丁協(xié)剛，劉 波,2，李世文，王行環(huán)

(1.武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院泌尿外科，湖北十堰 442000)

·基礎研究·

枸杞多糖通過氧化應激途徑促海綿體神經(jīng)再生的實驗研究

丁協(xié)剛1，劉 波1,2，李世文1，王行環(huán)1

(1.武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430071；2.湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院泌尿外科，湖北十堰 442000)

目的 探討氧化應激在枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)促海綿體神經(jīng)(cavernousnerves，CN)鉗夾損傷后再生中的作用。方法 84只雄性SD大鼠隨機平均分成3組，即假手術組、CN損傷對照組、LBP處理組。LBP處理組于術后第1天開始，連續(xù)灌胃2周。分別于術后1周、2周、4周、12周每組隨機取7只大鼠行血清丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性測定，術后12周電刺激CN測定海綿體內(nèi)壓，隨后取CN進行甲苯胺藍染色記錄神經(jīng)有髓鞘軸突數(shù)目。結果 在術后第1、2和第4周，LBP組超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于假手術組及損傷對照組；在術后第2周和第4周，LBP處理組MDA含量明顯低于假手術組及損傷對照組；術后12周LBP處理組平均海綿體內(nèi)壓、CN橫切面有髓鞘軸突數(shù)目均明顯高于損傷對照組，但均低于假手術組。結論LBP可通過減輕CN鉗夾損傷后的氧化應激來促進CN神經(jīng)再生及勃起功能的恢復。

枸杞多糖；勃起功能障礙；海綿體神經(jīng)

我們前期的研究表明，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)可以在一定程度上促鉗夾損傷海綿體神經(jīng)的再生[1]。為進一步闡述其機制，本實驗將LBP用于雙側(cè)CN鉗夾損傷后的大鼠，通過血清氧化應激指標的檢測和與勃起功能相關的形態(tài)學和功能學指標檢測，探討LBP是否通過其抗氧化機制促進CN再生修復和勃起功能恢復。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 甲苯胺藍(上海試劑三廠)；還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸(nicotinamideadeninedinucleotide2′-phosphate，NADPH)、硝基四氮唑藍(nitrotetrazoliumblue，NBT)、TritonX-100(美國Sigma公司)；OCT包埋劑、EM812包埋劑(北京中杉生物試劑公司)；丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。枸杞多糖在武漢大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)學系實驗室制備，參照我們前期的提取方法[2]，用前將枸杞多糖用生理鹽水稀釋，配成1mg/mL的溶液，4 ℃保存。

1.2 主要設備SXP-1C型手術顯微鏡(上海醫(yī)用儀器廠)；HC-X020顯微血管夾(寧波市成和顯微器械廠)；BL420-F生理記錄儀(成都泰盟科技有限公司)；超薄切片機(德國Leica公司)；CM1900恒冷式冰凍切片機(瑞典LKB公司)；OLYMPUS-DP12顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 實驗動物及分組 84只SPF級雄性SD大鼠，體重250～300g，購于武漢大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2008-0004，均經(jīng)性交配實驗證實有正常性功能。隨機均分為假手術組、損傷對照組及LBP組，每組28只。

1.4 動物模型的建立 在無菌狀態(tài)下，大鼠經(jīng) 1%戊巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于鼠臺上，取下腹正中切口，延長至陰莖根部，在外科手術顯微鏡(SXP-1B型，上海醫(yī)用儀器廠)下于兩側(cè)前列腺背外側(cè)找到盆神經(jīng)節(jié)及海綿體神經(jīng)，用顯微器械游離海綿體神經(jīng)后，參照我們前期的模型制作方法[3]，用顯微血管夾鉗夾兩側(cè)海綿體神經(jīng)各2min后逐層關腹。假手術組僅游離海綿體神經(jīng)而避免損傷。LBP組于術后第1天起每天按10mg/kg劑量行LBP灌胃,連續(xù)灌胃2周，對照組及假手術組灌胃給予同體積的生理鹽水。

1.5 氧化應激指標測定 分別于術后第1、2、4、12周每組各隨機取7只大鼠，經(jīng)心臟采血提取血清，測定大鼠血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽過氧化物酶活性，評價氧化應激水平。術后12周大鼠先行勃起功能測定再行心臟采血。

1.6 陰莖海綿體內(nèi)壓測定 術后3個月，各組大鼠再次用1%戊巴比妥(50mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉。再取下腹正中切口，在手術顯微鏡下找到CN并將其游離，然后延長下腹切口暴露出陰莖腳。用連接在生物機能實驗系統(tǒng)(BL420-F，成都泰盟科技有限公司)上的間距約1mm的雙極電極勾住CN，在陰莖腳處插入1只22號蝶形針頭，通過PE-50硅膠管連接壓力換能器，設置電極刺激參數(shù)為連續(xù)單刺激，電壓5V，波寬5ms，頻率20Hz，電刺激CN持續(xù)60s，記錄海綿體內(nèi)壓(intracavernouspressure，ICP)變化曲線。

