王海瑞，王旭榮，張景艷，王 磊，曹明澤，李建喜，王學(xué)智

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

甘肅省某奶牛場(chǎng)腸桿菌性乳房炎主要病原菌的分離鑒定與耐藥性分析

王海瑞，王旭榮，張景艷，王 磊，曹明澤，李建喜*，王學(xué)智*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

為查明甘肅省某奶牛場(chǎng)發(fā)生臨床型奶牛乳房炎的主要病原菌并選擇治療用敏感藥物，隨機(jī)無(wú)菌采集了6份臨床型病牛乳樣和1份大罐乳樣，采用劃線分離、菌落形態(tài)觀察、革蘭染色鏡檢、生化鑒定及16S rDNA序列分析等方法進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，同時(shí)采用K-B法測(cè)定主要分離菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。結(jié)果表明，從臨床型乳房炎乳樣中分離鑒定出大腸埃希菌、芽胞桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌(腐生葡萄球菌)3種細(xì)菌，其中大腸埃希菌的分離率最高，為66.67%；從大罐奶樣中也分離出大腸埃希菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸埃希菌對(duì)氨芐青霉素、阿莫西林、頭孢噻吩、桿菌肽、紅霉素均存在不同程度的耐藥，耐藥率為29%～100%；對(duì)諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感。說(shuō)明此次牛場(chǎng)臨床型乳房炎的主要病原菌是大腸埃希菌、葡萄球菌和芽胞桿菌，而且分離的大腸埃希菌具有多重耐藥性。根據(jù)檢測(cè)分析結(jié)果，給奶牛場(chǎng)提出針對(duì)性的防控措施，臨床型乳房炎的發(fā)病率下降，病情得以控制。

奶牛；腸桿菌；乳房炎；病原菌；藥敏試驗(yàn)；耐藥

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中的常見臨床疾病之一，特別是在管理較差的牛場(chǎng)，臨床型乳房炎的發(fā)病率較高，可達(dá)33.41%，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。細(xì)菌感染是引起奶牛乳房炎的主要原因，不同的細(xì)菌感染，造成的奶牛臨床表現(xiàn)和乳汁性狀不同，而且現(xiàn)在牛場(chǎng)病原菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，因此確定臨床型乳房炎的致病菌種類并且進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)是科學(xué)治療奶牛乳房炎的關(guān)鍵。

2015年5月，甘肅省某奶牛場(chǎng)發(fā)生臨床型乳房炎，主要表現(xiàn)為乳房紅腫、溫?zé)?，乳汁性狀為淡黃色水樣乳汁，內(nèi)混有絮狀物(呈豆腐渣樣)，產(chǎn)奶量嚴(yán)重下降。牛場(chǎng)對(duì)病牛采用藥物治療，治療效果不佳。本實(shí)驗(yàn)室先進(jìn)行疾病和牛場(chǎng)管理情況調(diào)查，隨機(jī)采集了6份臨床型病牛乳樣和1份大罐乳樣，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，并分析主要分離菌對(duì)16種常用抗菌藥物的敏感性，為臨床治療合理選藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與主要試劑 50 mL/L綿羊鮮血平板(簡(jiǎn)稱血平板)購(gòu)自江門市凱林貿(mào)易有限公司；麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂MH培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯均購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；革蘭染液購(gòu)自南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；16 S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管(兔血漿)購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析專用的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡和革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡購(gòu)自bioMerieux,Inc；30 mL/L H2O2由實(shí)驗(yàn)室自配。

1.1.2 OXOID藥敏紙片 選用氨芐西林(10 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、頭孢噻吩(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、強(qiáng)力霉素(30 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、桿菌肽(0.04 μ/片)、恩諾沙星(5 μg/片)、氟苯尼考 (30 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、替米考星(15 μg/片)、林可霉素 (2 μg/片)和復(fù)方新諾明 (25 μg/片)，直徑為5 mm，均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疾病調(diào)查與樣品采集 對(duì)牛場(chǎng)的發(fā)病情況和飼養(yǎng)管理情況進(jìn)行了詳細(xì)調(diào)查，主要表現(xiàn)為乳房紅腫、溫?zé)?，乳汁性狀為淡黃色水樣乳汁，內(nèi)混有絮狀物(呈豆腐渣樣)，產(chǎn)奶量嚴(yán)重下降。隨機(jī)無(wú)菌采集臨床型乳房炎病牛奶樣6份，大罐奶1份。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化 將無(wú)菌采集到的乳樣搖勻，無(wú)菌環(huán)境下取10μL乳樣，間斷劃線接種于血平板上，有氧條件下，37 ℃培養(yǎng)18 h～20 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況及菌落特征。對(duì)于18 h～20 h無(wú)菌生長(zhǎng)的平板繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。挑取典型單菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢，然后挑取典型菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。純凈后的菌株用于下一步鑒定，否則繼續(xù)純化直到純凈為止。

