郭 岑 ， 鄭 宇 ， 魏成威 ， 王 浩 ， 李麗娜 ，張一鳴 ， 王宇鑫 ， 李欣然 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

咪達唑侖對山羊不同腦區(qū)cAMP含量的影響

郭 岑 ， 鄭 宇 ， 魏成威 ， 王 浩 ， 李麗娜 ，張一鳴 ， 王宇鑫 ， 李欣然 ， 高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

研究咪達唑侖對山羊不同腦區(qū)cAMP含量的影響，探討其在中樞麻醉中的作用機制。試驗用15只健康山羊，3只為生理鹽水對照組，其余為試驗組，試驗組山羊肌肉注射14mg/kg體重咪達唑侖。分別在給藥后誘導(dǎo)期、麻醉期、恢復(fù)1期和恢復(fù)2期4個時間點，每個給藥點剖殺3只山羊取腦組織，并采用ELISA測定不同腦區(qū)cAMP含量。注射咪達唑侖后，山羊大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP含量顯著升高，恢復(fù)2期上述腦區(qū)內(nèi)cAMP含量均恢復(fù)到正常水平，這種變化趨勢與山羊肌肉注射咪達唑侖麻醉后行為學(xué)變化基本一致。表明咪達唑侖的麻醉作用可能與激活山羊各個腦區(qū)內(nèi)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。

咪達唑侖 ； cAMP ； 山羊

咪達唑侖(Midazolam、Dormicum)是苯二氮卓類麻醉劑，具有鎮(zhèn)靜、安眠、抗焦慮、肌肉松弛作用[1]。但其麻醉輔助藥物對中樞作用機制目前還沒有系統(tǒng)的研究。cAMP 作為第二信使，具有調(diào)控細胞基因和蛋白表達的重要功能[2]，腺苷酸環(huán)化酶(AC)在接收胞外信號跨膜抵達胞內(nèi)時，在Mg2+存在時，環(huán)化ATP 轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP 激活蛋白激酶(PKA)磷酸化目標(biāo)蛋白或使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，進而使細胞內(nèi)各項生理生化反應(yīng)被激活。近些年，許多試驗數(shù)據(jù)逐步證實cAMP 信號通路在麻醉過程中發(fā)揮著相應(yīng)的關(guān)聯(lián)作用。有報道證實，噻環(huán)乙胺麻醉可顯著提高大鼠的丘腦和大腦皮質(zhì)內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，增加cAMP 的含量[3-4]。唐蘇紅等[5]人用丙泊酚麻醉大鼠，測定麻醉各時期腦干、海馬以及大腦皮層內(nèi)cAMP 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在麻醉期，大鼠各腦區(qū)的cAMP 含量明顯升高，而恢復(fù)期cAMP 含量則呈下降趨勢，逐步回歸正常水平，從而推測大鼠腦干、海馬以及大腦皮層的cAMP 含量變化可能是丙泊酚引發(fā)中樞抑制作用的原因之一。此外，李平萍等[6]人使用氯胺酮、依托咪酯、咪達唑侖、異氟烷等藥物做類似研究，都得出了麻醉期相關(guān)腦區(qū)cAMP 含量升高的結(jié)果，說明動物麻醉可能伴隨相應(yīng)腦區(qū)cAMP的含量變化。試驗設(shè)計研究咪達唑侖對山羊各個腦區(qū)cAMP含量的影響，利用山羊研究該藥的麻醉中樞作用機制，以探討咪達唑侖對山羊麻醉的中樞作用機制及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要作用位點，為今后該藥物在反芻動物臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗用品

1.1.1 試驗動物 八月齡健康山羊15只(購自哈爾濱郊區(qū)養(yǎng)殖戶，醫(yī)學(xué)檢查健康)，體重13～15 kg，雌雄兼用，試驗前在動物舍喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。試驗前12 h禁食禁水。

1.1.2 儀器和藥品 AvantiTM30Centrifuge高速冷凍離心機(Japanese Beckman Company；BioTek EpochTM)；多體積分光光度計(美國伯騰儀器有限公司)。咪達唑侖注射液，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供；山羊cAMP測定試劑盒，購自美國R&D systems公司。

