■王 超 西野直樹 金 海 薛樹媛

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.日本岡山大學(xué)自然科學(xué)研究科動物生產(chǎn)學(xué)學(xué)院，日本岡山，700-8530）

青貯的有氧變敗是指青貯里面附著或殘存的酵 母菌、霉菌以及需氧菌，隨著青貯的開封因為空氣的進入而恢復(fù)活性，利用青貯中殘存的糖類、發(fā)酵過程中生成的乳酸、醋酸等作為能源物質(zhì)迅速增殖，并且把這些物質(zhì)分解為CO2和水，同時釋放出大量的熱，使青貯的溫度升高的現(xiàn)象。同時，由于酸類被消耗，蛋白質(zhì)和氨基酸的分解，產(chǎn)生氨氣，使青貯中的pH值升高，因此，青貯中酵母、霉菌以及需氧菌殘存數(shù)量多的時候，更容易發(fā)生有氧變敗[1]。青貯飼料開封后發(fā)生有氧變敗，大量的糖、乳酸和氨基酸發(fā)生分解，使干物質(zhì)含量減少，通常減少量在2%～11%，變敗嚴重的能達到30%[2-4]。由于有氧變敗而使?fàn)I養(yǎng)價值和適口性都下降，從而使乳牛的采食量和產(chǎn)乳量都下降。而且青貯在發(fā)生有氧變敗后，經(jīng)常有青霉菌、紅曲霉菌、黃曲霉菌和毛霉菌等真菌類出現(xiàn)，這些真菌會產(chǎn)生紅曲霉毒素、黃曲霉毒素等各種毒素，使乳牛出現(xiàn)下痢，甚至中毒死亡等，嚴重影響了乳牛的健康和生產(chǎn)。另外，霉菌毒素在動物體內(nèi)很難代謝分解，將繼續(xù)排泄到乳制品中，最終危害人類健康。所以，青貯飼料開封后如何抑制有氧變敗，一直是一個課題。為了解決青貯飼料開封后的有氧變敗的問題，科學(xué)家發(fā)明了很多種類的添加劑，有化學(xué)制劑、抗生素、微生物制劑等。

化學(xué)制劑如甲酸、丙酸、丙酸鹽、己酸、山梨酸以及氨氣等，對青貯具有不同程度的抑制變敗的作用[1]。化學(xué)物質(zhì)的使用，具有成本高、不容易普及的特點?？股氐奶砑右部梢砸种魄噘A的變敗，但是由于成本比化學(xué)制劑還要高，而且從2006年開始EU（歐洲聯(lián)盟）規(guī)定：禁止任何治療以外的抗生素物質(zhì)作為添加劑類在畜禽飼料中使用。因此，抗生素的使用在青貯生產(chǎn)中實際應(yīng)用的很少。而乳酸菌制劑不僅可以改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，還可以增加奶牛的產(chǎn)乳量。因此，乳酸菌制劑一直備受關(guān)注。到現(xiàn)在為止，Ranjit、Kleinschmit、Tay?lor、Nishino等發(fā)現(xiàn)在加工青貯時添加乳酸菌Lactobacil?lus buchneri，青貯飼料開封后具有強效抑制有氧變敗的作用[5-11]。關(guān)于乳酸菌制劑的添加量，Moon等的研究表明，一般材料附著乳酸菌數(shù)量為103～104cfu/g，添加菌制劑要達到106cfu/g，成為優(yōu)勢菌種時，可以抑制其它雜菌的生長發(fā)育，從而改善青貯的發(fā)酵品質(zhì)，因此，現(xiàn)在青貯加工時乳酸菌的添加量都為鮮草重的106cfu/g[12]。在Nishino等的研究表明全混合青貯飼料（簡稱TMR青貯）開封后，在空氣中放置7 d也不發(fā)生有氧變敗，利用培養(yǎng)（活菌分離法）和非培養(yǎng)（PCR-DGGE法）的方法對TMR青貯中的細菌和細菌群態(tài)進行解析，既在TMR青貯中分離出了L.buchneri，又在PCR-DGGE圖譜中確認出了L.buchneri的菌體DNA，因此認為TMR青貯不發(fā)生有氧變敗跟L.buchneri有很大關(guān)系[13-15]。而王超等利用PCR-DGGE圖譜對日本全國各地市場銷售的大量的TMR青貯的微生物群態(tài)分析后，在TMR青貯中未發(fā)現(xiàn)L.buchneri，由此得出L.buchneri不是保持TMR青貯不發(fā)生有氧變敗的唯一原因。

