帖衛(wèi)芳，賈俊忠，郭文平

(1.河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；2.巴彥淖爾市醫(yī)院，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展

帖衛(wèi)芳1，賈俊忠2，郭文平3

(1.河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；2.巴彥淖爾市醫(yī)院，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白是一類具有多種生物學(xué)功能的小分子蛋白質(zhì)。介紹了已發(fā)現(xiàn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列特性及結(jié)構(gòu)，并對其生物學(xué)功能的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，最后對其今后的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白；結(jié)構(gòu)；生物學(xué)功能

在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，許多真菌作為藥物被廣泛使用；在民間，人們也通過食用真菌來增強(qiáng)自身的免疫力。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)從真菌中分離到許多與提高人體免疫力密切相關(guān)的生物活性物質(zhì)，主要包括多糖、肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、甾醇、萜類、維生素等。在提取的生物活性蛋白質(zhì)中，凝集素與真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(Fungal immunomodulatory protein，F(xiàn)ip)是2種重要的具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白是一類從高等擔(dān)子菌中分離出來的具有免疫調(diào)節(jié)活性的小分子蛋白質(zhì)，最早由日本學(xué)者Kino等[1]從赤靈芝(Ganodermalucidum)中分離純化到，并將其命名為Ling Zhi-8(LZ-8)。最初，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的研究主要集中在可食用的真菌；在隨后的20多年中，更多的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白被發(fā)現(xiàn)，包括一些非食用的真菌。研究發(fā)現(xiàn)，該類蛋白具有包括抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)功能在內(nèi)的多種生物學(xué)功能。筆者介紹了已發(fā)現(xiàn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列特性及其結(jié)構(gòu)，并對其生物學(xué)功能的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，最后對其今后的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的來源及特征

1989年，日本學(xué)者Kino等[1]對赤靈芝菌絲體的粗提取物進(jìn)行進(jìn)一步純化，經(jīng)過凝膠過濾及離子交換層析，得到了一種等電點(diǎn)為4.4的蛋白質(zhì)，Tricine-SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果表明其分子量約為13 kD。該蛋白能刺激小鼠脾淋巴母細(xì)胞的形成，命名為LZ-8，這是第1個從真菌中分離到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白。Tanaka等[2]對該蛋白進(jìn)行了測序，測序結(jié)果表明成熟的LZ-8是由110個氨基酸殘基組成的，其氨基端為乙酰化的絲氨酸，根據(jù)其氨基酸組成，推導(dǎo)其分子量為12.4 kD，與試驗(yàn)結(jié)果相一致。1991年，Murasugi等[3]從靈芝的 cDNA 文庫中篩選到LZ-8蛋白的編碼基因，不包括終止密碼子的堿基長度為333 bp，根據(jù)該基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)測序結(jié)果完全一致，只比成熟的LZ-8多1個甲硫氨酸(Met)。

除了赤靈芝中分離到的LZ-8外，學(xué)者也從小孢子靈芝(G.microsporum)[4]、金針菇(Flammulinavelutipes)[5]、草菇(Volvariellavolvacea)[6]和松杉靈芝(G.tsugae)[7]中分離到真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，分別被命名為Gmi、FIP-fve、FIP-vvo和FIP-gts。迄今為止，NCBI 網(wǎng)站上公布的免疫調(diào)節(jié)蛋白的完整序列共有15種，分別來自赤靈芝(G.lucidum，P14945)[1]、紫靈芝(G.japoncium，AAX98241)、小孢子靈芝(3KCW_A)[4]、松杉靈芝[7]、樹舌靈芝(G.applanatum，AEP68179)[8]、黑靈芝(G.atrum，AJD79556)[9]、紫芝(G.sinense)[10]、草菇[6]、云芝(Trametesversicolor，XP_008038009)[11]、污叉絲孔菌(Dichomitussqualens，XP_007362866)、金針菇(P80412)[5]、色釘菇(Chroogomphusrutilus，AKU37620)[12]、褐腐菌(Postiaplacenta，AJL35148.1)[13]、臺灣樟芝(Taiwanofunguscamphoratus，AAT11911)[14]和銀耳(Tremellafuciformis，ABL96299)[15]。以上這些真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白由111～136個氨基酸組成，其中最長的來自臺灣樟芝，為136個氨基酸，與其他真菌來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白的同源性低于20%。除了來自臺灣樟芝的免疫調(diào)節(jié)蛋白外，銀耳中發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)蛋白與其他真菌來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白的同源性甚至更低，約為10.0%。其他真菌來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白的同源性為44.5%～100%，其中赤靈芝與松杉靈芝來源的免疫球蛋白的氨基酸序列完全一致。在真菌的Ganoderma屬中，其他物種來源的氨基酸同源性為80.2%～86.5%。除了LZ-8外，葉波平等[16]從赤靈芝中分離到3種具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖活性的蛋白質(zhì)，但其分子量遠(yuǎn)大于LZ-8；這也表明靈芝中存在多種與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的生物活性物質(zhì)。因此，據(jù)此推測來源于臺灣樟芝和云芝中的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可能與其他真菌中來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白不屬于同一個家族。Pushparajah等[17]報(bào)道了Lignosusrhinocerotis中的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-lrh，它與LZ-8的同源性最高，為64%。

