繆春明，沈維高，王雷，魏盾

法舒地爾對蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠腦皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

繆春明，沈維高，王雷，魏盾△

目的 探討法舒地爾對蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后大鼠腦皮質(zhì)B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bax蛋白表達的影響。方法30只大鼠隨機均分為假手術(shù)組、SAH組及SAH+法舒地爾組。采用枕大池二次注血法制備大鼠SAH模型，假手術(shù)組將自體血替換為生理鹽水，SAH+法舒地爾組為第2次注血后30 min腹腔注射法舒地爾注射液，劑量為3 mg/kg。24 h后比較各組大鼠術(shù)后的一般情況和神經(jīng)行為學評分，TUNEL染色法觀察腦皮質(zhì)細胞凋亡情況，免疫組化染色和Western blotting檢測Bcl-2和Bax蛋白表達情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，SAH組和SAH+法舒地爾組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)運動功能障礙體征；SAH組神經(jīng)行為學評分（2.68±0.31）低于假手術(shù)組（5.00±0.00），SAH+法舒地爾組（3.27±0.35）高于SAH組（P＜0.05）。SAH組和SAH+法舒地爾組均可見明顯的神經(jīng)細胞凋亡，且SAH+法舒地爾組凋亡程度輕于SAH組。SAH組的Bcl-2表達水平低于假手術(shù)組，而Bax表達水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）；SAH+法舒地爾組Bcl-2表達水平較SAH組升高，而Bax表達量較SAH組降低（P＜0.05）。結(jié)論法舒地爾可明顯改善SAH引起的神經(jīng)功能損傷，其作用機制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達有關(guān)。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；基因，bcl-2；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；細胞凋亡；法舒地爾

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid haemorrhage，SAH）是神經(jīng)科最常見的急癥之一，因腦血管痙攣導致腦組織缺血、缺氧，從而進一步造成急性腦損傷，是SAH致殘率和致死率高的主要原因［1］。B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）和Bax是與腦缺血神經(jīng)元凋亡關(guān)系最密切的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是促調(diào)亡基因［2］，目前，在SAH的發(fā)生、發(fā)展中，Bcl-2/Bax的表達情況仍未明確。法舒地爾作為一種新型鈣離子通道阻滯劑，在臨床上廣泛用于SAH后腦血管痙攣等引起的缺血性腦血管疾病治療，具有神經(jīng)保護作用［3］。然而，法舒地爾的神經(jīng)保護作用是否與調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達有關(guān)尚未明確。本研究通過建立大鼠SAH模型，探討法舒地爾對SAH大鼠腦皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，以期為臨床治療腦血管疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司）；Bcl-2抗體、Bax抗體、β-actin抗體、驢抗鼠IgG二抗試劑盒（美國Santa Cruz公司）；DAB顯色增強劑（美國Sigma公司）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）；其余動物實驗、免疫組織化學實驗及Western blotting實驗所需的常規(guī)試劑均購自碧云天公司。

1.2 模型制作與分組清潔級健康雄性Wistar大鼠30只（吉林大學實驗動物研究中心），10周齡，體質(zhì)量（250±20）g，采用隨機數(shù)字表法均分為假手術(shù)組、SAH組及SAH+法舒地爾組。各組實驗動物均經(jīng)10%水合三氯乙醛以300 mg/kg腹腔麻醉后俯臥位固定于實驗操作臺上，項部剪毛備皮消毒，剪開自枕外隆凸至第二頸椎處的皮膚，鈍性分離各層組織，暴露寰椎，觀察到白色堅韌的寰枕膜后，充分止血，生理鹽水紗布覆蓋。采用枕大池二次注血法制備大鼠SAH模型，分別在第1天和第2天于眼球后靜脈叢抽取無抗凝自體血0.3 mL和0.2 mL，經(jīng)環(huán)枕膜注入枕大池，使之形成SAH模型，術(shù)后縫合切口，保持尾高頭低位30 min，放入籠中自然蘇醒，自由攝食和飲水。按照分組不同，假手術(shù)組將自體血替換為生理鹽水，SAH+法舒地爾組為第2次注血后30 min腹腔注射法舒地爾注射液，劑量為3 mg/kg。建模成功標準：觀察到實驗動物出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為障礙，神經(jīng)行為學評分＜3分［4］，本組模型制作均成功。