TMR青貯中出現(xiàn)了在普通牧草青貯中未被報道過的乳酸菌類如：Lactobacillus panis、Lactobacillus fru?menti、Lactobacillus raffinolactis、Lactobacillus vacci?nostercus、Lactobacillus oris、Lactobacillus acetotoler?ans、Lactobacillus farciminis和Lactobacillus mindensis等。在夏秋季節(jié)生產(chǎn)的TMR青貯中共同存在Lactoba?cillus acetotolerans、Lactobacillus panis、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus farciminis等菌，這幾株菌最先是從一種叫做“發(fā)面引子”中的分離得到的乳酸菌類[16-17]，“發(fā)面引子”也是一種不容易發(fā)生變敗的物質(zhì)[18]，因而，推測這類“發(fā)面引子”乳酸菌類對于抑制有氧變敗有一定的作用。由于“發(fā)面引子”乳酸菌存在于夏秋季節(jié)加工生產(chǎn)的發(fā)酵TMR青貯中，我們認為“發(fā)面引子”乳酸菌類適宜在較高的溫度下生長。由于市售發(fā)酵TMR青貯一般的存放期間為2個月左右基本全部出售，因此，本試驗在25℃和35℃時，選擇發(fā)酵TMR青貯中存在的“發(fā)面引子”乳酸菌類Lactobacillus panis、Lactobacillus frumenti和Lactobacillus farciminis對意大利黑麥草進行添加并且存放2個月，驗證“發(fā)面引子”乳酸菌類對于意大利黑麥青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)、有氧變敗和微生物群態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 添加劑用乳酸菌的凍干干燥粉末的制備

Lactobacillus panis、Lactobacillus frumenti和Lac?tobacillus farciminis由日本理化研究所購進。利用MRS液體培養(yǎng)基復(fù)活培養(yǎng)，經(jīng)過3次純化培養(yǎng)后，將菌液以8 000 r/min的速度進行離心15 min，去上清液后在沉淀物中加入10%（w/v）脫脂乳搖勻，利用真空冷凍干燥機冷凍干燥制成粉末，對回收粉末在添加試驗之前利用MRS固體培養(yǎng)基進行活菌數(shù)測定，以便確定制作青貯時的添加量。

1.2 添加試驗

在意大利黑麥草的頭茬草的出穗期收割，預(yù)干8 h候后用鍘草機切斷為2～3 cm的小段。取凍干的菌制劑粉末用自來水溶解制成為0.5×109cfu/ml菌液，以2 ml/kg的量添加到鮮草中作為試驗組，以添加相同量自來水的鮮草作為對照組，充分混合后取500 g左右裝入青貯專用袋中，利用抽真空機抽成真空并密封。每個添加做3個重復(fù)，分別置于25℃和35℃溫箱中貯存2個月。

1.3 測定內(nèi)容

活菌數(shù)、干物質(zhì)含量、pH值、乳酸、揮發(fā)性脂肪酸、酒精等含量、微生物群態(tài)、有氧變敗等。

1.3.1 活菌數(shù)

在無菌狀態(tài)下開封稱取20 g青貯飼料，加入180 ml滅菌生理食鹽水（0.90%）4℃恒溫冰箱中放置30 min，充分振蕩后取1 ml原液，加入9 ml滅菌生理食鹽水中，按照梯度稀釋法依次稀釋到10-6。乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基；酵母和霉菌用YM固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)計數(shù)。

1.3.2 干物質(zhì)

取青貯樣品在60℃烘干箱內(nèi)干燥48 h，烘干完成后在空氣中放置30 min后稱重測定其干物質(zhì)含量。

1.3.3 pH值、揮發(fā)性脂肪酸含量

取20 g青貯飼料加入180 ml蒸餾水，利用榨汁機榨1 min，用2層醫(yī)用紗布過濾后，再用濾紙過濾，濾液用電極式pH計測定pH值。乳酸、揮發(fā)性脂肪酸、酒精用HPLC測定。HPLC是用測定有機酸離子交換柱（ICSeq COREGEL-87H column,Tokyo Chemical In?dustry Co.,Tokyo,Japan），0.004 mol/l H2SO4作為流動相，流速為0.6 ml/min，柱溫度為60℃，青貯水溶液經(jīng)0.20 μm的濾器過濾后，取10 μl進行分析。

