何旭云 賀姣姣 鄭寧寧 王順春 李后開

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)中心，上海，201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海，201203)

?

黃芪多糖對肥胖小鼠的減肥作用與調(diào)節(jié)腸道菌群的關(guān)系研究

何旭云1賀姣姣1鄭寧寧1王順春2李后開1

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院中醫(yī)方證與系統(tǒng)生物學(xué)中心，上海，201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海，201203)

目的：觀察黃芪多糖(AstragalusPolysaccharides，APS)對于高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的減肥作用與調(diào)節(jié)腸道菌群的關(guān)系。方法：1)將50只C57bl/6J小鼠隨機分為5組(n=10)，分別為正常對照組(Con)、HFD(high-fat diet)組和APS低中高(在高脂飲食中添加分別添加2%，4%，或8%的APS)劑量組。利用高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)8周誘導(dǎo)出小鼠肥胖模型，給藥組同步喂養(yǎng)，每周進(jìn)行稱重。實驗周期結(jié)束后，收集各組糞便樣本，利用基于細(xì)菌16S rDNA測序的元基因組學(xué)方法，分析了APS對于高脂喂養(yǎng)小鼠腸道菌的影響。2)將10只C57bl/6J小鼠隨機分為2組(n=5)，分別為HFD_R組(HFD_Receptor)和APS_R組(APS_Receptor)，每天分別灌胃來自HFD組和APS低劑量組(2%APS)小鼠的新鮮糞便提取液進(jìn)行腸道菌移植，前八周給予正常飲食，后四周更換為HFD。結(jié)果：APS能夠明顯抑制高脂喂養(yǎng)小鼠肥胖的形成、減輕肝臟脂肪變性、降低肝臟TG水平、改善胰島素敏感性、顯著恢復(fù)高脂喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群紊亂，增加擬桿菌(Bacteroidetes)與厚壁門(Firmicutes)菌的相對豐度、降低變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌的相對豐度，并且，APS的減肥效應(yīng)能夠通過腸道菌移植轉(zhuǎn)移給高脂喂養(yǎng)受體小鼠。結(jié)論：APS對高脂喂養(yǎng)小鼠具有減肥作用，且APS的減肥作用與調(diào)節(jié)肥胖小鼠的腸道菌群有關(guān)。

黃芪多糖；肥胖；腸道菌群；胰島素敏感性；脂肪變性；16S rDNA

肥胖是多種慢性代謝性疾病的共同病理基礎(chǔ)[1-2]。21世紀(jì)肥胖的流行，及其所引發(fā)的各種代謝性疾病包括2型糖尿病、脂肪肝、高血壓及心血管疾病等嚴(yán)重威脅著人類的健康[3-6]。盡管一直以來，肥胖被認(rèn)為主要是由于遺傳及環(huán)境因素共同作用下，機體能量代謝失衡所導(dǎo)致[7-8]。2004年美國華盛頓大學(xué)Jeffrey Gordon等人在無菌小鼠中首次證實腸道菌群作為一種環(huán)境因素調(diào)控宿主體內(nèi)脂肪的聚集[9]，由此引發(fā)了國際上針對腸道菌群參與宿主能量代謝調(diào)控研究的熱潮。越來越多的研究證據(jù)表明腸道菌群在肥胖的發(fā)生發(fā)展中扮演了極其重要的角色[10-13]。目前認(rèn)為，人類的消化系統(tǒng)中有超過1 000種共生的腸道微生物，這些腸道微生物所含有的基因數(shù)目至少是我們宿主本身的100倍[14]。因此，腸道菌群又被認(rèn)為是肝臟以外的又一重要的“微生物器官”[15-16]。腸道菌群的主要功能包括調(diào)節(jié)宿主免疫功能[17]、抵抗病原菌侵入[18]、調(diào)節(jié)能量代謝[12]及參與對外源性化合物的代謝[14]等。研究表明，肥胖的形成伴隨有明顯的腸道菌群失衡[19]，尤其是在腸道中占有主要比例的厚壁門與擬桿菌門細(xì)菌的比例失調(diào)(Firmucutes/Bacteroidetes)，而針對肥胖的減肥措施能夠明顯恢復(fù)厚壁門與擬桿菌門細(xì)菌的比例[20]。因此，腸道菌群已經(jīng)被認(rèn)為是防治肥胖及相關(guān)疾病的重要干預(yù)靶標(biāo)[21]。

