韓美玉, 李 蕊, 金慧然, 關(guān)舒函, 李 睿, 張秀英

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 , 黑龍江哈爾濱150030 ； 2.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所 , 黑龍江哈爾濱150069)

黑龍江省豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測及風(fēng)險評估

韓美玉1, 2, 李 蕊2, 金慧然2, 關(guān)舒函1, 李 睿1, 張秀英1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 , 黑龍江哈爾濱150030 ； 2.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所 , 黑龍江哈爾濱150069)

本文用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對2015年3-10月在黑龍江省8個市、 縣的超市、 屠宰場、 農(nóng)貿(mào)市場隨機采集的245份豬肉中3種四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、 土霉素、 金霉素)的殘留水平進行了檢測， 在此基礎(chǔ)上對黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的殘留風(fēng)險進行了評估。 結(jié)果顯示， 在黑龍江省8個市縣抽檢的245份豬肉樣本中未檢出四霉素和土霉素的殘留， 金霉素的檢出率為2.85%， 金霉素殘留范圍為12.80 μg/kg～24.50 μg/kg， 均值為18.48 μg/kg， 未超過國家規(guī)定的最高殘留限量(100 μg/kg)；金霉素是該批次抽檢的豬肉樣品中殘留的主要四環(huán)素類藥物； 黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的食品安全指數(shù)均值為10.22×10-3， 最小值為7.11×10-3， 最大值為13.61×10-3， 遠遠低于1， 表明黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的殘留對人體的潛在危害水平是可以接受的， 不會對人群產(chǎn)生不良作用。

豬肉 ； 四環(huán)素類藥物 ； 殘留檢測 ； 風(fēng)險評估

四環(huán)素類(Tetracyclines，TCs)是由鏈霉菌產(chǎn)生或經(jīng)半合成精制的一類堿性的廣譜抗生素，屬于抑菌劑，抗菌譜包括革蘭陽性菌和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體[1]。其作用機制主要是通過阻止氨?；c核糖核蛋白體的結(jié)合，阻止肽鏈的增長和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細菌的生長，高濃度時也有殺菌作用。常見的TCs包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素[2]。可用于畜禽疾病的預(yù)防和治療或者作為飼料添加劑來促進畜禽生長，但是由于一些養(yǎng)殖戶對該類藥物的不合理使用或濫用會導(dǎo)致動物性食品中殘留問題，對人類健康造成影響，而且更加嚴重的是在畜禽產(chǎn)品中殘留較低濃度的四環(huán)素類藥物容易誘導(dǎo)各種致病菌產(chǎn)生耐藥性，不利于對人類和動物疾病的治療[3]。為此，我國和歐盟等國際組織規(guī)定所有可食用動物肌肉組織中四環(huán)素、土霉素和金霉素的最高殘留限量為100 μg/kg。因此，檢測和分析畜禽產(chǎn)品中土霉素、金霉素和四環(huán)素的殘留是十分必要的。

本研究以黑龍江省為研究區(qū)域，隨機抽檢省內(nèi)8個市、縣共計245份豬肉樣本，對這些豬肉樣本中四環(huán)素類藥物的殘留水平及風(fēng)險水平進行研究，目的是為引導(dǎo)消費和科學(xué)監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支撐和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 材料來源 于2015年3月-10月，以黑龍江省8個市、縣(哈爾濱市，齊齊哈爾市，佳木斯市，大慶市，雞西市，牡丹江市，阿城區(qū)，賓縣)作為采樣區(qū)域，每個區(qū)域內(nèi)隨機選擇超市、農(nóng)貿(mào)市場以及屠宰場作為采樣點進行豬肉樣品采集，每份豬肉樣品500 g左右，共計采集245份。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 甲酸、乙腈為色譜純(Fisher公司)；甲酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純(天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；試驗用水為一級水。四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：四環(huán)素、金霉素、土霉素(含量大于99.0%，德國Dr.EhrenstorferGmbH公司生產(chǎn))。

1.2.2 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧、離子源，型號為WatersAcquityUPLC-AcquityTQD)，美國Waters公司；固相萃取裝置(型號：5982-9124)，美國安捷倫公司生產(chǎn)；均質(zhì)機(型號：AM-9)，上海季諾科貿(mào)有限公司生產(chǎn)；高速離心機，德國Biofuge公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司生產(chǎn)；氮氣吹干儀(型號：OA-SYS)，美國Organomation公司生產(chǎn)；渦旋振蕩器(型號：VX-Ⅲ)，北京踏錦科技有限公司生產(chǎn)；電子分析天平(型號：AE-249)，梅特勒儀器(上海)有限公司生產(chǎn)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 (1)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取四環(huán)素、金霉素、土霉素標(biāo)準(zhǔn)品共10 mg，用甲醇溶解在100 mL容量瓶并定容至刻度，配制成濃度100.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-20℃冰箱中保存，有效期為1個月；(2)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 mL，用甲醇-水(3+7，V/V)溶液稀釋在100 mL容量瓶并定容至100 mL，配置成濃度為10.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 樣品前處理 樣品前處理按農(nóng)業(yè)部1025號公告-12-2008《雞肉、豬肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》對豬肉樣品中的四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素)進行萃取和凈化[4]。