1.3.4 微生物群態(tài)測定

利用PCR-DGGE的方法分析測定：利用試劑盒（DNeasy Tissue Kit，QIAGEN，Maryland，USA）從青貯樣品中提取出細菌和真菌DNA，細菌DNA的PCR是在16S rRNA的V3領(lǐng)域為對象，引物為GC357f(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG GGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 517r(5’-AT?TACCGCGGCTGCTGG-3’)。PCR混合液為：20 mmol/l Tris-HCl(pH 值9.3)，50 mmol/l KCl，2.0 mmol/l MgCl2，0.2 mmol/l dNTP，2.5 U Taq DNA聚合酶（TaKaRa Bio Inc.,Japan)。PCR的條件為：95℃ 10 min預(yù)熱，93℃3 s變性，65℃、60℃以及55℃ 30 s的退火，72℃1 min的延伸。退火每個溫度為10個循環(huán)，采用溫度漸降式的降落PCR方法（Pedro等，2001）。真菌DNA的PCR是18S rRNA領(lǐng)域為對象，NS3（5’-CGCCCGCC?GCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC-3’）和 YM951r（5’-TTGGCAAATGCTTTCGC-3’）為引物擴增的。PCR的混合液與細菌DNA的PCR相同，PCR條件為95℃預(yù)熱10 min，93℃變性1 min，55℃、50℃以及45℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。

DGGE(變性梯度凝膠電泳)是利用BioRad的DCode系統(tǒng),丙烯酰胺的濃度為10%(w/v),變性劑濃度為20%～50%(細菌)和20%～30%（真菌）,電泳條件為60 ℃、150V、12 h，用SYBR Green l（Cambrex BioScience lnc,Rock?land,ME）染色DNA后，在紫外線燈光下拍照分析。

1.3.5 青貯開封后有氧變敗的測定

貯存2個月后的青貯開封時取一半樣品做各類分析，取剩余料中的150 g放入500 ml的塑料瓶中，每個瓶內(nèi)設(shè)置連續(xù)測溫儀器，樣品溫度高于室溫2℃時判斷為變敗。對開封放置7 d的樣品也回收，與開封時一樣測定活菌數(shù)、干物質(zhì)含量、pH值、乳酸、揮發(fā)性脂肪酸、酒精等含量、微生物群態(tài)等。

1.3.6 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計處理是用JMP（ver.7,SAS Institute,Tokyo,Japan）進行分析的。乳酸菌和貯存溫度作為因素進行二元分散分析，包括交叉作用進行要素分析。關(guān)于乳酸菌的添加菌種的不同，進行了Tukey的多重分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準。

2 結(jié)果

意大利黑麥草原料中的成分和菌落數(shù)量如表1所示，由于進行了預(yù)干,意大利黑麥草的DM為500 g/kg,原料草附著的乳酸菌數(shù)較少，相對于酵母菌以及大腸菌為105cfu/g的水平，乳酸菌只有103cfu/g。

表1 意大利黑麥草原料中化學(xué)物質(zhì)含量和菌落數(shù)量

貯存2個月后的青貯中發(fā)酵產(chǎn)物和活菌數(shù)如表2所示。

在25℃和35℃貯存時,高溫貯存青貯的干物質(zhì)含量極顯著性高于低溫貯存青貯(P＜0.01),而相同溫度貯存的青貯干物質(zhì)含量,添加組和對照組沒有顯著性差異。不同溫度貯存青貯的pH值分別從5.98和5.58下降到4.40和4.80左右，添加組均顯著低于對照組(P＜0.01)。不同溫度中貯存青貯的乳酸含量，對照組分別為0.92 g/kg DM和0.32 g/kg DM，添加組分別為10.22 g/kg DM以上和6.02 g/kg DM以上，添加組極顯著高于對照組（P＜0.01）。25℃貯存的對照組醋酸含量為0.77 g/kg DM，添加組分別為1.08、1.20 g/kg DM和0.53 g/kg DM，L.panis和L.frumenti添加組顯著高于對照組和L.farciminis組(P＜0.05)。35℃貯存的對照組醋酸含量為0.82 g/kg DM，添加組分別為0.57、0.63 g/kg DM和0.71 g/kg DM，添加組和對照組無差異。在25℃貯存的對照組中表現(xiàn)為酒精生成量為優(yōu)勢的發(fā)酵特性,酒精含量達到21.44 g/kg DM，而添加組酒精含量分別為9.93、12.81 g/kg DM和7.27 g/kg DM，添加組極顯著低于對照組（P＜0.01）。在35℃貯存的對照組酒精含量為3.23 g/kg DM，添加組酒精含量分別為1.35、2.22 g/kg DM和3.88 g/kg DM，添加組和對照組無差異。25℃貯存的對照組中2,3-丁二醇含量為4.46 g/kg DM，添加組分別為1.64、2.39 g/kg DM和1.15 g/kg DM，L.panis和L.far?ciminis添加組顯著低于對照組（P＜0.05）；35 ℃貯存的對照組中2,3-丁二醇含量為0.37 g/kg DM，添加組分別為0.15 g/kg DM、0.14 g/kg DM和0.23 g/kg DM，添加組和對照組無差異。不同溫度下，添加組可以極顯著降低乳酸菌含量，25℃貯存青貯乳酸菌數(shù)分別為108、106、106cfu/g和107cfu/g，L.panis和L.frumenti添加組極顯著低于對照組（P＜0.01）。35℃貯存青貯乳酸菌數(shù)分別為107、106、106cfu/g和106cfu/g，添加組極顯著低于對照組（P＜0.01）。25℃貯存青貯，相對于對照組104cfu/g的酵母菌數(shù)量，添加L.panis和L.farciminis的青貯中酵母菌數(shù)都在102cfu/g以下，而添加L.frumenti的青貯酵母菌數(shù)在103cfu/g以下。35℃貯存對照組和添加組大腸菌數(shù)都在102cfu/g以下。