黃芪多糖(AstragalusPolysaccharides，APS)是傳統(tǒng)補氣中藥黃芪(Astragalus)中的主要活性成分之一。研究表明，APS能夠改善高脂喂養(yǎng)及糖尿病模型小鼠的葡萄糖代謝與胰島素敏感性[22-25]，降低高脂喂養(yǎng)大鼠血脂[26]，及血漿膽固醇水平[27]，并對高脂喂養(yǎng)小鼠的體重具有一定的降低作用[28]。但是，到目前為止，APS是否可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮減肥作用仍不清楚。本研究旨在從腸道菌群調(diào)節(jié)的角度，研究APS的減肥作用與調(diào)節(jié)腸道菌群的關(guān)系，明確腸道菌群是APS發(fā)揮減肥作用的重要干預(yù)靶標(biāo)。

1 材料

糞便DNA提取試劑盒(QIAGEN，德國，批號：154018883)；Ion Torrent PGM系統(tǒng)(Life Technology，美國);胰島素試劑盒(Rat/Mouse Insulin ELISA Kit Mercodia，瑞典，批號：24243)；TG試劑盒(南京建成，批號：20151008，)；T-CHO試劑盒(南京建成，批號：20151006)；HDL-C試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號：20160202123)，LDL-C試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號：20160201124)；血糖試紙(德國羅氏診斷有限公司，批號：473101)。高脂飼料(60 kcal% Fat，Research Diets，美國，批號：15110407)；黃芪多糖(純度>90%，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)。

C57雄性小鼠，清潔級，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。體重(20±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)大學(xué)動物實驗中心。

2 方法

2.1 高脂誘導(dǎo)小鼠肥胖模型復(fù)制與動物處理 C57小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)性的飼養(yǎng)后，將小鼠隨機分為5組：正常對照組(Con組，n=10)，高脂飲食組(HFD組，n=10)，APS低劑量組(APS2%，n=10)，APS中劑量組(APS4%，n=10)，APS高劑量組(APS8%，n=10)。Con組給予正常小鼠飼料，HFD組給予高脂飼料、3組給藥組在高脂飼料中分別添加低劑量(APS2%：20 g APS/kg HFD)、中劑量(APS4%：40 g APS/kg HFD)和高劑量(APS8%：80 g APS/kg HFD)的APS，所有動物連續(xù)喂養(yǎng)8周，期間每周測定動物體重1次。第8周末，所有動物禁食過夜，10%水合氯醛腹腔注射(100 μL/10 g體重)麻醉，心臟采血，室溫放置30 min后，3 000 r/min離心10 min，收集血清用于后續(xù)檢測。收集動物肝臟及睪丸周圍白色脂肪組織，準(zhǔn)確稱重，經(jīng)液氮快速冷凍后-80 ℃保存。收集盲腸內(nèi)容物，經(jīng)液氮快速冷凍后-80 ℃保存，用于腸道菌群分析。

2.2 血清生化指標(biāo)檢測 小鼠于實驗第七周時禁食過夜，次日早晨使用血糖試紙斷尾檢測小鼠空腹血糖。血清TG、TC、HDL、LDL采用酶法，血清胰島素采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行檢測。

2.3 肝臟與白色脂肪組織病理學(xué)檢測 將經(jīng)過10%中性福爾馬林固定24 h后的肝臟與白色脂肪組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，蘇木素與伊紅染色(HE)，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟脂肪變性程度及白色脂肪細(xì)胞的體積。