1.2.3 生化鑒定 根據(jù)菌落形態(tài)和染色特性，初步判定細(xì)菌的屬別，然后分別進(jìn)行生化鑒定。生化鑒定內(nèi)容包括是VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測(cè)、接觸酶試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)等。

1.2.4 16 S rDNA序列分析 按照試劑盒操作說(shuō)明提取被檢細(xì)菌的DNA并以此為模板，按16 S rDNA bacterial Identification PCR kit說(shuō)明擴(kuò)增16 S rDNA片段，后進(jìn)行核酸凝膠電泳。符合預(yù)期大小的擴(kuò)增片段由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，通過NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)的在線Blast軟件對(duì)獲取序列進(jìn)行搜索比對(duì)，確定細(xì)菌種屬。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI推薦的K-B法，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈的大小，重復(fù)3次計(jì)算其平均值。根據(jù)《CLSI的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2014》判定該菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌菌落生長(zhǎng)特性及染色特征 6份臨床型乳房炎乳樣和1份大罐奶樣均檢測(cè)出細(xì)菌，細(xì)菌檢出率為100%。經(jīng)分離純化和革蘭染色鏡檢，共分離到10株3類形態(tài)特征不同的細(xì)菌。其中，2株G+長(zhǎng)桿菌，菌體特征為單個(gè)或鏈狀排列，有芽胞(圖1A)，編號(hào)為L(zhǎng)1、L9，在血平板上的菌落形態(tài)均為灰白色、略圓、邊緣比較整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、隆起的單個(gè)菌落；1株G+球菌，菌體特征為單個(gè)或葡萄串狀(圖1B)，編號(hào)為L(zhǎng)2，在血平板上的菌落形態(tài)為灰白色、略小、表面光滑、濕潤(rùn)、隆起的單個(gè)菌落；7株G-短桿菌，菌體特征為單個(gè)散在排列(圖1C)，編號(hào)為L(zhǎng)3～L8、L10，在血平板上的菌落形態(tài)均為灰白色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、隆起、半透明的單個(gè)菌落，接種于麥康凱培養(yǎng)基上的菌落呈紅色、圓形隆起、邊緣整齊、表面光滑。

圖1 革蘭染色鏡檢(100×)

2.1.2 生化鑒定 L1和L9經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為放射根瘤菌；L2經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為人葡萄球菌人亞種；分離菌L3～L8、L10經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為大腸埃希菌。分離菌的培養(yǎng)特性、接觸酶試驗(yàn)結(jié)果及兔血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果見表1，VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)結(jié)果見表2。

2.1.3 16 S rDNA序列分析 以提取的細(xì)菌DNA為模板，用16 S rDNA細(xì)菌鑒定PCR試劑盒擴(kuò)增16 S rDNA片段，片段長(zhǎng)度500 bp左右(圖2)。獲得片段序列通過NCBI的在線Blast軟件對(duì)獲取的序列進(jìn)行搜索比對(duì)，菌株L1、L9與環(huán)狀芽胞桿菌(基因登錄號(hào)為NR-112632.1)的16S rDNA同源性為99%以上，故分離株L1、L9的鑒定結(jié)果為環(huán)狀芽胞桿菌；L2與腐生葡萄球菌(基因登錄號(hào)為NR-115607.1)的16S rDNA同源性為99%以上，確定L2為腐生葡萄球菌；L3～L8、L10均與大腸埃希菌(基因登錄號(hào)為(NR-102804.1)16S rDNA同源性為98%以上，故L3～L8、L10鑒定為大腸埃希菌，結(jié)果見表1。