2 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)

目前已發(fā)現(xiàn)的大部分真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有較高的同源性，因此其蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)非常相似。在氨基酸組成上，除了臺灣樟芝和云芝外，源自其他真菌的免疫調(diào)節(jié)蛋白不含組氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)，但是卻富含天冬氨酸(Asp)和纈氨酸(Val)，并且其中的28個氨基酸完全相同，其中FDYTP 5個氨基酸殘基高度保守。在已發(fā)現(xiàn)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白中，LZ-8為糖蛋白，其他均不含糖。經(jīng)過凝膠過濾與層析純化后的LZ-8含糖量為1.3%，再經(jīng)過高效液相色譜純化后，其含糖量降至0.6%，僅檢測到少量的甘露糖與氨基己糖[1]。

LZ-8是第1個被發(fā)現(xiàn)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，Tanaka等[2]發(fā)現(xiàn)LZ-8與幾種免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)具有一定的同源性，如鼠的AVMS67和A1MS47、人的G1HUHL，甚至還包括低等脊椎動物金魚的G6A。在NBRF數(shù)據(jù)庫中，LZ-8與AVMS67(鼠IgA重鏈的可變區(qū))的同源性最高，AVMS67、 A1MS47、G1HUHL、G6A與LZ-8中28%的氨基酸完全相同，其中11%的氨基酸殘基非常保守，主要包括Tyr/Phe、Ser/Thr、Lys/Arg、Asp/Glu、Ile/Leu或Val。

由于氨基酸組成的高度同源，因此真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白也應(yīng)該具有類似的二級結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)。Tanaka等[2]也對LZ-8的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其富含β-折疊，對其二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)LZ-8可能含有7個β-折疊。Lin等[7]也對松杉靈芝中FIP-gts的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明其二級結(jié)構(gòu)包括2個α-螺旋、7個β-折疊以及1個β-轉(zhuǎn)角(圖1)。Zhou等[10]推測紫芝中FIP-gsi的二級結(jié)構(gòu)與FIP-gts相似，包括2個α-螺旋、7個β-折疊以及1個β-轉(zhuǎn)角。Pushparajah等[17]推測FIP-lrh的二級結(jié)構(gòu)至少包括1個α-螺旋與7個β-折疊。Ko等[5，18]發(fā)現(xiàn)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve與LZ-8和FIP-gts有相似的二級結(jié)構(gòu)，由3個α-螺旋、6個β-折疊以及1個β-轉(zhuǎn)角組成，不同的是FIP-gts 3’端的β-折疊在FIP-fve中變成了α-螺旋。Lin等[7]利用酵母雙雜交和點(diǎn)突變的方法研究發(fā)現(xiàn)，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白N端約10個氨基酸的α-螺旋結(jié)構(gòu)對二聚體的形成以及其識別靶細(xì)胞表面受體發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要。將真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白與免疫球蛋白A重鏈可變區(qū)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者在相似的區(qū)域形成β-折疊，只是后者可形成9個β-折疊。

2003年，Seow等[19]采用懸滴法獲得了金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve的晶體，并用X-射線對其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其為二聚體結(jié)構(gòu)。2003年，Paaventhan等[20]對金針菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，利用NaBr滲透對該蛋白進(jìn)行單項(xiàng)不規(guī)則晶體衍射，進(jìn)一步證實(shí)了FIP-fve為二聚體結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)類似“啞鈴型”。研究發(fā)現(xiàn)，2個單體各自N端的α-螺旋(HA和HB)通過疏水作用結(jié)合到一起，分別與之鄰近的2個反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)(SA和SB)通過氫鍵結(jié)合到一起形成了β片層。每個單體中的其他β-折疊依靠分子間的氫鍵形成β片層，圖2中的E-B-A形成1個片層，G-F-C-C’形成另一個片層，與免疫球蛋白樣折疊(Ig-like fold)相似，被稱為FNⅢ型折疊。該折疊是一種7個β折疊-s型與8個β折疊-h型的中間過渡結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)又被稱為“假-h型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)”構(gòu)型，這種構(gòu)型廣泛存在于很多功能蛋白質(zhì)中，卻是首次在真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白中被發(fā)現(xiàn)。真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的N端大部分是疏水氨基酸，還不存在半胱氨酸，而不能形成二硫鍵，因此疏水作用是維持2個單體N端的α螺旋形成二聚體的主要作用力。2009年，Huang等[21]分析了赤靈芝中LZ-8的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其也是由2個單體形成的同源二聚體，與FIP-fve的FNIⅡ型折疊類似，β折疊A-B-E與G-F-C-D分別形成2個片層。2007年，Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)小孢子靈芝中的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-gmi的晶體結(jié)構(gòu)為同源四聚體(圖3)。