1.3 神經(jīng)行為學評分各組大鼠于二次注血后24 h采用Loeffler的神經(jīng)行為學5分制評分法［4］評估其神經(jīng)行為情況，評分標準為：5分，當抓住大鼠背部時，能正常運動，在5 s內(nèi)翻身；4分，自主運動減少，5 s內(nèi)能翻身；3分，大于5 s翻身；2分，不能翻身；1分，不能運動。

1.4 免疫組織化學染色法觀察各組Bcl-2、Bax的表達情況及TUNEL法觀察神經(jīng)細胞的凋亡情況各組在神經(jīng)行為學評分后，各取5只麻醉，采用中性福爾馬林經(jīng)心臟灌注固定，取腦組織做冰凍切片，按照免疫組化試劑盒說明書步驟，染色觀察凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達情況；同時，采用TUNEL法觀察神經(jīng)細胞的凋亡情況。細胞呈黃色或棕黃色染色時即可判斷為陽性染色，每組實驗動物切片隨機抽取5個高倍鏡視野，比較陽性染色細胞數(shù)量情況。

1.5 Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達情況各組在神經(jīng)行為學評分后，采用斷頸法處死每組余下的各5只，快速取腦皮質(zhì)組織，提取蛋白并測定蛋白濃度，每孔加樣40 μg進行電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，分別孵育一抗Bcl-2、Bax和內(nèi)參β-actin于4℃過夜，驢抗鼠IgG二抗37℃孵育1 h，滴加ECL化學發(fā)光試劑，于Bio-Rad成像系統(tǒng)中顯影并采集圖像，讀取灰度值，目的條帶灰度值分別與內(nèi)參條帶灰度值進行比較。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況SAH組大鼠麻醉蘇醒后的神經(jīng)運動障礙體征明顯，主要表現(xiàn)為反應遲鈍、嗜睡、活動減少、精神狀態(tài)差、球結(jié)膜充血、毛發(fā)雜亂，攝食飲水量明顯少于術(shù)前，尤其是二次注血后，上述表現(xiàn)更明顯，但未發(fā)現(xiàn)偏癱或截癱大鼠。SAH+法舒地爾組第一次注血麻醉蘇醒后的表現(xiàn)與SAH組基本相似，二次注血蘇醒后的上述表現(xiàn)要明顯輕于SAH組。假手術(shù)組麻醉蘇醒后僅出現(xiàn)精神狀態(tài)稍差，攝食飲水活動略有減少，其余表現(xiàn)均不明顯。

2.2 法舒地爾對SAH大鼠神經(jīng)行為學的影響假手術(shù)組、SAH組及SAH+法舒地爾組的神經(jīng)行為學評分分別為（5.00±0.00）、（2.68±0.31）及（3.27±0.35）分，差異有統(tǒng)計學意義（F=7.843，P＜0.05），其中SAH組低于假手術(shù)組、SAH+法舒地爾組（P＜0.05）。

2.3 舒地爾對SAH大鼠皮質(zhì)細胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響免疫組化結(jié)果顯示，假手術(shù)組和SAH+法舒地爾組內(nèi)均可見Bcl-2陽性細胞，主要在細胞漿內(nèi)呈棕黃色表達，SAH組未見明顯的Bcl-2陽性細胞。SAH組和SAH+法舒地爾組內(nèi)均可見Bax陽性細胞，且SAH組陽性細胞數(shù)明顯多于SAH+法舒地爾組，假手術(shù)組未見明顯的Bax陽性細胞。TUNEL法標記神經(jīng)細胞凋亡結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見明顯的TUNEL陽性細胞，SAH組和SAH+法舒地爾組內(nèi)均可見TUNEL陽性細胞，且SAH組陽性細胞數(shù)明顯多于SAH+法舒地爾組。見圖1。

2.4 法舒地爾對SAH大鼠腦皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白表達的影響SAH組的Bcl-2表達水平低于假手術(shù)組，而Bax表達水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）；SAH+法舒地爾組Bcl-2表達水平較SAH組升高，而Bax表達量較SAH組降低（P＜0.05）。見圖2、表1。