2.2 檢測方法 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對待測樣本進行檢測[5]。

2.2.1 儀器條件 色譜條件：超高效液相色譜的色譜柱為WatersBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)。流動相A為0.3%甲酸乙腈溶液；B為0.3%甲酸水溶液，柱溫為20 ℃，流速為200 μL/min，進樣量為20 μL；洗脫梯度見表1。

表1 分離3種四環(huán)素類藥物的洗脫梯度

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)。毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度110 ℃；霧化溫度350 ℃；霧化氣流速為650 L/h；錐孔氣流速為50 L/h。

2.2.2 最低檢測限與最低定量限 向空白豬肉樣本中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液確定最低檢出限和最低定量限。信噪比S/N>3者定為方法的檢測限；信噪比S/N>10者定為方法的定量限[6]。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取10 μg/mL濃度的四環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動相分別稀釋至濃度為10、20、50、100、200、400 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。將配好的系列混合工作液由低濃度到高濃度依次進樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.2.4 準(zhǔn)確率與精密度測定 取空白豬肉，每份質(zhì)量為2±0.02g，分別添加50、100μg/kg和200μg/kg(即1/2的MRLVDs，MRLVDs和2倍的MRLVDs)3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各濃度進行5個平行試驗，重復(fù)3次，按上述條件進行測定，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，根據(jù)回收率用來考察本試驗的準(zhǔn)確度，根據(jù)相對標(biāo)準(zhǔn)差考察本試驗的精密度。

2.2.5 豬肉中四環(huán)素類藥物殘留的檢測 對黑龍江省8個市、縣隨機采集的245份豬肉樣本，經(jīng)前處理方法處理后，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定。

2.3 豬肉中四環(huán)素類藥物殘留的風(fēng)險評估 本文采用食品安全指數(shù)[7]對豬產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的殘留風(fēng)險進行評估[7]，計算公式：IFS=(R×F)/(SI×bw)

公式中，IFS為食品安全指數(shù)；R為豬肉樣品中四環(huán)素類藥物的殘留濃度(μg/kg)；F為人們每日豬肉消費量(kg/person·d)。根據(jù)中國肉類協(xié)會2015年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2014年中國人均豬肉消費量為41.5 kg，因此，本文中F值按0.1 kg/person·d計算(41.5/365=0.114 kg)；SI為四環(huán)素類藥物的ADI(每日允許攝入量)值[8]，其中，金霉素SI值為3 μg/kg·d；體重為人體平均體重(kg)，文中按 60 kg 計算。

IFS小于1表示所檢測的四環(huán)素類藥物對人們的健康造成的危害效應(yīng)并不明顯，所檢測的四環(huán)素類藥物對人們健康的風(fēng)險是可以接受的，不會造成危害效應(yīng)；IFS大于1表示所檢測的四環(huán)素藥物對人們健康的風(fēng)險超出了可接受的限度，所檢測的四環(huán)素藥物對人們的健康造成的危害效應(yīng)是明顯的，出現(xiàn)這種情況就應(yīng)該進入風(fēng)險管理程序了[9]。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 在選定的色譜條件下測定，四環(huán)素、金霉素和土霉素在10～400 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(表2)，R2均大于0.999(y為峰面積，x為待測組分的濃度，μg/kg)。

3.2 檢測限與定量限 在上述方法操作條件下，根據(jù)信噪比理論測得3種四環(huán)素類藥物在豬肉中的檢測限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白豬肉中四環(huán)素類藥物特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1～2。

表2 四環(huán)素類藥物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

圖2 豬肉空白樣品

3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度 在空白豬肉組織中添加3個不同濃度四環(huán)素類藥物進行回收率試驗，計算出回收率和精密度見表3，可以看出3種藥物平均回收率(n=5)為73.6%～106.8%，批內(nèi)平均RSD為3.6%～7.9%，批間平均RSD為1.8%～3.6%。

3.4 豬肉樣品中四環(huán)素類藥物的殘留水平 黑龍江省豬肉樣品中四環(huán)素類藥物的殘留水平如表4所示。黑龍江省豬肉產(chǎn)品245份樣品中沒有檢出四環(huán)素和土霉素，檢出金霉素7份，檢出率為2.85%。金霉素殘留范圍為12.80～24.50 μg/kg，均值為18.48 μg/kg，未超過國家規(guī)定的最高殘留限量100 μg/kg(農(nóng)業(yè)部235號公告)。