圖1 FIP-gts(B)[7]的氨基酸序列與二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Amino acid sequences and the secondary structure of FIP-gts(B)

3 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的生物學(xué)功能

3.1 凝集血紅細(xì)胞 迄今為止，已研究的幾種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白都可以凝集哺乳動物的血紅細(xì)胞，并且凝集能力一般較強(qiáng)，低濃度的蛋白就可以產(chǎn)生明顯的凝集效果。雖然每種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白凝集血細(xì)胞的活性不具有種屬特異性，但也具有選擇性，并不是每種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以凝集所有動物的紅細(xì)胞。Kino等[1]研究發(fā)現(xiàn)從菌絲體中分離純化的天然LZ-8可以凝集綿羊血紅細(xì)胞，最小凝集濃度為6.25 μg/mL。Liang等[22]在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中重組表達(dá)了LZ-8，發(fā)現(xiàn)其能凝集綿羊血紅細(xì)胞，最小凝集濃度為12.5 μg/mL。Xue等[23]研究發(fā)現(xiàn)10.0 μg/mL的重組表達(dá)LZ-8才可以凝集小鼠血紅細(xì)胞。Lin等[24]研究發(fā)現(xiàn)3.13 μg/mL重組表達(dá)的LZ-8就能凝集綿羊血紅細(xì)胞。但是，天然的LZ-8與重組表達(dá)的LZ-8均不能凝集人的4種血細(xì)胞。低劑量的FIP-vvo就可以凝集大鼠(0.52 μg/mL)、小鼠(1.10 μg/mL)和兔(0.13 μg/mL)的血紅細(xì)胞，但不能凝集人的血紅細(xì)胞[6]。然而，Ko等[5，18]研究發(fā)現(xiàn)FIP-fve(大于2.00 μg/mL)可以凝集人的血紅細(xì)胞。Pushparajah等[17]研究發(fā)現(xiàn)0.34 μmol/L原核表達(dá)的FIP-lrh可以凝集人和小鼠的血紅細(xì)胞。Li等[13]原核重組表達(dá)了褐腐菌的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-ppl，發(fā)現(xiàn)64 μg/mL的表達(dá)產(chǎn)物能夠凝集兔子的血紅細(xì)胞，但高濃度的FIP-ppl也不能凝集人的血紅細(xì)胞。一般而言，一些簡單的寡糖或糖復(fù)合物可以抑制凝集素的血細(xì)胞凝集活性，但卻不能抑制真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的[6]，表明這2種蛋白凝集血紅細(xì)胞的機(jī)制應(yīng)該不同，據(jù)此推測真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可能特異的識別比多糖更為復(fù)雜的寡糖連[25]。

圖2 FIP-fve(A)[19]與LZ-8[21](B)的晶體結(jié)構(gòu)Fig.2 The crystal structure of FIP-fve(A)and LZ-8(B)

圖3 FIP-gmi晶體的四聚體結(jié)構(gòu)[4]Fig.3 The tetramer structure of Fip-gmi crystal

3.2 促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖 研究發(fā)現(xiàn)，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞和人外周血淋巴細(xì)胞的有絲分裂。Kino等[1]在培養(yǎng)的鼠脾細(xì)胞中加入LZ-8，然后以放射性同位素[3H]的增加來檢測鼠脾細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)[3H]隨著LZ-8量的增加而增加，表明LZ-8可以促進(jìn)鼠脾細(xì)胞的有絲分裂。當(dāng)LZ-8的量達(dá)到3.13 μg/mL，鼠脾細(xì)胞的增殖達(dá)到最大，隨著LZ-8量的進(jìn)一步增加，鼠脾細(xì)胞的增殖反而下降，表明LZ-8促進(jìn)脾細(xì)胞的有絲分裂呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。重組表達(dá)的LZ-8也具有促進(jìn)鼠脾細(xì)胞增殖的作用[23-24]。Hsu等[6]采用放射性同位素[3H]的方法證實(shí)FIP-vvo可以促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)人外周淋巴細(xì)胞增殖的最大濃度為5.0 μg/mL。Ko等[5]研究發(fā)現(xiàn)FIP-fve促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞的增殖效果不如LZ-8和FIP-vvo，當(dāng)其濃度為100.0 μg/mL時最能促進(jìn)人外周淋巴細(xì)胞的增殖。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的FIP-fve可以促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1/G0期向S期的轉(zhuǎn)化。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)2.0 μg/mL的FIP-ppl可以最大程度促進(jìn)鼠脾細(xì)胞的增殖。Haak-Frendscho等[27]和van der Hem等[28]研究LZ-8對人外周淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)LZ-8先是激活巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生產(chǎn)生細(xì)胞因子和α腫瘤壞死因子，這些因子進(jìn)而會促進(jìn)人外周淋巴細(xì)胞的增殖。