表2 貯存2個月后青貯中發(fā)酵產(chǎn)物和活菌情況

青貯開封后有氧變敗試驗結(jié)果如下：開封后放置于空氣中后，不論在25℃貯存還是35℃貯存，對照組和添加組的pH值都有上升，但是25℃貯存的L.panis青貯組的3個平行中有2個樣品的pH值未升高，也未出現(xiàn)L.frumenti以及L.farciminis添加組的發(fā)酵生成物消失的現(xiàn)象。添加組青貯的發(fā)熱時間都比對照組青貯延遲1 d，即使是發(fā)熱了，溫度升高程度也低于對照組。

有氧變敗試驗結(jié)果表明，25℃貯存青貯，pH值分別為7.46、5.43、6.99和6.25，均高于開封時pH值，但是L.panis組有低于其他組的趨勢；35℃貯存青貯有氧變敗試驗后，pH值分別為6.72、5.91、6.13和7.31，均高于開封時pH值，但是L.farciminis組有高于其他組的趨勢。25℃貯存乳酸含量分別為1.41、18.22、10.61 g/kg DM和17.89 g/kg DM,L.panis和L.farciminis組變敗后樣品中乳酸含量極顯著高于對照（P＜0.01）；35℃貯存青貯有氧變敗后樣品中乳酸含量無顯著性差異。25℃貯存醋酸含量分別為4.50、1.63、3.64 g/kg DM和1.61 g/kg DM,L.panis和L.farciminis組變敗后樣品中醋酸含量極顯著高于對照（P＜0.01）；35℃貯存青貯有氧變敗后樣品中醋酸含量無顯著性差異。有氧變敗試驗后，樣品中酒精含量大幅下降，而25℃貯存的L.panis組酒精含量卻大幅升高；35℃貯存的L.panis組酒精含量稍有升高。25℃貯存青貯L.panis組的2,3-丁二醇含量稍有升高，其他組的都下降，35℃貯存時，2,3-丁二醇含量均升高。變敗試驗后，除25℃貯存青貯L.panis和L.frumenti組的乳酸菌數(shù)量比開封時略有升高外，而對照組和L.farciminis組乳酸菌數(shù)量都下降。

DGGE的結(jié)果可見(見圖1)，L.panis，L.frumenti以及L.farciminis菌株出現(xiàn)在相同位置處（見圖1），因而可以判定為添加的L.panis、L.frumenti以及L.farcimi?nis在青貯中還保留下了DNA。另一方面，添加組在有氧變敗前后的細菌DGGE圖譜幾乎沒有變化，因此預(yù)測L.panis、L.frumenti以及L.farciminis對于抑制變敗有一定的效果。

3 討論

圖1 25℃和35℃貯存2個月的無添加(Con)和添加Lactobacillus panis(Pan)、Lactobacillus frumenti(Fru)和Lactobacillus farciminis(Far)的意大利黑麥草青貯在開封時以及在25℃有氧變敗測試后青貯中微生物群態(tài)