Fig.1 The effect of fasudil on the expressions of Bcl-2 and Bax and apoptosis in cerebral cortex in SAH rats圖1 法舒地爾對SAH大鼠皮質(zhì)Bcl-2、Bax的表達和細胞凋亡的影響

Fig.2 The effect of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of SAH rats圖2 法舒地爾對SAH大鼠皮質(zhì)Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達的影響

Tab.1 The effect of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of SAH rats表1 法舒地爾對SAH大鼠皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白表達的影響（n＝5，）

Tab.1 The effect of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of SAH rats表1 法舒地爾對SAH大鼠皮質(zhì)Bcl-2和Bax蛋白表達的影響（n＝5，）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與SAH組比較，P＜0.05；SAH+法舒地爾組不與假手術(shù)組比較

組別假手術(shù)組SAH組SAH+法舒地爾組F Bcl-2/β-actin 0.37±0.08 0.09±0.03a 0.16±0.04b 8.114＊＊Bax/β-actin 0.13±0.04 0.24±0.03a 0.15±0.02b 7.902＊＊

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床對SAH的診斷取得了很大的進步，但對該病的病理生理學機制仍未闡明，且臨床治療效果仍不滿意，SAH致殘率和致死率均較高。因此，探討該病的發(fā)生機制，尋求有效的治療方案對挽救患者生命，提高患者生存質(zhì)量具有重要意義［5］。另外，建立簡便易行、能模擬臨床發(fā)病過程且重復性好的動物模型，對該疾病的研究至關(guān)重要。研究顯示，大鼠的腦動脈血管結(jié)構(gòu)與人類相似，是建立SAH模型的較理想動物［6］。另有研究認為，采用枕大池二次注血法建立SAH模型是研究該疾病的可靠且理想的方法，已廣泛應用于該疾病的相關(guān)研究［4］。因此，本組研究采用該方法建立SAH模型，且結(jié)果顯示大鼠出現(xiàn)SAH的典型表現(xiàn)，神經(jīng)行為學評分顯示SAH組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，表明模型復制成功，在此基礎(chǔ)上的研究結(jié)果可靠。

研究普遍認為，SAH可引起腦血管痙攣，進而使腦組織發(fā)生缺血缺氧等系列反應，是導致該疾病患者出現(xiàn)神經(jīng)功能損害的重要原因［7］。其中，中樞神經(jīng)細胞凋亡是導致神經(jīng)功能障礙的重要發(fā)病機制，Bcl-2和Bax為與神經(jīng)元凋亡關(guān)系最為密切的一組凋亡相關(guān)基因，在SAH神經(jīng)功能損傷中發(fā)揮重要作用。Bcl-2抗凋亡作用與其能保護線粒體的穩(wěn)定性，抑制細胞色素c和凋亡誘導因子釋放有關(guān)；而Bax與Bcl-2相反，具有促進凋亡的作用，通過與線粒體上Bcl-2蛋白形成二聚體發(fā)揮作用，當Bax高表達時，形成同源二聚體的Bax/Bax促進凋亡，Bcl-2高表達時形成異源二聚體Bcl-2/Bax可以抑制凋亡的發(fā)生［2］。

鈣離子拮抗劑是臨床上預防和治療SAH后腦血管痙攣的有效手段，可有效阻止鈣離子進入細胞內(nèi)、抑制平滑肌收縮，達到解除血管痙攣之目的，從而保護了腦神經(jīng)元，穩(wěn)定其功能并增進腦血灌流，改善腦供血，提高細胞對缺氧的耐受力［8］。尼莫地平是目前臨床公認的對SAH后腦血管痙攣有效的藥物，是用于治療SAH的最具代表性藥物之一［9］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生SAH時，腦組織中的促凋亡相關(guān)蛋白Bax表達明顯升高，抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達亦明顯下降，并且這兩者的表達變化與SAH腦損傷密切相關(guān)［4,10］。因此，尼莫地平可以調(diào)節(jié)SAH大鼠組織中Bcl/Bax的表達水平，有助于減輕腦損傷，提示鈣離子拮抗劑可能通過抑制凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但臨床發(fā)現(xiàn)，尼莫地平雖然對緩解腦血管痙攣具有較好的療效，但存在較多的不良反應，影響了其治療效果［9］。法舒地爾是一種新型的細胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，屬于Rho激酶抑制藥物，對促進神經(jīng)功能的恢復，減輕臨床癥狀，減少病殘率有一定療效。臨床研究顯示，法舒地爾治療SAH的療效與尼莫地平相當，且不良反應更少，但其臨床作用機制仍未闡明［10］。有研究顯示，法舒地爾可有效降低血腦屏障的通透性，并通過緩解腦血管痙攣，增加腦血流量，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用［11］。另有研究認為，法舒地爾可以抑制創(chuàng)傷后腦組織的凋亡而發(fā)揮腦保護作用［12-13］。但法舒地爾對凋亡的調(diào)節(jié)作用是否也是通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達來實現(xiàn)的，目前尚少見相關(guān)研究報道。