3.3 抗過敏與Arthus反應(yīng) 小鼠的活體試驗(yàn)表明，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以抑制其系統(tǒng)過敏與Arthus反應(yīng)。當(dāng)給小鼠經(jīng)皮下或腹腔注射牛血清蛋白使其致敏，對照組小鼠均出現(xiàn)過敏反應(yīng)，而注射了LZ-8和FIP-fve的試驗(yàn)組小鼠均不表現(xiàn)出過敏癥狀，表明這2種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有完全抑制過敏反應(yīng)的作用[1，5]。然而，Hsu等[6]發(fā)現(xiàn)注射了FIP-vvo的試驗(yàn)組小鼠大部分出現(xiàn)了過敏癥狀，抑制過敏反應(yīng)的作用不如LZ-8和FIP-fve。當(dāng)用牛血清蛋白或48/80復(fù)合物注射小鼠的足墊，小鼠就會發(fā)生Arthus反應(yīng)而足墊出現(xiàn)水腫。當(dāng)再給小鼠的足墊注射以上3種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白后，小鼠足墊的水腫就會減弱，表明真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白可以減弱Arthus反應(yīng)[1，5-6]。Kino等[29]用乙肝病毒的表面抗原免疫小鼠，同時給小鼠腹腔注射LZ-8，發(fā)現(xiàn)LZ-8可以抑制小鼠產(chǎn)生抗體，因此認(rèn)為這是LZ-8抑制系統(tǒng)過敏與Arthus反應(yīng)的原因。Hsu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，與LZ-8和FIP-fve誘導(dǎo)Th1產(chǎn)生IFN-γ與IL-2相比，F(xiàn)IP-vvo不僅可以誘導(dǎo)Th1產(chǎn)生IFN-γ與IL-2，而且可以誘導(dǎo)Th2產(chǎn)生IL-4，而IL-4進(jìn)一步促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖與分化，最終釋放IgE。這也解釋了FIP-vvo不能有效抑制過敏與Arthus反應(yīng)的原因。Hsieh等[30]發(fā)現(xiàn)口服FIP-fve可以抑制小鼠因食用卵清蛋白而引起的過敏反應(yīng)。Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)FIP-fve可以抑制羽刺皮癬螨2型抗原引起的呼吸道炎癥。

3.4 抗腫瘤作用 藥用真菌具有顯著的抗腫瘤作用，并且發(fā)現(xiàn)真菌中提取的混合蛋白可以有效抑制腫瘤，因此藥用真菌越來越得到學(xué)者們的重視[32]。近年來研究表明，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白具有良好的抗腫瘤作用，受到越來越多的關(guān)注，而且發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤的機(jī)制具有多樣性。

2006年，Chang等[33]報(bào)道給患肝癌的小鼠口服FIP-fve表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用，抑制腫瘤的生長，明顯延長了其壽命，其機(jī)制是通過激活機(jī)體的特異性與非特異性免疫應(yīng)答，進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和腹腔細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)FIP-ppl可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC823與肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

在真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白抗腫瘤方面，Liao等[34]研究發(fā)現(xiàn)原核重組表達(dá)的FIP-gts可以抑制人肺癌細(xì)胞A549的生長，其機(jī)制可能是c-myc轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的啟動子上，抑制其轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。2007年，Liao等[35]研究發(fā)現(xiàn)FIP-gts進(jìn)入細(xì)胞后定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起鈣離子的釋放而激活鈣離子依賴的信號通路，抑制人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)而抑制端粒酶活性。2008年，Liao等[36]發(fā)現(xiàn)原核重組表達(dá)的FIP-gts可以阻止A549的細(xì)胞周期，使其停滯在G1期，進(jìn)而降低細(xì)胞的生長和表現(xiàn)出抗腫瘤活性。2014年，Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)FIP-gts可以促進(jìn)順鉑耐藥的尿路上皮癌細(xì)胞發(fā)生自噬。此外，Wang等[38]研究發(fā)現(xiàn)人1型非轉(zhuǎn)移性克隆23基因與FIP-gts協(xié)同作用可增強(qiáng)其對癌細(xì)胞遷移的抑制作用。