1.2 動物分組及樣品采取 15只山羊隨機分為兩組：對照組(生理鹽水組)3只、麻醉誘導(dǎo)組(注藥后5 min)、麻醉組(翻正反射消失)、恢復(fù)1組(翻正反射恢復(fù)時)、恢復(fù)2組(翻正反射恢復(fù)后6 h)4個時間點每個時間點3只。對照組與麻醉組分別肌肉注射生理鹽水1.5 mL/kg體重，咪達唑侖14 mg/kg體重，并于各時間點處死開顱，取腦組織，用4 ℃生理鹽水沖凈腦組織血液，置于冰面上迅速分取雙側(cè)大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬。稱重后按1∶9(W/V)置入預(yù)冷的生理鹽水溶液中勻漿，然后 -4 ℃ 高速離心10 min(3 000 r/min)，取上清液。行為學(xué)變化按照師銘咸等[7]所述標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.3 檢測方法 采用ELISA方法檢測樣品中cAMP含量。上步所采取的樣品按照所用ELISA試劑盒要求進行進一步處理后，用ELISA方法檢測各樣品中cAMP含量。

2 試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS13.0for Windows數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件，對數(shù)據(jù)進行一維方差分析，兩變量間簡單相關(guān)分析采用直線相關(guān)回歸分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。應(yīng)用Microsoft Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進行作圖。

3 試驗結(jié)果與分析

咪達唑侖麻醉下山羊行為學(xué)變化 注藥后山羊表現(xiàn)如下：逐漸安靜，行動遲緩、共濟失調(diào)、趴臥不動，最后翻正反射消失。測定翻正反射消失所用平均時間為8.46±2.67 min。在麻醉期間，山羊雙目半閉，眼球向內(nèi)下方翻轉(zhuǎn)，對光反射存在。眼瞼反射、角膜反射明顯減弱，肛門反射存在，較少出現(xiàn)流涎。翻正反射恢復(fù)的平均時間為45.68±4.52 min。

如表1所示，注射咪達唑侖后，山羊大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP濃度都明顯增高。誘導(dǎo)期大腦皮層、海馬、丘腦和腦干內(nèi)cAMP濃度與對照組比較，分別增高17.8%(P<0.01)、23.1%(P<0.01)81.6%(P<0.01)、5.3%(P>0.05)和5.4%(P>0.05)，差異不顯著或極顯著。麻醉期大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干內(nèi)cAMP濃度與對照組比較，分別增高24.0%、35.6%、92.4%、25.8%和14.0%，均差異極顯著。恢復(fù)1期各個腦區(qū)cAMP濃度雖有不同程度的降低，但與對照組比較，分別增高14.4%(P<0.05)、20.6%(P<0.01)、46.6%(P<0.01)、15.2%(P<0.01)和 10.9%(P<0.01)差異顯著或極顯著。恢復(fù)2期上述腦區(qū)cAMP濃度，恢復(fù)到正常水平。山羊各個腦區(qū)cAMP含量變化趨勢與山羊行為學(xué)變化呈現(xiàn)一定規(guī)律性。

4 討論

cAMP普遍存在于細胞內(nèi)，是一種重要的第二信使。細胞內(nèi)，活化的腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化胞漿中的ATP脫去一個焦磷酸產(chǎn)生cAMP，cAMP進一步激活細胞中的蛋白激酶(PKA)，介導(dǎo)靶蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)細胞的生理反應(yīng)。cAMP還可通過PKA調(diào)節(jié)與麻醉有關(guān)的受體(如NMDA受體、GABA受體等)和通道(如鈉離子通道)從而影響突觸的興奮傳遞。cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可，通過PKA使鈉通道蛋白質(zhì)磷酸化，減少鈉離子內(nèi)流，減弱神經(jīng)元之間的興奮傳遞，從而使機體產(chǎn)生麻醉反應(yīng)[3]。

表1 咪達唑侖麻醉對山羊不同腦區(qū)cAMP濃度的影響 (單位：nmol/mL)

a：**：與對照組比較P<0.01，差異極顯著；*：與對照組比較P<0.05，差異顯著

b：▲▲：與麻醉期比較P<0.01，差異極顯著；▲：與對照組比較P<0.05，差異顯著

郁麗娜等(2001)研究發(fā)現(xiàn)，咪達唑侖對異丙酚引起小鼠不同程度大腦皮質(zhì)cAMP含量變化無明顯影響，但在小鼠翻正反射消失這一時點，咪達唑侖和異丙酚組小鼠大腦皮質(zhì)cAMP含量與生理鹽水組和異丙酚組相比，增加15.8%，有增加趨勢[8]。這與本試驗的結(jié)果有相似之處，表明咪達唑侖通過激活神經(jīng)細胞的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生抑制性神經(jīng)調(diào)節(jié)。Cao等(2005)預(yù)先給大鼠使用咪達唑侖，可抑制嗎啡戒斷大鼠脊髓Fos蛋白表達，也間接證明本試驗結(jié)果的正確性[9]。

