馮 柯 , 郭亞洲 , 張睿涵 , 薛瑞旭 , 王 歡 , 趙寶玉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西楊凌712100； 2.拉薩市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 西藏拉薩851000)

藏橐吾小鼠急性毒性試驗(yàn)

馮 柯1，2, 郭亞洲1, 張睿涵1, 薛瑞旭1, 王 歡1, 趙寶玉1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西楊凌712100； 2.拉薩市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 西藏拉薩851000)

為了研究藏橐吾地上部分水提液對(duì)小鼠的急性毒性作用, 將100只體質(zhì)量30±2 g昆明系小鼠隨機(jī)分成10組(灌胃6組, 腹腔注射4組), 每組10只, 雌雄各半。 灌胃給藥劑量為53.00～135.00 g/kg(以生藥量計(jì)), 灌胃量為1 mL/30 g, 分3次灌胃, 每次間隔4 h； 腹腔注射劑量為8.88～21.90 g/kg(以生藥量計(jì)), 注射量為0.8 mL/30g, 1次腹腔注射。 給藥后, 每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況, 連續(xù)觀察14 d, 記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)及病理剖檢變化, 統(tǒng)計(jì)死亡數(shù), 用改良寇氏法計(jì)算LD50。 結(jié)果表明, 小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分別為91.69 g/kg和15.75 g/kg, 95%可信限分別為83.10～101.16 g/kg和14.01～17.72 g/kg； 兩種染毒方式的中毒癥狀相似, 均出現(xiàn)精神沉郁、運(yùn)動(dòng)遲緩、食欲及飲水廢絕、呼吸頻率降低； 病理剖檢可見(jiàn)胃腸道臌氣, 肝臟、脾臟壞死。 結(jié)合中毒小鼠的臨床癥狀和病理剖檢變化, 綜合分析后認(rèn)為藏橐吾有毒性, 主要損傷器官為胃腸道、肝臟和脾臟。

藏橐吾 ； 水提液 ； 灌胃 ； 腹腔注射 ； 急性毒性 ； 小鼠

藏橐吾(Ligulariarumicifolia)是菊科(Compositae)橐吾屬(Ligularia)的多年生草本植物，產(chǎn)于我國(guó)西藏東南部至東北部，生于海拔3 700～4 500 m的湖邊、林下、灌叢及山坡[1]。作為一味中藥，藏橐吾具有散寒、化痰、止咳等功效，常用于治療咳嗽痰喘、肺癆等癥[2]。藏橐吾植株高(40～100 cm)、葉片寬大(長(zhǎng)19 cm，寬6～10 cm)，草原發(fā)生雪災(zāi)后不易被積雪掩蓋，極易被饑餓動(dòng)物采食，引起中毒。與藏橐吾同樣分布在青藏高原的黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)已造成青海貴南縣143頭牛、羊中毒[3]。同屬網(wǎng)脈橐吾(Ligulariadictyoneura)和牛蒡葉橐吾(Ligularialapathifolia)被認(rèn)定為有毒植物[5]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)藏橐吾化學(xué)成分及毒性的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)通過(guò)觀察藏橐吾水提液小鼠灌胃和腹腔注射的急性毒性，用改良寇氏法計(jì)算LD50，同時(shí)觀察小鼠的毒性反應(yīng)及病理剖檢變化，以評(píng)價(jià)藏橐吾的毒性，為后續(xù)亞急性毒性試驗(yàn)和毒性機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物樣品 藏橐吾地上部分全草2014年8月采集于西藏堆龍德慶縣(30°02′07.46″N；90°36′26.06″E)，曬干后粉碎，置于通風(fēng)陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。植物?biāo)本由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院常朝陽(yáng)研究員鑒定。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量 30±2 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)進(jìn)。購(gòu)進(jìn)后進(jìn)行7 d的喂養(yǎng)觀察，淘汰不健康小鼠。飼喂自制鼠糧。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水提液的制備 取一定質(zhì)量的藏橐吾粉末，加10倍量的蒸餾水文火煎煮0.5 h，取上清液，過(guò)濾，如此重復(fù)3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至生藥量為4.05 g/mL的溶液(此濃度為灌胃給藥的最大濃度)，加一定量的蒸餾水配置成不同生藥量的攻毒液。灌胃用的攻毒液，4 ℃保存?zhèn)溆?，腹腔注射用的攻毒液，高壓滅菌后? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 半數(shù)致死量(LD50)試驗(yàn) 將健康小鼠隨機(jī)分成10組(灌胃6組，腹腔注射4組)，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)前12 h、試驗(yàn)后4 h禁食，但不限制飲水。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，小鼠灌胃給藥劑量為 53.00～135.00 g/kg(以生藥量計(jì))，劑間比為1∶0.83，灌胃量為1 mL/30g，分3次灌胃，每次間隔4h；小鼠腹腔注射劑量為8.88～21.90 g/kg(以生藥量計(jì))，劑間比為1∶0.74，注射量為0.8 mL/30g，1次腹腔注射。給藥后，每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)及病理剖檢變化，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)。