Lin等[24]研究發(fā)現(xiàn)酵母中重組表達(dá)的LZ-8對人類白血病NB4具有明顯的殺傷作用，當(dāng)其濃度為16.0 μg/mL時起抑制作用，抑制率為38.5%，表現(xiàn)出一定的抗癌活性，其機(jī)制為引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。2011年，Wu等[39]研究發(fā)現(xiàn)重組的LZ-8使細(xì)胞周期在G1期停止并阻止細(xì)胞的生長；此外，重組的LZ-8還可以抑制移植Lewis肺癌細(xì)胞小鼠的癌細(xì)胞的生長。這些研究表明，重組表達(dá)的LZ-8在體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)中均能抑制癌細(xì)胞的生長，其機(jī)制為LZ-8引起核糖體應(yīng)激促進(jìn)p53的表達(dá)，p53又抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行使細(xì)胞停滯在G1期。Liang等[40]研究發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的LZ-8可以引起人胃癌細(xì)胞SGC-7901的自噬，其機(jī)制為LZ-8引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活A(yù)TF4-CHOP途徑，進(jìn)一步激活泛素/蛋白酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解系統(tǒng)，從而引起細(xì)胞發(fā)生自噬，并且該自噬反應(yīng)不依賴含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。Cong等[41]研究發(fā)現(xiàn)10.0 μg/mL 的LZ-8就能誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251的凋亡，并且抑制其細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)化，因此LZ-8表現(xiàn)出抗人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251的生物學(xué)活性。

2010年，Lin等[42]研究發(fā)現(xiàn)FIP-gmi可以抑制表皮生長因子介導(dǎo)的EGFR和AKT信號通路的磷酸化與激活、Cdc42 GTPase的激活和微絲解聚，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲；同時，Lin等[43]也發(fā)現(xiàn)FIP-gmi可以下調(diào)腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。Hsin等[44-45]研究發(fā)現(xiàn)，無論在體內(nèi)試驗(yàn)還是體外試驗(yàn)中，F(xiàn)IP-gmi均可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬而引起細(xì)胞死亡。Chiu等[46]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IP-gmi通過抑制Akt-mTOR-p70S6K 細(xì)胞信號通路而誘導(dǎo)多重耐藥肺癌細(xì)胞的自噬。然而，Hsin等[47]在肺癌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)FIP-gmi引起的細(xì)胞自噬可以增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。

3.5 其他生物學(xué)功能 除了生物學(xué)活性外，Kino等[48]發(fā)現(xiàn)靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白LZ-8可以抑制自主免疫性糖尿病的發(fā)生，腹腔注射LZ-8試驗(yàn)小鼠的胰腺沒有炎癥并且分泌胰島素的細(xì)胞數(shù)量正常，然而未經(jīng)LZ-8處理的對照組小鼠表現(xiàn)出胰腺炎和分泌胰島素的細(xì)胞數(shù)量減少，并且表現(xiàn)出糖尿病臨床癥狀。van der Hem等[28，49]研究發(fā)現(xiàn)LZ-8可以增加異體皮膚移植小鼠的存活時間。此外，還發(fā)現(xiàn)LZ-8可以延緩胰臟移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和延長該小鼠的存活期，持續(xù)地給小鼠使用LZ-8可以進(jìn)一步延長其生存時間，且不會產(chǎn)生毒副作用。

Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-fve能夠誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)，適量的FIP-fve對ICAM-1的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。Miyasaka等[50]研究發(fā)現(xiàn)LZ-8主要選擇性地提高U937細(xì)胞系CD11b的表達(dá)，并且存在劑量依賴性；LZ-8可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，顯著增強(qiáng)IFN-r誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和U937細(xì)胞的相互黏合；可以選擇性地促進(jìn)MOLT4細(xì)胞上CD2的表達(dá)；促進(jìn)人T細(xì)胞與羊血紅細(xì)胞的玫瑰花結(jié)的形成。因此，LZ-8可以通過調(diào)節(jié)黏附分子的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用。