2.4 糞便細(xì)菌DNA提取與細(xì)菌16S rDNA測序分析 按照文獻(xiàn)的方法[29]，取50～100 mg盲腸內(nèi)容物，采用糞便DNA提取試劑盒，提取細(xì)菌總DNA，并對提取的DNA樣本進(jìn)行質(zhì)檢，檢驗合格的樣本用于后續(xù)的分析。采用16S rDNA V3區(qū)的通用引物V3R(5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和V3F(5′ATTACCGCGGCTGCTGG 3′)對質(zhì)檢合格的DNA樣品進(jìn)行擴增，并采用Ion Torrent PGM系統(tǒng)進(jìn)行上機測序。采用FASTX Toolkit 0.0.13軟件(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html)對測序的結(jié)果進(jìn)行過濾。要了解群體樣本的物種構(gòu)成就需要對序列進(jìn)行聚類，將彼此相似度高的序列分成同一類，分成的一個類就是一個操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)。為了得到每個OTU的對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifer貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類，并在各個水平(界、門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計每個樣品的群落組成[30]。根據(jù)各樣品OTU組成和豐度的差異，計算樣品間的相似度，繪制樣品的相似度樹，采用thetayc算法(http://www.mothur.org/wiki/Thetayc)進(jìn)行群落相似度的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PcoA)，以觀察各組腸道菌的整體差異?；贠TU的相對豐度(樣本中某一OTU的reads數(shù)/該樣本總OTU的reads總數(shù))，計算不同水平下(如門)樣本中各種菌在該樣本中的比例，從而比較不同組別下腸道菌內(nèi)部比例的差異。我們還選取了豐度在前100的OUT，基于這100個OTU的相對豐度，繪制熱圖(heatmap)，從而直觀地比較各組動物腸道菌的差別。

2.5 腸道菌移植試驗 為了明確APS改變的腸道菌在APS的減肥效應(yīng)中的作用，我們將提前經(jīng)過4周HFD與含2% APS的HFD飲食喂養(yǎng)小鼠的糞便細(xì)菌移植給另外2組受體小鼠。動物飼養(yǎng)于具有獨立凈化通風(fēng)的小鼠飼養(yǎng)籠(IVC，蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司)系統(tǒng)中，受體小鼠分別標(biāo)記為HFD_R與APS_R組，每組5只。供體小鼠糞便細(xì)菌制備方法參考已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)[31]，并經(jīng)過適當(dāng)?shù)男薷模词荏w小鼠在接受糞便移植前3 d連續(xù)灌胃給予廣譜抗生素亞胺培南100 mg·kg-1·d-1，以盡可能清除動物自身的腸道菌。每日清晨收集新鮮供體小鼠的糞便，每組約取150 mg糞便混懸在1.5 mL無菌生理鹽水中，靜置分層，取含細(xì)菌的上清液對受體小鼠進(jìn)行灌胃(100 μL/只)。受體小鼠于實驗前8周給予正常飼料喂養(yǎng)，后4周更換為高脂飲食。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用雙尾Student′st檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 APS明顯抑制高脂喂養(yǎng)小鼠肥胖的形成 本研究表明，高脂飲食喂養(yǎng)8周，成功復(fù)制出肥胖小鼠模型，而在3個實驗劑量下，APS明顯抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增長(圖1A)。日均攝食量及能量攝入的數(shù)據(jù)分析表明，高脂及APS喂養(yǎng)各組動物日均攝食量明顯低于正常飲食對照組(圖1B)，但是，各組間日均能量攝入沒有明顯差別(圖1C)。與正常組相比，小鼠性腺周圍白色脂肪重量及比例高脂喂養(yǎng)組明顯增多，在APS喂養(yǎng)組明顯降低(圖1D-E)。褐色脂肪是小鼠重要的能量消耗器官，本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠褐色脂肪的絕對重量在高脂飲食喂養(yǎng)明顯增加，并在APS組顯著降低，但是，各組動物褐色脂肪的比例沒有明顯差異(圖1F-G)，說明APS的減肥效應(yīng)不是通過增加褐色脂肪的耗能實現(xiàn)的?；诒敬窝芯恐械蛣┝康腁PS即具有明顯的減肥作用，我們選擇正常、高脂及低劑量的APS組，對3組動物白色脂肪組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果表明高脂飲食喂養(yǎng)動物脂肪細(xì)胞體積明顯增大，而APS喂養(yǎng)組脂肪細(xì)胞體積則顯著縮小(圖1H)。