表1 革蘭染色及生化分析結(jié)果

Table 1 Gram staining and biochemical analysis

編號(hào)№革蘭染色Gramstaining接觸酶試驗(yàn)Catalase凝固酶試驗(yàn)Coagulase麥康凱培養(yǎng)MacConkeyVITEK2鑒定結(jié)果IdentificationresultofVITEK216SrDNA鑒定Identificationof16SrDNAL1、L9++//放射根瘤菌(表2A)Rhizobiumradiobacter(Table2A)環(huán)狀芽胞桿菌BacilluscirculansL2++-/人葡萄球菌人亞種(表2A)Staphylococcushominissspho-monis(Table2A)腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophytic-usL3～L8、L10-+/紅色菌落Redcolony大腸埃希菌(表2B)Escherichiacoli(Table2B)大腸埃希菌Escherichiacoli

注：“+”表示“陽(yáng)性”；“-”表示陰性；“/”表示“未測(cè)定”。

Note：“+”means“posetive”；“-”means “negative”；“/”means “no test”.

表2 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果

Table 2 Biochemical analysis of VITEK 2 Compact

A L1、L9 L2 L1、L9 L2 L1、L9 L2苦杏仁苷AMY--磷脂酰磷脂酶CPIPLC--D-木糖dXYL--精氨酸雙水解酶1ADH1(-)-β-D-半乳糖苷酶BGAL--α-葡萄糖苷酶AGLU--丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA--環(huán)式糊精CDEX--L-天冬氨酸芳胺酶AspA--β-半乳糖吡喃糖苷酶BGAR--α-甘露糖苷酶AMAN--磷酸酶PHOS--亮氨酸芳胺酶LeuA--L-脯氨酸芳胺酶ProA--β-葡萄糖醛酸酶BGURr--α-半乳糖苷酶AGAL--焦谷氨酸芳胺酶PyrA--β-D葡萄糖醛酸酶BGUR--丙氨酸芳胺酶AlaA--酪氨酸芳胺酶TyrA--D-山梨醇dSOR--尿素酶URE-+多粘菌素B耐受POLYB--D-半乳糖dGAL--D-核糖dRIB--L-乳酸鹽產(chǎn)堿ILATK--乳糖LAC-+N-乙酰-D-氨基葡萄糖NAG--D-麥芽糖dMAL--桿菌肽耐受BACI+-新生霉素耐受NOVO--6.5%NaCl生長(zhǎng)NC6.5--D-甘露醇dMAN+-D-甘露糖dMNE+-甲烷-B-D-葡萄糖吡喃苷MB-dG+-支鏈淀粉PUL--D-棉子糖dRAF--0/129耐受O129R--水楊素SAL+-蔗糖SAC++D-海藻糖dTRE++精氨酸雙水解酶2ADH2s--奧普托辛耐受OPTO++BL3～L8、L10L3～L8、L10L3～L8、L10丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶APPA-側(cè)金盞花醇ADO+吡咯烷基芳胺酶PyrA-L-阿拉伯醇IARL-D-纖維二糖dCEL-β-半乳糖苷酶BGAL+H2S-β-N-乙酰葡萄糖苷酶BNAG-谷氨酰芳胺酶AGLTp-D-葡萄糖dGLU+γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶GGT-葡萄糖發(fā)酵OFF+β-葡萄糖苷酶BGLU-D-麥芽糖dMAL+D-甘露醇dMAN+D-甘露糖dMNE+β-木糖苷酶BXYL-β-丙氨酸芳胺酶BAlap-L-脯氨酸芳胺酶ProA-酯酶LIP-古老塘糖LE-酪氨酸芳胺酶TyrA+尿素酶URE-D-山梨醇dSOR+蔗糖SAC-D-塔格糖dTAG-D-海藻糖dTRE+檸檬酸鹽(鈉)CIT-丙二酸鹽MNT-5-酮-葡萄糖苷5KG-乳酸鹽產(chǎn)堿ILATk+α-葡萄糖AGLU-琥珀酸鹽產(chǎn)堿SUCT+N-乙酰-β-半乳糖氨酶NA-GA-α-半乳糖苷酶AGAL+磷酸酶PHOS+氨基乙酸芳胺酶GlyA+鳥氨酸脫羧酶ODC-懶氨酸脫羧酶LDC+組氨酸同化IHISa-COURMARATECMT+β-葡萄糖苷酸酶BGUR+0/129耐受O129R-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶GGAA-L-蘋果酸鹽同化IMLTa-ELLMANELLM+L-乳酸鹽同化ILATa-

注：“+”表示“陽(yáng)性”；“-”表示陰性。

Note：“+”means“positive”；“-”means “negative”.