4 展望

藥用、食用真菌在我國民間的應(yīng)用已有1 000多年，在其他一些亞洲國家其相關(guān)的應(yīng)用也有悠久的歷史，但對其研究大多停留在多糖以及一些小分子次生代謝物上，雖然也有一些應(yīng)用于臨床的案例，但并不廣泛。隨著分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，利用藥用、食用真菌培養(yǎng)獲得大量重組免疫調(diào)節(jié)蛋白的研究取得了較好的進(jìn)展。此外，學(xué)者已經(jīng)對真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入研究，這將為有效利用真菌資源探索能提高人體免疫力的功能食品和新型免疫調(diào)節(jié)蛋白藥物奠定了基礎(chǔ)。利用基因工程手段可以大量獲得真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，發(fā)現(xiàn)其與天然分離純化的蛋白不僅具有相似的結(jié)構(gòu)而且還表現(xiàn)出相似的生物學(xué)功能，因此利用基因工程獲得真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白是一種重要手段和發(fā)展的必然趨勢。因此，利用重組表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，深入研究其功能及作用機(jī)制是今后真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的重要研究方向之一。與此同時，真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在臨床方面的開發(fā)與利用應(yīng)該得到關(guān)注，這也是研究真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白功能的初衷。參考文獻(xiàn)

[1] KINO K，YAMASHITA A，YAMAOKA K，et al.Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein，ling zhi-8(LZ-8)，fromGanodermalucidium[J].Journal of biological chemistry，1989，264(1)：472-478.

[2] TANAKA S，KO K，KINO K，et al.Complete amino acid sequence of an immunomodulatory protein，ling zhi-8(LZ-8).An immunomodulator from a fungus，Ganodermalucidium，having similarity to immunoglobulin variable regions[J].Journal of biological chemistry，1989，264(28)：16372-16377.

[3] MURASUGI A，TANAKA S，KOMIYAMA N，et al.Molecular cloning of a cDNA and a gene encoding an immunomodulatory protein，Ling Zhi-8，from a fungus，Ganodermalucidum[J].Journal of biological chemistry，1991，266(4)：2486-2493.

[4] WU M Y，HSU M F，HUANG C S，et al.A 2.0 ? structure of GMI，a member of the fungal immunomodulatory protein family fromGanodermamicrosporum[J].Protein crystallogr，2007，2：132.

[5] KO J L，HSU C I，LIN R H，et al.A new fungal immunomodulatory protein，F(xiàn)IP-fve isolated from the edible mushroom，F(xiàn)lammulinavelutipesand its complete amino acid sequence[J].European journal of biochemistry，1995，228(2)：244-249.

[6] HSU H C，HSU C I，LIN R H，et al.Fip-vvo，a new fungal immunomodulatory protein isolated fromVolvariellavolvacea[J].Biochemical journal，1997，323(Pt2)：557-565.

[7] LIN W H，HUNG C H，HSU C I，et al.Dimerization of the N-terminal amphipathic α-helix domain of the fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugae(Fip-gts)defined by a yeast two-hybride system and site-directed mutagenesis[J].Journal of biological chemistry，1997，272(32)：20044-20048.

[8] 林景衛(wèi)，段作文，關(guān)山越，等.樹舌靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因克隆，生物信息學(xué)分析及真核表達(dá)載體構(gòu)建[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47(1)：1-7.

[9] 蘇愷琪，王雪飛，周選圍.黑靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆和生物信息學(xué)分析[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2012，30(1)：65-71.

[10] ZHOU X W，XIE M Q，HONG F，et al.Genomic cloning and characterization of a FIP-gsi gene encoding a fungal immunomodulatory protein fromGanodermasinensisZhao et al.(Aphyllophoromycetideae)[J].International journal of medicinal mushrooms，2009，11(1)：77-86.

[11] LI F，WEN H A，LIU X Z，et al.Gene cloning and recombinant expression of a novel fungal immunomodulatory protein fromTrametesversicolor[J].Protein expression and purification，2012，82(2)：339-344.

[12] 林景衛(wèi)，關(guān)山越，鐘鳴，等.血紅鉚釘菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因克隆及其生物信息學(xué)分析和重組表達(dá)[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46(5)：561-567.

[13] LI S Y，SHI L J，DING Y，et al.Identification and functional characterization of a novel fungal immunomodulatory protein fromPostiaplacenta[J].Food and chemical toxicology，2015，78：64-70.

[14] SHEU F，CHIEN P J，HSIEH K Y，et al.Purification，cloning，and functional characterization of a novel immunomodulatory protein fromAntrodiacamphorata(bitter mushroom)that exhibits TLR2-dependent NF-κB activation and M1 polarization within murine macrophages[J].Journal of agricultural and food chemistry，2009，57(10)：4130-4141.

[15] HUNG C L，CHANG A J，KUO X K，et al.Molecular cloning and function characterization of a new macrophage-activating protein fromTremellafuciformis[J].Journal of agricultural and food chemistry，2014，62(7)：1526-1535.