注：A:各組小鼠體重增長曲線；B:小鼠平均日攝食量；C：小鼠平均日攝入能量；D-E:小鼠睪丸周圍白色脂肪重量及系數(shù)(白色脂肪重量/體重*100%)；F-G:小鼠褐色脂肪組織重量及系數(shù)(褐色脂肪重量/體重*100%)；H:小鼠白色脂肪組織HE染色(n=5，200倍)；*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，與正常對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001與高脂飲食組相比；采用雙尾t檢驗。

3.2 APS減輕高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟脂肪變性 為了進(jìn)一步了解APS對高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠血清及肝臟脂質(zhì)的影響，我們測定了各組小鼠血清TG，TC，HDL，LDL的水平，結(jié)果表明，我們意外發(fā)現(xiàn)，血清TG在高脂喂養(yǎng)組顯著低于正常對照組，而APS組血清TG水平呈現(xiàn)劑量依賴性的升高趨勢，高劑量的APS組基本與正常組相同(圖2A)，我們推測血清TG水平的變化與高脂飲食喂養(yǎng)的時間有關(guān)，而相似的結(jié)果也見于其他的研究報道[32-33]，在我們后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)高脂喂養(yǎng)時間延長到12周以上時，小鼠血清TG水平明顯升高(未發(fā)表數(shù)據(jù))。與TG不同的是，血清TC，LDL,HDL的水平在高脂喂養(yǎng)小鼠組均明顯高于正常對照組，而APS喂養(yǎng)對上述3種血清脂質(zhì)的水平?jīng)]有明顯作用(圖2B-D)。肝臟組織TG，TC檢測結(jié)果表明，高脂喂養(yǎng)明顯升高了小鼠肝臟TG水平，但TC水平?jīng)]有明顯升高，3種劑量下的APS喂養(yǎng)均明顯降低了肝臟TG水平，有趣的是，肝臟TC水平只有在高劑量的APS組明顯下降(圖2E-F)。我們同樣選擇正常、高脂及低劑量的APS組作為代表，對3組動物的肝臟組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)組小鼠肝臟有明顯的脂肪變性、脂質(zhì)聚集現(xiàn)象，而即使是低劑量的APS也能明顯改善高脂飲食所導(dǎo)致的肝臟脂肪變性程度(圖2G)。

圖2 APS減輕高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟脂肪變性(n=10)

注：A-D:小鼠血清TG，TC，HDL，LDL水平；E-F:小鼠肝臟TG，TC水平；G：小鼠肝臟組織HE染色圖片(n=5，200倍)；*P<0.05,**P<0.01與正常對照組相比；#P<0.05與高脂飲食組相比；采用雙尾t檢驗。

3.3 APS改善高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素敏感性 胰島素抵抗是肥胖為基礎(chǔ)的代謝性疾病的共同病理基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步明確APS對于胰島素敏感性的作用，我們分別測定了正常組、高脂飲食組及低劑量APS組動物空腹血糖及胰島素的水平，結(jié)果表明，8周高脂飲食及APS干預(yù)后，各組動物空腹血糖水平?jīng)]有明顯差異(圖3A)，但是，空腹胰島素的水平在高脂組明顯升高，在低劑量的APS組明顯降低(圖3B)，相應(yīng)的HOMA-IR指數(shù)也表明APS明顯改善了高脂喂養(yǎng)小鼠的胰島素抵抗(圖3C)。