表3 豬肉組織中添加四環(huán)素類藥物精確度和回收率測定結(jié)果 n=5

表4 黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的殘留水平

ND：未檢出

3.5 豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的風(fēng)險評估

黑龍江省豬肉樣品中四環(huán)類藥物殘留的及食品安全指數(shù)如表5所示。人們攝食黑龍江省豬肉產(chǎn)品的每日暴露量的均值為0.030 6 μg/k體重·d，最大值為0.040 8 μg/k體重·d，最小值為0.021 3 μg/k體重·d，遠低于最大允許攝入量(3 μg/k體重·d)；黑龍江省豬肉樣品中四環(huán)素類藥物殘留的食品安全指數(shù)均值為1.70×10-3，最小值為1.18×10-3，最大值為2.26×10-3，遠遠低于1。這表明黑龍江省豬肉樣品中四環(huán)素類藥物的殘留對人體的潛在危害水平是可以接受的，不會對人群產(chǎn)生不良作用，相關(guān)部門不必進入風(fēng)險管理程序[10]。

表5 四環(huán)素類藥物的每日膳食暴露量及食品安全指數(shù)

4 討論

2015年3月-10月，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對黑龍江省內(nèi)八個市、縣的豬肉組織中的四環(huán)素、土霉素和金霉素3種四環(huán)素類藥物殘留進行抽檢，同時對黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的殘留風(fēng)險進行了評估，檢測結(jié)果說明，黑龍江省內(nèi)豬肉中四環(huán)素類藥物殘留問題比較小。抽檢八個市中齊齊哈爾，大慶和牡丹江3個市雖然均檢出有四環(huán)素類藥物殘留，但均未超過國家規(guī)定的最大殘留限量。哈爾濱、佳木斯、雞西、阿城和賓縣五個區(qū)域均未檢出四環(huán)素類藥物殘留。這說明黑龍江省豬肉產(chǎn)品中未造成四環(huán)素類藥物殘留超標(biāo)問題[11]。

一般采用食品安全指數(shù)(IFS)來描述人們對攝入的食物中所要評估的化學(xué)目標(biāo)物是否對人體具有潛在危害，并能用此結(jié)果對食用該食品的安全狀態(tài)做一個說明， 從而知道風(fēng)險管理者對其采取相應(yīng)的方法手段。在本研究中，通過食品安全指數(shù)的分析，結(jié)果表明，黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的食品安全指數(shù)均值為10.22×10-3，最小值為7.11×10-3，最大值為13.61×10-3，遠遠低于1，表明黑龍江省豬肉產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的殘留對人體的潛在危害水平是可以接受的，不會對人群產(chǎn)生不良作用。相關(guān)部門不必進入風(fēng)險管理程序。

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Detection of tetracycline drugs residue in the pork of Heilongjiang province and its risk assessment

HAN Mei-yu1.2, LI Rui2, JIN Hui-ran2, GUAN Shu-han1, LI Rui1, ZHANG Xiu-ying1

(1.School of Veterinary Medicine ， Northeast Agricultural University ， Harbin 150030，China;2.Veterinary Medicine Feed Supervision in Heilongjiang province ， Harbin 150069，China)

High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used for determination of residues of the three tetracycline drugs (tetracycline， oxytetracycline and chlortetracycline) in 245 pork samples collected randomly in the supermarkets， slaughterhouses， and farmers’ markets from eight cities and counties of Heilongjiang province during a period of 3 ～ 10 months in 2015， to evaluate the risk of tetracycline residues in pork products in Heilongjiang province.The results showed that tetracycline and oxytetracycline residues were not detected but chlortetracycline residues were detected at a rate of 2.85%. Chlortetracycline residues ranged from 12.80 μg/kg to 12.80 μg/kg with an average value of 18.48 μg/kg， not exceeding the maximum residue limits set by the state (100μg/kg).Thus we found that chlortetracycline was the main residue of tetracycline drugs in the pork samples.The average value of food safety index in pork products related to tetracyclines residues in Heilongjiang province was 10.22×10-3， the minimum value is 7.11×10-3， and the maximum was 13.61×10-3， which is,far below 1. Our findings suggest that the potential hazard level of tetracycline residues in pork products in Heilongjiang province is acceptable.

Pork; Tetracycline drugs; residue detection; risk assessment

ZHANG Xiu-ying

2015-13-31

韓美玉(1990-)，女，碩士生，研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究，E-mail：1838006476@qq.com

張秀英，E-mail：zhangxiuying@neau.edu.cn

S859.84

A

0529-6005(2016)11-0096-04