本組研究一般情況觀察和神經(jīng)行為學評分結(jié)果顯示，法舒地爾減輕了SAH引起的神經(jīng)損傷；TUNEL法標記皮質(zhì)細胞的凋亡情況研究結(jié)果顯示，SAH+法舒地爾組的凋亡程度較SAH組明顯降低；免疫組織化學染色法結(jié)果顯示，SAH+法舒地爾組的Bcl-2陽性細胞數(shù)多于SAH組、Bax陽性細胞少于SAH組；Western blotting法檢測蛋白表達結(jié)果顯示，應用法舒地爾干預后，SAH大鼠的Bcl-2表達水平明顯上升，Bax表達水平明顯下降，表明在SAH后應用法舒地爾，實驗動物腦組織的凋亡程度降低，可明顯改善SAH引起的神經(jīng)功能損傷，因此，其作用機制可能是下調(diào)了促凋亡基因的表達，同時上調(diào)了抗凋亡基因的表達。

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（2016-07-19收稿 2016-08-29修回）

（本文編輯 陸榮展）

Effects of fasudil on the expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of rats with subarachnoid hemorrhage

MIAO Chunming,SHEN Weigao,WANG Lei,WEI Dun△
Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital of Beihua University,Jilin 132011,China△

ObjectiveTo investigate the effects of fasudil on expressions of Bcl-2 and Bax in cerebral cortex of model rats with subarachnoid hemorrhage(SAH).MethodsThirty rats were divided into sham operation group,SAH group and SAH+fasudil group,10 rats in each group.Double injection of blood into occipital cistern method was used for SAH model in SAH group and SAH+fasudil group.In the sham operation group,the blood injection was instead by normal saline.In the SAH+fasudil group,at 30 min after the second injection of blood,rats were administrated with intraperitoneal injection of fasudil at a dose of 3 mg/kg.The general situation,neurological score,TUNEL staining for cortex cell apoptosis,immune histochemical staining and Western blotting assay for Bcl-2 and Bax protein expression were compared 24 h after the operation between the three groups.ResultsCompared with the sham operation group,rats in SAH group and SAH+ fasudil group appeared obvious neurological deficits.The neurological score was significantly lower in SAH group(2.68± 0.31)than that of sham operation group(5.00±0.00).The neurological score was significantly higher in SAH+fasudil group (3.27±0.35)compared with that of SAH group(2.68±0.31,P＜0.05).There was obvious cell apoptosis in SAH group and SAH+fasudil group,and the apoptosis was less in SAH+fasudil group than that of SAH group(P＜0.05).The level of Bcl-2 expression was significantly lower in SAH group than that of sham operation group,and Bax expression was significantly higher in SAH group than that of sham operation group(P＜0.05).The level of Bcl-2 expression was significantly higher in SAH+fasudil group than that of SAH group,but Bax expression was significantly lower in SAH+fasudil group than that of SAH group(P＜0.05).ConclusionFasudil can improve the neurological damage in rats with SAH,which may be related with the regulation of apoptosis related proteins Bcl-2 and Bax.

subarachnoid hemorrhage;genes,bcl-2;bcl-2-associated X protein;apoptosis;fasudil

R651.1

A

10.11958/20160705

吉林省教育廳“十二五”科學技術(shù)研究［吉教科合字（2012）第149號］

北華大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編132011）

繆春明（1967），男，主任醫(yī)師，博士，碩士研究生導師，主要從事腦外科基礎(chǔ)臨床研究

△通訊作者E-mail：miaochunming218@163.com