[16] 葉波平，王慶華，周書進(jìn)，等.靈芝蛋白質(zhì)的分離及其免疫活性研究[J].藥物生物技術(shù)，2002，9(3)：150-152.

[17] PUSHPARAJAH V，F(xiàn)ATIMA A，CHONG C H，et al.Characterisation of a new fungal immunomodulatory protein from tiger milk mushroom，Lignosusrhinocerotis[J].Scientific reports，2016，6：30010.DOI：10.1038/srep30010.

[18] KO J L，LIN S J，HSU C P，et al.Molecular cloning and expression of a fungal immunomodulatory protein，F(xiàn)IP-fve，fromFlammulinavelutipes[J].Journal of the formosan medical association，1997，96(7)：517-524.

[19] SEOW S V，KUO I C，PAAVENTHAN P，et al.Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies on the fungal immunomodulatory protein Fve from the golden needle mushroom(Flammulinavelutipes)[J].Acta crystallographica section D，2003，59(8)：1487-1489.

[20] PAAVENTHAN P，JOSEPH J S，SEOW S V，et al.A 1.7? structure of Fve，a member of the new fungal immunomodulatory protein family[J].Journal of molecular biology，2003，332(2)：461-470.

[21] HUANG L，SUN F，LIANG C Y，et al.Crystal structure of LZ-8 from the medicinal fungusGanodermalucidium[J].Proteins structure function and bioinformatics，2009，75(2)：524-527.

[22] LIANG C Y，ZHANG S Q，LIU Z Y，et al.Ganodermalucidumimmunomodulatory protein(LZ-8) expressed inPichiapastorisand the identification of immunocompetence[J].Chinese journal of biotechnology，2009，25(3)：441-447.

[23] XUE Q，DING Y X，SHANG C H，et al.Functional expression of LZ8，a fungal immunomodulatory protein fromGanodermalucidiuminPichiapastoris[J].Journal of general and applied microbiology，2008，54(6)：393-398.

[24] LIN J W，HAO L X，XU G X，et al.Molecular cloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatory protein fromGanodermaluciduminPichiapastoris[J].World journal of microbiology and biotechnology，2009，25(3)：383-390.

[25] 林景衛(wèi)，孫非，張韌，等.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2005，21(6)：477-480.

[26] WANG P H，HSU C I，TANG S C，et al.Fungal immunomodulatory protein fromFlammulinavelutipesinduces interferon-gamma production through p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J].Journal of agricultural and food chemistry，2004，52(9)：2721-2725.

[27] HAAK-FRENDSCHO M，KINO K，SONE T，et al.Ling Zhi-8：A novel T cell mitogen induces cytokine production and upregulation of ICAM-1 expression[J].Cellular immunology，1993，150(1)：101-113.

[28] VAN DER HEM L G，VAN DER VLIET J A，BOCKEN C F，et al.Ling Zhi-8：Studies of a new immunomodulating agent[J].Transplantation，1995，60(5)：438-443.

[29] KINO K，SONE T，WATANABE J，et al.Immunomodulator，LZ-8，prevents antibody production in mice[J].International journal of immunopharmacology，1991，13(8)：1109-1115.

[30] HSIEH K Y，HSU C I，LIN J Y，et al.Oral administration of an edible-mushroom-derived protein inhibits the development of food-allergic reactions in mice[J].Clinical and experimental allergy，2003，33(11)：1595-1602.

[31] LIU Y H，KAO M C，LAI Y L，et al.Efficacy of local nasal immunotherapy for Dp2-induced airway inflammation in mice：Using Dp2 peptide and fungal immunomodulatory peptide[J].Journal of allergy and clinical immunology，2003，112(2)：301-310.

[32] SULLIVAN R，SMITH J E，ROWAN N J.Medicinal mushrooms and cancer therapy：Translating a traditional practice into Western medicine[J].Perspectives in biology and medicine，2006，49(2)：159-170.

[33] CHANG H H，SHEU F.Anti-tumor mechanisms of orally administered a fungal immunomodulatory protein fromFlammulinavelutipesin mice[J].FASEB Journal，2006，20(5)：1057.

[34] LIAO C H，HSIAO Y M，HSU C P，et al.Transcriptionally mediated inhibition of telomerase of fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugaein A549 human lung adenocarcinoma cell line[J].Molecular carcinogenesis，2006，45(4)：220-229.

[35] LIAO C H，HSIAO Y M，SHEU G T，et al.Nuclear translocation of telomerase reverse transcriptase and calcium signaling in repression of telomerase activity in human lung cancer cells by fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugae[J].Biochemical pharmacology，2007，74(10)：1541-1554.