3.4 APS明顯改變高脂喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu) 為了明確APS的減肥作用與改變腸道菌群的關(guān)系，我們利用基于16S rDNA序列測定的元基因組學(xué)方法，分析了正常組、高脂飲食組及低劑量的APS組腸道菌群。3組樣本間的PCoA圖顯示，高脂飲食喂養(yǎng)動物與正常對照組沿著第一主成分方向明顯分離，第一主成分對于整體區(qū)分的貢獻(xiàn)度達(dá)到43.61%，不過，正常組有一只動物與高脂飲食組位于第一主成分的同側(cè)，說明該只動物的腸道菌群結(jié)構(gòu)可能與高脂組相似。有趣的是，APS喂養(yǎng)組與正常組動物位于第一主成分的同側(cè)，并明顯與高脂組分離，說明APS喂養(yǎng)明顯改變了高脂飲食喂養(yǎng)動物的腸道菌群結(jié)構(gòu)(圖4A)。為了進(jìn)一步比較各組動物腸道菌群的差異，我們在門(phylum)的水平，比較了各個動物腸道菌群的組成。我們發(fā)現(xiàn)，在正常組及APS喂養(yǎng)組，擬桿菌與厚壁門菌占到所有細(xì)菌豐度的90%，而在高脂飲食喂養(yǎng)組僅70%左右，而變形菌門(Proteobacteria)細(xì)菌在高脂飲食組的豐度升高到25%左右(圖4B)。上述結(jié)果表明，高脂飲食喂養(yǎng)明顯改變了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，而APS則明顯恢復(fù)了高脂飲食所改變的腸道菌組成。熱圖(heatmap)是以顏色的變化反映各種細(xì)菌在樣本中的豐度變化。我們利用熱圖對相對豐度較大的前100個細(xì)菌OTU在門和屬(genus)的水平進(jìn)行比較，結(jié)果表明，高脂飲食喂養(yǎng)的確顯著改變了部分OTU的相對豐度，而APS則部分逆轉(zhuǎn)了高脂飲食的影響(圖4C)。因此，APS喂養(yǎng)的確可以恢復(fù)高脂飲食所引起的腸道菌群改變。

圖3 APS改善高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素敏感性(n=8)

注：A:空腹血糖水平；B：空腹胰島素水平；C：HOMA-IR指數(shù)(空腹血糖(mmol·L-1)*空腹胰島素(mIU·L-1)/22.5);*P<0.05與正常對照組相比；#P<0.05與高脂飲食組相比；采用雙尾t檢驗。

3.5 APS喂養(yǎng)小鼠腸道菌移植明顯降低小鼠體重增長 為了確定APS的減肥作用與其對高脂喂養(yǎng)動物的腸道菌群調(diào)節(jié)的關(guān)系，我們利用腸道菌移植的方法，將經(jīng)過4周高脂飲食及APS喂養(yǎng)動物的腸道菌移植給另外2組小鼠，分別為HFD_R和APS_R，連續(xù)給予8周的正常飲食和4周的高脂飲食，具體方案見(圖5A)。我們首先發(fā)現(xiàn)，接受高脂飲食及APS喂養(yǎng)的腸道菌供體小鼠體重具有明顯的差異(圖5B)，與前述的實驗結(jié)果一致(圖5A)。腸道菌移植的受體小鼠在經(jīng)過8周的正常飲食喂養(yǎng)情況下，2組小鼠的體重未見明顯(圖5C)。之后，我們將腸道菌移植受體小鼠的飲食更換為高脂飲食，繼續(xù)喂養(yǎng)4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APS_R小鼠的體重增長速度明顯低于HFD_R組(圖5D)，說明APS喂養(yǎng)小鼠的腸道菌可以降低高脂喂養(yǎng)小鼠的體重增長速度，但不影響正常飲食喂養(yǎng)下的小鼠體重增長，APS改變的動物腸道菌是APS發(fā)揮減肥作用的重要原因。

圖4 APS明顯改變高脂喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)(n=5)

注：A:腸道菌群PCoA圖；B：腸道菌群相對豐度柱形圖；C：前100個OTU相對豐度的熱圖。

圖5 APS喂養(yǎng)小鼠腸道菌移植降低高脂喂養(yǎng)小鼠體重增長(n=5)