本試驗結(jié)果表明，咪達唑侖麻醉過程中，誘導(dǎo)期山羊各個腦區(qū)內(nèi)cAMP含量均明顯升高，麻醉期上述腦區(qū)內(nèi)cAMP含量均極顯著高于對照組。在恢復(fù)1期，大腦皮層、海馬和腦干內(nèi)cAMP含量有明顯升高，在翻正反射恢復(fù)并能自由走動后，各腦區(qū)cAMP的濃度均有所降低，基本恢復(fù)到正常水平，這種變化趨勢與山羊行為學(xué)變化相平行。分析試驗結(jié)果推斷，山羊各個腦區(qū)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能參與咪達唑侖全麻分子機理的調(diào)控，且咪達唑侖全麻作用可能與激活上述腦區(qū)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。另一方面，咪達唑侖能夠直接作用于GABAA受體的苯二氮位點，修飾GABAA受體的活動(控制Cl_通道)。兩者之間可能存在協(xié)同作用。Juan-Fita等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用地西泮能增強多巴胺刺激大鼠心肌產(chǎn)生cAMP的作用，這一效應(yīng)不能由苯二氮卓類受體誘導(dǎo)，可能是地西泮抑制PDE同工酶4活性的結(jié)果[10]。咪達唑侖同為苯二氮卓類麻醉劑，是否通過相同的機制對cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生作用，還需要進一步的研究。

5 結(jié)論

本研究表明，cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能參與了咪達唑侖全麻分子機理的調(diào)控。咪達唑侖的全麻作用可能與激活山羊各個腦區(qū)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。

[1] 華盼金.咪達唑侖不同給藥方式治療兒童急性驚厥療效觀察[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，17(25)：151-152.

[2] 馮昌棟，楊建平，戴體俊.七氟烷吸入麻醉對大鼠腦內(nèi)cAMP含量的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24(12)：1678-1679.

[3] Joseph R R.Prostaglandins and activation of AC/cAMP prevents anoikis in IEC-18[J].Apoptosis，2005，10(6)：1221-1233.

[4] Seo J J，Lee J W，Lee W K，etal.Inhibitory effects of ginseng total saponin on up-regulation of cAMP pathway induced by repeated administration of morphine[J].Archives of Pharmacal Research，2008，31(2)：167-170.

[5] 唐蘇紅，馮昌棟.丙泊酚對大鼠腦內(nèi)cAMP含量的影響[J].中國民康醫(yī)學(xué)，2009，21(20)：2463.

[6] 李平萍，李士云，李彥東，等.氯胺酮對大鼠皮層和丘腦cAMP含量的影響[J].山東醫(yī)藥，2002，42(31)：14-15.

[7] 師銘咸，劉子睿，張宇，等.咪達唑侖對山羊不同腦區(qū)NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2015，35(1)：109-111.

[8] 郁麗娜，段世明，王鈞，等.咪達唑侖和氟馬西尼對異丙酚麻醉小鼠大腦皮質(zhì)環(huán)腺苷酸含量的影響[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，21(5)：347-349.DOI：10.3969/j.issn.1000-2065.2001.05.002.

[9] Cao J L，Ding H L，He J H，etal.The spinal nitric oxide involved in the inhibitory effect of midazolam on morphine-induced analgesia tolerance[J].Pharmacology，Biochemistry and Behavior，2005，80：493-503.

[10] Juan-Fita M J，Vargas M L，Hernández J.Diazepam Enhances Inotropic Responses to Dopamine in Rat Ventricular Myocardium[J].Anesthesia & Analgesia，2006，102(3)：676-681.

Effect of midazolam on cAMP content in different encephalic regions of goats

GUO Cen ， ZHENG Yu ， WEI Cheng-wei ， WANG Hao ， LI Li-na ， ZHANG Yi-ming ，WANG Yu-xin ， LI Xin-ran ， GAO Li

(College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To study the effect of midazolam on cAMP content in different encephalic regions of goats and to explore its central mechanism，we used 15 healthy goats with three of them as saline control group and the rest as experimental group.The goats in experimental group were intramuscularly injected with 14 mg/kg midazolam.Goats in experimental group were executed respectively in induction period，anesthesia period，recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II after induction and the brain tissues were taken immediately.CAMP content was measured by ELISA in different brain areas.The results showed that the cAMP content in cerebrum，hippocamp，thalamus，cerebellum and brainstem was significantly increased and was restored to normal levels in recovery-form-anesthesia period I and recovery-form-anesthesia period II.This trend was consistent with behavioral change of goats after midazolam anesthesia.The anesthesia effect of midazolam may be related to activating the cAMP signal transduction system in various encephalic regions of goats.

midazolam ； cAMP ； goat

GAO Li

2015-10-21

國家自然科學(xué)基金面上項目(31372491，31572580)

郭岑(1992-)，女，碩士生，從事獸醫(yī)麻醉研究工作，E-mail：554892820@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S859.791

A

0529-6005(2016)11-0115-03