[36] LIAO C H，HSIAO Y M，LIN C H，et al.Induction of premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugae[J].Food and chemical toxicology，2008，46(5)：1851-1859.

[37] LI J R，CHENG C L，YANG W J，et al.FIP-gts potentiate autophagic cell death against cisplatin-resistant urothelial cancer cells[J].Anticancer research，2014，34(6)：2973-2983.

[38] WANG P H，YANG S F，CHEN G D，et al.Human nonmetastatic clone 23 type 1 gene suppresses migration of cervical cancer cells and enhances the migration inhibition of fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugae[J].Reproductive sciences，2007，14(5)：475-485.

[39] WU C T，LIN T Y，HSU H Y，et al.Ling Zhi-8 mediates p53-dependent growth arrest of lung cancer cells proliferation via the ribosomal protein S7-MDM2-p53 pathway[J].Carcinogenesis，2011，32(12)：1890-1896.

[40] LIANG C Y，LI H R，ZHOU H，et al.Recombinant Lz-8 fromGanodermaluciduminduces endoplasmic reticulum stress-mediated autophagic cell death in SGC-7901 human gastric cancer cells[J].Oncology reports，2012，27(4)：1079-1089.

[41] CONG W R，XU H，LIU Y，et al.Production and functional characterization of a novel fungal immunomodulatory protein FIP-SN15 shuffled from two genes ofGanodermaspecies[J].Applied microbiology and biotechnology，2014，98(13)：5967-5975.

[42] LIN C H，SHEU G T，LIN Y W，et al.A new immunomodulatory protein fromGanodermamicrosporuminhibits epidermal growth factor mediated migration and invasion in A549 lung cancer cells[J].Process biochemistry，2010，45(9)：1537-1542.

[43] LIN C H，HSIAO Y M，OU C C，et al.GMI，aGanodermaimmunomodulatory protein，down-regulates tumor necrosis factor α-induced expression of matrix metalloproteinase 9 via NF-κB pathway in human alveolar epithelial A549 cells[J].Journal of agricultural and food chemistry，2010，58(22)：12014-12021.

[44] HSIN I L，OU C C，WU T C，et al.GMI，an immunomodulatory protein fromGanodermamicrosporum，induces autophagy in non-small cell lung cancer cells[J].Autophagy，2011，7(8)：873-882.

[45] HSIN I L，SHEU G T，JAN M S，et al.Inhibition of lysosome degradation on autophagosome formation and responses to GMI，an immunomodulatory protein fromGanodermamicrosporum[J].British journal of pharmacology，2012，167(6)：1287-1300.

[46] CHIU L Y，HU M E，YANG T Y，et al.Immunomodulatory protein fromGanodermamicrosporuminduces pro-death autophagy through Akt-mTOR-p70S6K pathway inhibition in multidrug resistant lung cancer cells[J].PLoS One，2015，10(5)：63-64.

[47] HSIN I L，OU C C，WU M F，et al.GMI，an immunomodulatory protein fromGanodermamicrosporum，potentiates cisplatin-induced apoptosis via autophagy in lung cancer cells[J].Molecular pharmaceutics，2015，12(5)：1534-1543.

[48] KINO K，MIZUMOTO T，SONE T，et al.An immunomodulating protein，Ling Zhi-8(LZ-8)prevents insulitis in non-obese diabetic mice[J].Diabetologia，1990，33(12)：713-718.

[49] VAN DER HEM L G，VAN DER VLIET J A，BOCKEN C F，et al.Prolongation of allograft survival with Ling Zhi-8，a new immunosuppressive drug[J].Transplantation proceedings，1994，26(2)：746.

[50] MIYASAKA N，INOUE H，TOTSUKA T，et al.An immunomodulatory protein，Ling Zhi-8，facilitates cellular interaction through modulation of adhesion molecules[J].Biochemical and biophysical research communications，1992，186(1)：385-390.

Advances of Research on the Structure and Function of Fungal Immunomodulatory Proteins

TIE Wei-fang1, JIA Jun-zhong2, GUO Wen-ping3

(1. Department of Medicine, Hetao University, Bayannur, Inner Mongolia 015000; 2. Inner Mongolia Bayannur City Hospital, Bayannur, Inner Mongolia 015000; 3. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100)

Fungal immunomodulatory proteins(FIPs)is a kind of low molecular weight proteins with many biological functions. The sequence character and structure of FIPs were introduced， and the latest research progress on its biological functions were reviewed. Finally，its development trend in the future was forecasted.

Fungal immunomodulatory protein；Structure；Biological functions

帖衛(wèi)芳(1984- )，女，山西大同人，講師，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

2016-11-18

Q 949.32；R 392

A

0517-6611(2016)35-0020-05