2.1.4 細(xì)菌鑒定結(jié)果分析 通過本實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌進(jìn)行的分離純化、革蘭染色、鏡檢、生化鑒定和16S rDNA序列分析，從病牛中分離到的L1、L9是環(huán)狀芽胞桿菌，L2是腐生葡萄球菌，L3～L8是大腸埃希菌。此外，從大罐奶中分離到的細(xì)菌L10是大腸埃希菌(表1)。由此認(rèn)為造成此次發(fā)病的主要病原菌為大腸埃希菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)

以CLSI標(biāo)準(zhǔn)為參考，選擇藥敏片對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。大腸埃希菌對(duì)阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考以及復(fù)方新諾明敏感，對(duì)頭孢噻吩、桿菌肽、紅霉素、替米考星和林可霉素耐藥率分別為29%、100%、43%、43%和100%(圖3)。

圖2 分離菌的16 S rDNA PCR擴(kuò)增

Fig.2 PCR amplication of 16 S rDNA of isolates

圖3 大腸埃希菌體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 致病菌分析

本次臨床型奶牛乳房炎乳樣檢測(cè)結(jié)果顯示，從臨床型乳房炎乳樣中分離到大腸埃希菌、環(huán)狀芽胞桿菌和腐生葡萄球菌3類細(xì)菌，分離率分別為66.67%、22.22%和11.11%；而且從大罐乳樣中也分離到大腸埃希菌。結(jié)合清水樣的乳汁性狀特征和牛場(chǎng)管理情況的實(shí)際調(diào)研，由此判定造成本場(chǎng)此次臨床型乳房炎發(fā)生的主要病原菌是大腸埃希菌，腐生葡萄球菌和芽胞桿菌是造成混合感染的條件致病菌。此結(jié)果遠(yuǎn)高于之前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，袁永隆等[1]對(duì)23個(gè)省、市、自治區(qū)的40個(gè)大中型奶牛場(chǎng)進(jìn)行乳房炎的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌的感染率為17.14%；周慶國(guó)等[2]對(duì)佛山地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為50%；李宏勝等[3]對(duì)蘭州當(dāng)?shù)啬膛Ｈ榉垦状竽c埃希菌分離率為24.44%；徐志光等[4]對(duì)新疆地區(qū)奶牛乳房炎大腸埃希菌分離率為29.64%；鄧海平等[5]對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為12.9%；郭海軍等[6]對(duì)無(wú)錫地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為15.7%；王娜等[7]對(duì)哈爾濱地區(qū)奶牛臨床型乳房炎大腸埃希菌分離率為19.6%。這種分離率的地域差異性可能與牛場(chǎng)的飼養(yǎng)條件和管理水平有關(guān)。結(jié)合牛場(chǎng)實(shí)際調(diào)研情況，該牛場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生控制相對(duì)較差，整體飼養(yǎng)管理也相對(duì)落后一些，感染腸桿菌機(jī)率較高。常見腸桿菌性乳房炎臨床表現(xiàn)為乳房腫脹，外軟內(nèi)硬，乳汁呈水樣、迅速停止泌乳。有學(xué)者認(rèn)為那些未被其他細(xì)菌感染的奶牛更容易感染上大腸埃希菌[8-9]。

3.2 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)與16 S rDNA序列分析比較

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的檢測(cè)原理是將生化反應(yīng)智能化和機(jī)械化，優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)操作人員的勞動(dòng)力下降，缺點(diǎn)是單獨(dú)使用本方法對(duì)某些細(xì)菌的鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。本試驗(yàn)中，使用這兩種方法對(duì)分離菌L3～L8、L10鑒定結(jié)果一致，均為大腸埃希菌；L1和L9經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為放射根瘤菌，而16 S rDNA序列分析鑒定為環(huán)狀芽胞桿菌；L2經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定為人葡萄球菌人亞種，而16 S rDNA序列分析鑒定為腐生葡萄球菌。國(guó)內(nèi)之前也有報(bào)道VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌的鑒定存在一定的局限性[10]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室多年對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)結(jié)合菌落形態(tài)、顏色、溶血性等的觀察，涂片革蘭染色細(xì)菌形態(tài)和染色性的觀察，上機(jī)前或后加做補(bǔ)充試驗(yàn)等，將有助于提高該系統(tǒng)的鑒定率和準(zhǔn)確率[11]。16 S rDNA是編碼原核生物16 S rRNA的基因，長(zhǎng)度約1 500 bp，存在于所有細(xì)菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中，有多個(gè)保守區(qū)和與之相間的多個(gè)可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無(wú)顯著差異；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌屬或種特異性。因此，16 S rDNA已成為細(xì)菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列[12]。由于這兩種檢測(cè)方法技術(shù)原理的不同，16 S rDNA比VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)更為準(zhǔn)確，建議有條件的單位通過16 S rDNA序列分析對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