注：A:腸道菌移植實驗設(shè)計圖；B：供體小鼠實驗終點時的體重；C:腸道菌移植受體小鼠連續(xù)給予8周正常飲食后的體重；D:腸道菌移植受體小鼠繼續(xù)給予高脂飲食4周后的體重；*P<0.05，采用雙位t檢驗。

4 討論

APS作為黃芪中的主要活性成分之一，以往的研究表明其對于高脂飲食喂養(yǎng)動物及糖尿病模型動物的胰島素敏感性、葡萄糖代謝、血脂，及膽固醇均具有一定的調(diào)節(jié)作用[23-25，27-28]。但是，APS可能的減肥作用，以及減肥的機制并不清楚。我們本次研究表明，APS對于高脂飲食喂養(yǎng)小鼠肥胖的形成具有明確的抑制作用，并能顯著改善模型動物的肝臟脂肪變性及胰島素敏感性。我們還發(fā)現(xiàn)，APS不僅能明顯恢復(fù)高脂喂養(yǎng)小鼠紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)，而且，APS喂養(yǎng)小鼠的腸道菌移植能夠明顯降低小鼠接受高脂飲食喂養(yǎng)后的體重增長速度，說明APS的減肥作用是通過，或至少部分通過改變小鼠的腸道菌而實現(xiàn)的，而腸道菌的這種作用只有在高脂飲食條件下才能發(fā)揮，說明APS所改變的腸道菌降低了動物從高脂飲食中能量的攝取。

越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群在肥胖形成中扮演了極其重要的作用[34]，因而腸道菌群被認(rèn)為是潛在的藥物干預(yù)的重要靶標(biāo)[16]。利用益生菌、益生元、抗生素或中藥等手段，擾動宿主的腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到改善機體糖脂代謝、胰島素抵抗及降低體重的目的，被認(rèn)為是研發(fā)安全有效的肥胖及代謝性疾病防治藥物的重要途徑[35-38]。植物多糖是在多種天然產(chǎn)物中普遍存在的一大類活性成分，雖然其在哺乳動物胃腸道的吸收效率很低，但研究表明植物多糖大多具有廣泛的藥理效應(yīng)，尤其是對于機體免疫功能、糖脂及能量代謝的調(diào)節(jié)作用往往被認(rèn)為與腸道菌群的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[39-41]。研究表明，靈芝多糖通過改變高脂喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而明顯減輕高脂飲食喂養(yǎng)小鼠肥胖的形成[31，42]。麥冬多糖MDG-1對膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠腸道菌紊亂具有明顯的改善作用，表現(xiàn)為增加益生菌臺灣乳桿菌與鼠乳桿菌的數(shù)量[43]。此外，研究表明，麥冬多糖MDG-1改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗與降低糖尿病小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌與鏈球菌的豐度，促進(jìn)雙歧桿菌的增殖有關(guān)[44]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌變形菌門細(xì)菌豐度在高脂飲食小鼠中顯著升高，而擬桿菌與厚壁門菌的相對豐度明顯下降，APS則能夠有效恢復(fù)高脂飲食所導(dǎo)致的腸道菌總體結(jié)構(gòu)變化。我們認(rèn)為，不同組成的植物多糖盡管對于機體糖脂代謝可能具有相似的調(diào)節(jié)作用，但是，在對腸道菌群的影響上應(yīng)該存在異同性。本研究中發(fā)現(xiàn)的APS所改變的腸道菌，哪些種屬的細(xì)菌可能是其發(fā)揮減肥效應(yīng)的關(guān)鍵仍在進(jìn)一步的研究中。