1.7 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍染色 壓力測定完成后，立即取鉗夾處遠端3mm的海綿體神經(jīng)，置于2%的戊二醛磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中前固定，2%的餓酸后固定，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂(Epon-812)定向包埋，中點半薄橫切片1μm厚，經(jīng)1%甲苯胺藍染色，在OLYMPUS-DP12顯微鏡下放大400 倍拍片，觀察CN整個橫切面有髓鞘軸突的數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計學分析 各組實驗數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析和t檢驗統(tǒng)計分析，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血清氧化應激水平 如表1所示，術后第1周，3組大鼠血清丙二醛水平無顯著性差異，在第2周及第4周，LBP組丙二醛含量明顯低于假手術組及鉗夾損傷組(P<0.05)。如表2、表3所示，在術后第1、2周和第4周，LBP組超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯高于其他兩組(P<0.05)；但在術后12周，3組大鼠間血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠在術后不同時間血清丙二醛含量 (nmol/mL)

與假手術組和損傷對照組比較，*P<0.05。

表2 各組大鼠在術后不同時間血清超氧化物歧化酶活性 (U/mL)

組別 第1周 第2周 第4周 第12周假手術組44.72±11.2351.23±12.8554.26±11.5967.48±12.16損傷對照組41.29±11.5445.71±11.1350.64±12.9765.53±12.35LBP組78.54±12.29*86.98±13.26*75.04±14.28*67.02±12.59

與假手術組和損傷對照組比較，*P<0.05。

表3 各組大鼠在術后不同時間血清谷胱甘肽過氧化物酶活性 (U/mL)

組別 第1周 第2周 第4周 第12周假手術組124.52±13.14129.96±15.53138.41±16.55151.16±18.76損傷對照組120.35±15.91125.31±14.48133.22±17.18151.82±16.29LBP組163.79±16.17*179.41±17.36*159.24±17.63*152.02±17.39

與假手術組和損傷對照組比較，*P<0.05。

2.2ICP測定結果LBP組ICP值(82.8±8.9)mmHg顯著高于損傷對照組[(48.6±6.1)mmHg，P<0.05]，但低于假手術組[(125.6±9.8)mmHg，P<0.05]。

2.3 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍染色結果 假手術組(圖1A)CN橫切面有豐富的有髓鞘軸突，軸突排列整齊，結構完整，外觀形態(tài)正常，而損傷對照組(圖1B)軸突排列紊亂，軸突粗細不一。LBP組(圖1C)與損傷對照組相比，軸突數(shù)目顯著再生，軸突排列、軸突大小均趨向于正常外觀。LBP組有髓鞘軸突數(shù)目為(106.8±17.9)，明顯高于損傷對照組(64.9±13.86，P<0.05)，但低于假手術組(180.9±15.3，P<0.05)。

圖1 各組海綿體神經(jīng)干甲苯胺藍染色(×1 000)

A：假手術組；B：鉗夾損傷組；C：枸杞多糖處理組。

3 討 論

枸杞多糖(LBP)是枸杞子提取液的主要成分，而枸杞子是中醫(yī)臨床上常用的一種傳統(tǒng)中藥，具有滋補肝腎、益睛明目、潤肺、延緩衰老、壯陽等多種功效，在中醫(yī)男科上，應用較多。近年來的研究表明，LBP具有提高免疫、保護生殖系統(tǒng)、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等作用，而其諸多功效與其抗氧化作用有關[4]。枸杞多糖在體外細胞水平能明顯誘導人臍血間充質(zhì)干細胞、大鼠骨髓間充質(zhì)細胞向神經(jīng)元樣細胞分化，且與LBP的抗氧化應激功能明顯相關[5-6]。另有大量實驗證實LBP對中樞神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)等具有較好的神經(jīng)保護作用[7-9]。在前期的動物實驗中，我們也證實了枸杞多糖可促鉗夾損傷后CN的再生，因此，我們預測氧化應激在此過程中起重要作用。

在本實驗中，我們通過建立大鼠雙側(cè)CN鉗夾損傷的模型，在應用LBP灌胃處理后，監(jiān)測了不同時間段血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性測定來反應機體的氧化應激水平的變化規(guī)律，術后3個月，通過測定最大海綿體內(nèi)壓的變化，反映其勃起功能的恢復情況，CN甲苯胺藍染色來觀察其神經(jīng)損傷及修復情況。結果發(fā)現(xiàn)，在術后第1、2周和第4周，LBP組超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯高于其他兩組；在第2周及第4周，LBP組丙二醛含量明顯低于假手術組及鉗夾損傷組；在術后12周，三組大鼠間血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性差異均無統(tǒng)計學意義。但術后12周，損傷對照組ICP峰值的變化明顯降低，且CN橫切面軸突出現(xiàn)明顯萎縮和減少，而LBP應用組ICP、CN有髓鞘軸突數(shù)目雖低于假手術組，但均顯著高于損傷對照組。