3.3 藥物敏感性

根據(jù)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分離的大腸埃希菌對(duì)不同藥物的敏感性不同，對(duì)阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考以及復(fù)方新諾明敏感，而對(duì)頭孢噻吩、桿菌肽、紅霉素、替米考星和林可霉素均存在不同程度的耐藥現(xiàn)象。根據(jù)檢測(cè)分析結(jié)果，給奶牛場(chǎng)提出針對(duì)性的疾病感控措施，乳房炎的發(fā)病率下降，病情得以控制。國(guó)內(nèi)外在針對(duì)奶牛乳房炎的治療上仍以抗菌藥物為主?？咕幬锏膹V泛使用，導(dǎo)致病原菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，耐藥譜也越來(lái)越廣，這給奶牛乳房炎的防治帶來(lái)了新的難題[13]。倪春霞等[14]研究表明，四川、甘肅和內(nèi)蒙古地區(qū)乳樣中分離出的大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物高度敏感，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類出現(xiàn)嚴(yán)重耐藥性；Sumathi B R等[15]報(bào)道，乳樣中分離到的大腸埃希菌對(duì)氨芐西林、新霉素等藥物產(chǎn)生耐藥性。由此可見，奶牛乳房炎大腸埃希菌在大量、長(zhǎng)期頻繁使用抗菌藥的情況下已經(jīng)產(chǎn)生了多重耐藥性。細(xì)菌耐藥性與抗菌藥物長(zhǎng)期使用有關(guān)，在臨床治療過程中，如選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用，減少單個(gè)藥物的使用劑量或使用時(shí)間，可減緩耐藥菌株的產(chǎn)生。目前已有大量報(bào)道表明，中藥在奶牛乳房炎防治中起到重要作用。除藥物防治外，更應(yīng)保持環(huán)境的清潔、通風(fēng)、干燥，貫徹“預(yù)防為主”的方針，建立合理的飼養(yǎng)管理制度，從根本上降低奶牛乳房炎的發(fā)病率[16-17]。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Analysis of Main Pathogens from a Farm of Dairy Cows with Mastitis in Gansu Province

WANG Hai-rui,WANG Xu-rong,ZHANG Jing-yan,WANG Lei,CAO Ming-ze,LI Jian-xi,WANG Xue-zhi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050,China)

A clinical type of cow mastitis occurred in one dairy farm of Gansu.In order to find out the main pathogens and select effective drugs for clinic treatment, six milk samples from sick cows and one sample from miltank were collected randomly.The plate culture method,colonial morphology observation,Gram staining and microscopy detection,biochemical identification and 16 S rDNA sequence analysis were used to isolate and identify the bacteria.At the same time,K-B method was used to measure the sensitivity of the main isolated bacteria to antibacterials.The results showed that,Escherichiacoli,Bacillus, coagulase negativeStaphylococcus(Staphylococcussaprophytic) were isolated and identified from the clinical mastitis milk samples.The isolation rate ofE.coliwas the highest, 66.67%.E.coliwas also isolated from miltank. Susceptibility test result showed thatE.coliwas resistant to some drugs in varying degrees, such as ampicillin, amoxicillin, cephalothin, bacitracin and erythromycin,and drug resistance rate from 29% to 100%,and had the higher susceptibility to norfloxacin, enrofloxacin, florfenicol, cefoperazone. According to the results, the main pathogen of the clinical mastitis isE.coli,and opportunistic pathogens of mixed infection wereStaphylococcusandBacillus.The isolatedE.colihad strong multiple drug resistance. According to the assay results,specific control measures were proposed to the dairy farm to help to control the infection and decrease the incidence of clinical mastitis.

dairy cow; enterobacterium;mastitis; pathogen; susceptibility test; drug resistance

2015-10-16

國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系科學(xué)家崗位項(xiàng)目(CARS37);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)(201303040-14)

王海瑞(1991-)，男，山東人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疾病預(yù)防與控制工作。*通訊作者

S857.26

A

1007-5038(2016)05-0063-06