 復(fù)配菌種棉粕固態(tài)發(fā)酵樣品主要指標(biāo)檢測

通過按最佳配比的復(fù)配菌種對棉粕進(jìn)行固態(tài)厭氧發(fā)酵后，如表10所示，主要指標(biāo)分別為：游離棉酚含量213.36 mg/kg、粗蛋白含量48.21%、酸溶蛋白含量13.40%、小肽含量5.60%、有機酸含量1.68%、pH值4.84、活菌數(shù)8.20×108cfu/g，發(fā)酵風(fēng)味酸香適宜令人愉悅，其發(fā)酵棉粕各項指標(biāo)均較理想。

表10 復(fù)配菌種的棉粕固態(tài)發(fā)酵樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗結(jié)合目前流行的固態(tài)兼性厭氧發(fā)酵棉粕工藝，以相對應(yīng)的指標(biāo)分別對9種芽孢桿菌、9種乳酸菌和9種酵母菌進(jìn)行篩選，隨后對已篩菌種進(jìn)行正交試驗確定其最佳配比，最后按最優(yōu)配比復(fù)配菌種進(jìn)行棉粕發(fā)酵小試，檢測其相關(guān)指標(biāo)。試驗結(jié)果：①單菌種篩選出芽孢桿菌KC-1、乳酸菌SS-2、酵母菌JS-1作為復(fù)配菌種。②復(fù)配菌種最佳配比為：KC-1∶SS-2∶JS-1=2∶1∶2。③按最優(yōu)配比復(fù)配菌種發(fā)酵棉粕后的主要指標(biāo)分別為：游離棉酚含量213.36 mg/kg、粗蛋白含量48.21%、酸溶蛋白含量13.40%、小肽含量5.60%、有機酸含量1.68%、pH值4.84、活菌數(shù)8.20×108cfu/g、發(fā)酵風(fēng)味酸香適宜令人愉悅，各項指標(biāo)均較為理想。