由此可見，應用LBP可通過減輕CN鉗夾損傷后早期的氧化應激水平來促進CN損傷后的神經(jīng)再生和勃起功能的恢復。

[1] 劉波，丁協(xié)剛，趙頎涵，等.枸杞多糖對大鼠海綿體神經(jīng)鉗夾損傷的修復作用[J]. 中華實驗外科，2013，30(12):2560-2562.

[2] 羅瓊,閆俊,崔曉燕,等.枸杞多糖對輻照大鼠生殖系統(tǒng)損傷拮抗作用[J].中國公共衛(wèi)生,2011,27(10):1358-1359.

[3]DINGXG，LISW，ZHENGXM，etal.Theeffectofplatelet-richplasmaoncavernousnerveregenerationinaratmodel[J].AsianJAndrol，2009,11(2):215-221.

[4] 殷玥琪,印虹，孫桂菊.枸杞多糖抗氧化作用研究進展[J].中國醫(yī)藥生物技術，2012，7(5)：380-382.

[5] 陳曉嵐,陳芬,莫艷秀,等.枸杞多糖誘導人臍血間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化的實驗研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2007,7(8):1173-1175.

[6] 劉樹輝,馬云勝,曹中偉,等.枸杞多糖誘導大鼠骨髓間充質(zhì)細胞向神經(jīng)元樣細胞轉(zhuǎn)化的實驗研究[J].華北煤炭醫(yī)學院學報,2006,8(3):281-283.

[7]HOYS，YUMS，YANGXF，etal.Neuroprotectiveeffectsofpolysaccharidefromwolfberry，thefruitsofLyciumbarbarum，againsthomocysteine-inducedtoxicityinratcorticalneurons[J].JAlzheimersDis，2010，19(3):813-827.

[8]HOYS，YUMS，YIKSY，etal.Polysaccharidefromwolfberry，antagonizesglutamateexcitotoxicityinratcorticalneurons[J].CellMolNeurobiol,2009，29(8)：1233-1244.

[9]CHIUK，CHANHC，YEUNGSC，etal.ModulationofmicrogliabyWolfberryonthesurvivalofretinalganglioncellsinaratocularhypertensionmodel[J].JOculBiolDisInfor,2009，2(2)：47-56.

(編輯 王 瑋)

The neuroprotective effect of lycium barbarum polysaccharide after cavernous nerve injury is mediated by antioxidative mechanism

DING Xie-gang1，LIU Bo1,2，LI Shi-wen1，Wang Xing-huan1

(1.DepartmentofUrology，ZhongnanHospital，WuhanUniversity，Wuhan430071; 2.DepartmentofUrology，TaiheHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China)

ObjectiveToinvestigatetheneuroprotectiveeffectoflyciumbarbarumpolysaccharides(LBP)mediatedbyantioxidativemechanismaftercavernousnerve(CN)injury.MethodsAtotalof84maleSDratswererandomlydividedintothreegroups：shamoperationgroup(shamgroup)，bilateralCNcrushedgroup(controlgroup)，bilateralCNcrushedwithanoraladministrationofLBP1dayafterCNinjuryfor2weeks(LBPgroup).Malondialdehyde(MDA)，superoxidedismutase(SOD)andglutathioneperoxidase(GPX)wereevaluatedinweek1，2，4，and12.Erectilefunctionwasassessedbycavernousnerveelectrostimulationinweek12andnerveregenerationwasassessedbytoluidinebluestainingofCN.ResultsSODandGPXactivitiesintheLBPgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamandcontrolgroupinweek1，2and4.MDAlevelinLBPgroupwassignificantlylowerthanthatintheshamandcontrolgroupinweek2and4.Inweek12，themeanintracavernouspressure(ICP)，andthenumberofmyelinatedaxonsofCNsinLBPgroupweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup，butlowerthanthoseintheshamgroup.ConclusionLBPcouldpromotenerveregenerationanderectilefunctionrecoveryafterCNcrushinjurybyreducingantioxidativereaction.

lyciumbarbarumpolysaccharide;erectiledysfunction;cavernousnerve

2015-07-30

2016-09-21

國家自然科學基金(No.81100492)

李世文，教授，主任醫(yī)師，博士生導師.E-mail:drlishiwen@sina.com

丁協(xié)剛(1980-)，男，(漢族)，醫(yī)學博士，主治醫(yī)師.研究方向：泌尿外科及男科的基礎與臨床研究.E-mail:dxg1014@aliyun.com

R

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.12.016