1.4 計(jì)算方法 用改良寇氏法計(jì)算LD50及95%可信限[6]。

2 結(jié)果

2.1 灌胃染毒結(jié)果

2.1.1 LD50及95%可信限結(jié)果 灌胃后觀察14 d，統(tǒng)計(jì)各個(gè)劑量組的死亡率(表1)，用改良寇氏法公式進(jìn)行計(jì)算得出，藏橐吾地上部分水提液對(duì)小鼠灌胃的LD50為91.69 g/kg，95%可信限為 83.10～101.16 g/kg。

2.1.2 小鼠臨床癥狀及病理剖檢變化 隨著灌胃劑量的增大，小鼠出現(xiàn)中毒癥狀的時(shí)間也越早。小鼠中毒臨床癥狀不明顯，僅表現(xiàn)為對(duì)外界聲音刺激敏感，不喜動(dòng)，食欲、飲水廢絕。死亡主要集中在灌胃后96 h內(nèi)，耐過(guò)后的小鼠恢復(fù)正常。死亡小鼠的病理剖檢，主要表現(xiàn)為胃腸道局部臌氣；肝臟邊緣壞死；胸腔有積血；脾臟壞死；其余臟器未見(jiàn)明顯肉眼變化。攻毒14 d后對(duì)存活的小鼠用頸椎脫臼法處死并進(jìn)行病理剖檢，臟器均未見(jiàn)明顯肉眼變化。

表1 小鼠灌胃急性毒性正式試驗(yàn)結(jié)果

2.2 腹腔注射染毒結(jié)果

2.2.1 LD50及95%可信限結(jié)果 腹腔注射后觀察14 d，統(tǒng)計(jì)各個(gè)劑量組的死亡率(表2)，用改良寇氏法公式進(jìn)行計(jì)算得出，藏橐吾地上部分水提液對(duì)小鼠腹腔注射的LD50為15.75 g/kg，95%可信限為14.01～17.72 g/kg。

表2 小鼠腹腔注射急性毒性正式試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 小鼠臨床癥狀及病理剖檢變化 腹腔注射后，隨著攻毒劑量的增大，小鼠出現(xiàn)中毒癥狀的時(shí)間也越早，癥狀也越明顯。主要癥狀包括精神沉郁，不喜動(dòng)，食欲、飲水廢絕，呼吸頻率降低。最高劑量組在臨死前出現(xiàn)亂竄、后肢抽搐等癥狀，多數(shù)在注射后6 min內(nèi)死亡。其余劑量組表現(xiàn)出對(duì)外界聲音刺激不明顯，臨死前出現(xiàn)后肢麻痹、僵硬等癥狀。絕大部分死亡集中發(fā)生在注射后的24 h內(nèi)，耐過(guò)的小鼠在出現(xiàn)精神沉郁后恢復(fù)正常。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)胃腸道局部臌氣，胃下部及小腸充血；心尖、肝臟、脾臟壞死；其余臟器未見(jiàn)明顯肉眼變化。攻毒14 d后對(duì)存活的小鼠用頸椎脫臼法處死并進(jìn)行病理剖檢，臟器均未見(jiàn)明顯肉眼變化。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)改良寇氏法計(jì)算得出，藏橐吾地上部分水提液小鼠灌胃的LD50為91.69 g/kg，95%可信限為 83.10～101.16 g/kg；腹腔注射的LD50為15.75 g/kg，95%可信限為14.01～17.72 g/kg。結(jié)合中毒小鼠的臨床癥狀和死后病理剖檢變化，綜合分析后認(rèn)為藏橐吾有毒性，主要損傷器官為胃腸道、肝臟、脾臟。

通過(guò)兩種不同的染毒途徑可以看出，灌胃和腹腔注射的中毒癥狀相似，均出現(xiàn)精神沉郁、不喜動(dòng)、食欲和飲水廢絕、呼吸頻率降低和胃腸道臌氣，肝臟、脾臟壞死等臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化。

本試驗(yàn)初步研究發(fā)現(xiàn)，藏橐吾地上部分水提液小鼠灌胃的LD50為91.69 g/kg，95%可信限為 83.10～101.16 g/kg；腹腔注射的LD50為15.75 g/kg，95%可信限為14.01～17.72 g/kg。結(jié)合中毒小鼠的臨床癥狀和死后病理剖檢變化，綜合分析后認(rèn)為藏橐吾有毒性，主要損傷器官為胃腸道、肝臟、脾臟。灌胃和腹腔注射的中毒癥狀相似，均出現(xiàn)精神沉郁、不喜動(dòng)、食欲和飲水廢絕、呼吸頻率降低和胃腸道臌氣，肝臟、脾臟壞死等臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化。后續(xù)試驗(yàn)可以進(jìn)一步探究藏橐吾的主要有毒成分及其靶器官。

[1] 傅坤俊,張振萬(wàn),何善寶,等.中國(guó)植物志.第77(2)卷[M].北京:科學(xué)出版社, 1993:47.

[2] 中國(guó)藥材公司.中國(guó)中藥資源志要[M].北京:科學(xué)出版社,1994:1318.

[3] 林永明.牛羊黃帚橐吾草中毒癥的診治[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2011,3:74-75.

2015-11-05

農(nóng)業(yè)部“十二五”公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201203062)

馮柯(1982- )，男，碩士，主要從事動(dòng)物中毒病與毒理學(xué)研究，E-mail: John3376@qq.com

趙寶玉，E-mail:zhaobaoyu12005@163.com

S859.87

B

0529-6005(2016)11-0113-02