不同來源的植物多糖在分子量大小及糖的組成上存在較大差異。馮怡等人在麥冬多糖中分離獲得的，具有明顯活性的MDG-1是分子量在5 000左右的2→1鏈接的呋喃型β-D-果聚糖[43]，而在靈芝多糖中，研究人員發(fā)現(xiàn)具有減肥效應(yīng)的主要為靈芝多糖中分子量>300 kDa的多糖組份，其組成主要由47.5%甘露糖(mannose)、26.3%葡萄糖(glucose)、16.9%半乳糖(galactose)，以及少量的半乳糖胺(galactosamine)、阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖胺(glucosamine)、海藻糖(fucose)等[31]。目前，黃芪粗多糖根據(jù)其提取方法不同，鑒定出的多糖主要包括水溶性與水不溶性的α葡聚糖、水溶性酸性雜多糖等類型[45]，不過，目前為止，APS的功效研究主要是以粗多糖為主，APS的不同組份與其功效之間的關(guān)系仍不清楚。本次研究所使用的APS也為黃芪中純度>90%的粗多糖成分，下一步我們將進(jìn)一步確認(rèn)具有減肥效應(yīng)的APS多糖化學(xué)組成，深入探討APS通過調(diào)節(jié)腸道菌群，調(diào)控宿主能量代謝通路，從而發(fā)揮減肥作用的分子機制。

[1]Matsuda M，Shimomura I.Roles of adiponectin and oxidative stress in obesity-associated metabolic and cardiovascular diseases[J].Rev Endocr Metab Disord，2014，15(1):1-10.

[2]Murphy K G.Editorial overview:Endocrine and metabolic diseases:Waistline weapons:new therapeutic avenues for the treatment of obesity and metabolic disease[J].Curr Opin Pharmacol，2015，25:iv-vi.

[3]Koot B G，De Groot E，Van Der Baan-Slootweg O H，et al.Nonalcoholic fatty liver disease and cardiovascular risk in children with obesity[J].Obesity(Silver Spring)，2015，23(6):1239-1243.

[4]Bhupathiraju S N，Hu F B.Epidemiology of Obesity and Diabetes and Their Cardiovascular Complications[J].Circ Res，2016，118(11):1723-1735.

[5]Shamseddeen H，Getty J Z，Hamdallah I N，et al.Epidemiology and economic impact of obesity and type 2 diabetes[J].Surg Clin North Am，2011，91(6):1163-1172，vii.

[6]Ziyyat A，Ramdani N，Bouanani Nel H，et al.Epidemiology of hypertension and its relationship with type 2 diabetes and obesity in eastern Morocco[J].Springerplus，2014，3:644.

[7]Hofbauer K G.Molecular pathways to obesity[J].Int J Obes Relat Metab Disord，2002，26(Suppl 2):S18-27.

[8]Mantzoros C S.The role of leptin in human obesity and disease:a review of current evidence[J].Ann Intern Med，1999，130(8):671-680.

[9]Backhed F，Ding H，Wang T，et al.The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101(44):15718-15723.

[10]Gerard P.Gut microbiota and obesity[J].Cell Mol Life Sci，2016，73(1):147-162.

[11]Greenhill C.Obesity:Gut microbiota，host genetics and diet interact to affect the risk of developing obesity and the metabolic syndrome[J].Nat Rev Endocrinol，2015，11(11):630.

[12]Miele L，Giorgio V，Alberelli M A，et al.Impact of Gut Microbiota on Obesity，Diabetes，and Cardiovascular Disease Risk[J].Curr Cardiol Rep，2015，17(12):120.

[13]Qian L L，Li H T，Zhang L，et al.Effect of the Gut Microbiota on Obesity and Its Underlying Mechanisms:an Update[J].Biomed Environ Sci，2015，28(11):839-847.

[14]Li H，Jia W.Cometabolism of microbes and host:implications for drug metabolism and drug-induced toxicity[J].Clin Pharmacol Ther，2013，94(5):574-581.

[15]O′hara A M，Shanahan F.The gut flora as a forgotten organ[J].Embo Reports，2006，7(7):688-693.

[16]Jia W，Li H，Zhao L，et al.Gut microbiota:a potential new territory for drug targeting[J].Nat Rev Drug Discov，2008，7(2):123-129.