25℃貯存青貯L.panis和L.frumenti添加組中乳酸和醋酸含量顯著高于對照組和L.farciminis組，L.panis和L.frumenti是異型發(fā)酵乳酸菌[19-20]，可以把葡萄糖發(fā)酵生成乳酸和醋酸或者是乳酸和酒精[17]，L.far?ciminis是同型發(fā)酵乳酸菌，可以把葡萄糖發(fā)酵生成乳酸[21]，但是在添加試驗結(jié)果中L.panis和L.frumenti表現(xiàn)為乳酸為優(yōu)勢的發(fā)酵，這與一般意義的異型發(fā)酵乳酸菌不太一致，原因也不能確定，需要繼續(xù)研究其發(fā)酵特性。25℃貯存青貯中，對照組產(chǎn)生大量的酒精和2,3-丁二醇，添加L.panis和L.farciminis組的酒精和2，3-丁二醇含量顯著低于對照組，可能是因為添加的L.panis和L.farciminis有抑制大腸菌、芽孢桿菌和酵母菌的能力，因為在青貯發(fā)酵過程中，葡萄糖在大腸桿菌和酵母菌作用下，產(chǎn)生酒精，丙酮酸在大腸桿菌的作用下生成2,3-丁二醇，Bacillus polymyxa將糖類發(fā)酵為酒精和2,3-丁二醇[22]。25℃貯存添加L.panis、L.frumenti組中乳酸菌數(shù)量極顯著低于對照組，酵母菌數(shù)量也低于對照組，表明L.panis和L.frumenti對于細菌和真菌有一定的抑制作用。

35℃貯存時,添加組青貯的乳酸含量極高于對照組，而添加組之間差異不顯著，添加組與對照組的醋酸含量沒有差異，添加的三株菌均表現(xiàn)為乳酸發(fā)酵型，該結(jié)果顯示高溫貯存條件下與預(yù)想的在35℃貯存時添加效果比25℃的更明顯的結(jié)果所相反，也許因為在較高溫度貯存時L.panis、L.frumenti和L.farciminis的發(fā)酵特性受到了影響，后續(xù)需要進行生長溫度對其影響的確認試驗。35℃貯存青貯中，L.panis、L.frumenti添加組酒精和2,3-丁二醇含量稍低于對照組和L.farciminis組，可能是在較高溫度下L.panis、L.frumenti比L.farciminis對大腸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌的有較強的抑制能力。

35℃貯存青貯中干物質(zhì)含量高于25℃貯存青貯，乳酸含量、酒精含量和2,3丁二酸含量均低于25℃貯存青貯含量。作者在對不同溫度貯存TMR青貯發(fā)酵品質(zhì)的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，隨著貯存溫度的升高，干物質(zhì)含量增加，25℃和35℃貯存90 d時，乳酸含量和醋酸有降低的趨勢，酒精含量在貯存30 d和90 d時，35℃低于25℃青貯含量。Kim等的研究結(jié)果也顯示：在20℃和40℃貯存的玉米青貯中，干物質(zhì)含量、乳酸和醋酸含量隨著貯存溫度升高而出現(xiàn)降低的趨勢[23]。這與王超[17]的研究結(jié)果一致。

L.farciminis的添加效果不是很明顯,這個原因還不清楚,但是在王超前期的研究中,冬季加工的全混合青貯中檢測出了L.farciminis[13]，因此認為，可能是因為25℃的貯存溫度比L.farciminis的適宜生長溫度偏高而未表現(xiàn)出添加效果。35℃貯存時，L.panis、L.frumenti和L.farciminis的添加效果均不明顯，出現(xiàn)這個結(jié)果可能是因為細菌需要適宜的生長溫度,而在35℃的貯存溫度，不是細菌的適宜生長溫度，因此未表現(xiàn)出添加效果。

L.panis、L.frumenti和L.farciminis的添加均未表現(xiàn)出有氧變敗的抑制效果。25℃貯存時，對有氧變敗有一定的效果，但是未出現(xiàn)像L.buchneri那樣的明顯的抑制效果。添加的3種“發(fā)面引子”乳酸菌中L.panis的效果還保留有一些懸念。開封時不僅酵母菌的數(shù)量減少,能夠印證抑制變敗的發(fā)酵產(chǎn)物未出現(xiàn)變化。L.panis抑制變敗中稍微延長了變敗的時間，乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的減少也較少些，但是沒有特別明顯的抑制真菌的效果，隨著低pH值和有機酸的增加，可能是非解離酸在發(fā)揮抗菌作用。

從以上這些的結(jié)果，我們認為能夠維持發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性的“發(fā)面引子”乳酸菌中單個的菌株是較難發(fā)揮作用的。由于在發(fā)酵TMR中存在多種“發(fā)面引子”乳酸菌，而我們在添加試驗時只是選了幾株單株菌進行添加，而未出現(xiàn)明顯添加效果，可能是幾種乳酸菌混合后的協(xié)同效應(yīng)下，發(fā)揮其有氧變敗的抑制作用。

4 結(jié)論

TMR青貯中存在的乳酸菌的添加可以改變意大利黑麥草青貯的發(fā)酵產(chǎn)物，但是不能抑制有氧變敗。今后還需要進行混合菌株的添加試驗，以說明TMR青貯不易發(fā)生有氧變敗的原因。