[17]Bengmark S.Gut microbiota，immune development and function[J].Pharmacol Res，2013，69(1):87-113.

[18]Kamada N，Chen G Y，Inohara N，et al.Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota[J].Nat Immunol，2013，14(7):685-690.

[19]Ley R E，Backhed F，Turnbaugh P，et al.Obesity alters gut microbial ecology[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(31):11070-11075.

[20]Turnbaugh P J，Ley R E，Mahowald M A，et al.An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J].Nature，2006，444(7122):1027-1031.

[21]Holmes E，Kinross J，Gibson G R，et al.Therapeutic modulation of microbiota-host metabolic interactions[J].Sci Transl Med，2012，4(137):137rv6.

[22]Zhang J，Xie X，Li C，et al.Systematic review of the renal protective effect of Astragalus membranaceus(root)on diabetic nephropathy in animal models[J].J Ethnopharmacol，2009，126(2):189-196.

[23]王濤，魏學(xué)娟，翁孝剛，等.黃芪多糖對肥胖大鼠胰島素敏感性的影響[J].中國藥學(xué)雜志，2011，46(3):3.

[24]翁孝剛，梁輝，王濤，等.黃芪多糖對高脂喂養(yǎng)肥胖大鼠胰島素敏感性的影響[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，30(5):4.

[25]毛先晴，歐陽靜萍.黃芪多糖對飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟胰島素抵抗的預(yù)防作用[J].中國病理生理雜志，2007，23(11):4.

[26]童紅莉，田亞平，汪德清，等.黃芪多糖對高脂血癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)[J].中國臨床康復(fù)，2006，10(11):3.

[27]Cheng Y J，Tang K，Wu S H，et al.Astragalus Polysaccharides Lowers Plasma Cholesterol through Mechanisms Distinct from Statins[J].Plos One，2011，6(11)：11.

[28]Mao X Q，Yu F，Wang N，et al.Hypoglycemic effect of polysaccharide enriched extract of Astragalus membranaceus in diet induced insulin resistant C57BL/6J mice and its potential mechanism[J].Phytomedicine，2009，16(5):416-425.

[29]Zhang X，Zhao Y，Zhang M，et al.Structural changes of gut microbiota during berberine-mediated prevention of obesity and insulin resistance in high-fat diet-fed rats[J].PLoS One，2012，7(8):e42529.

[30]Cole J R，Wang Q，Cardenas E，et al.The Ribosomal Database Project:improved alignments and new tools for rRNA analysis[J].Nucleic Acids Res，2009，37(Database issue):D141-145.

[31]Chang C J，Lin C S，Lu C C，et al.Ganoderma lucidum reduces obesity in mice by modulating the composition of the gut microbiota[J].Nat Commun，2015，6:7489.

[32]任亞浩，李巖溪，趙越，等.白藜蘆醇對C57BL_6J小鼠脂代謝的影響[J].衛(wèi)生研究，2011，40(4):495-497.

[33]劉芳.不同品系小鼠肥胖模型比較、肥胖機制研究&LRTG減肥作用及作用機理探討[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

[34]Hersoug L G，Moller P，Loft S.Gut microbiota-derived lipopolysaccharide uptake and trafficking to adipose tissue:implications for inflammation and obesity[J].Obes Rev，2016，17(4):297-312.

[35]Velayudham A，Dolganiuc A，Ellis M，et al.VSL#3 probiotic treatment attenuates fibrosis without changes in steatohepatitis in a diet-induced nonalcoholic steatohepatitis model in mice[J].Hepatology，2009，49(3):989-97.

[36]Wang J，Tang H，Zhang C，et al.Modulation of gut microbiota during probiotic-mediated attenuation of metabolic syndrome in high fat diet-fed mice[J].ISME J，2015，9(1):1-15.

[37]Fan J G，Xu Z J，Wang G L.Effect of lactulose on establishment of a rat non-alcoholic steatohepatitis model[J].World J Gastroenterol，2005，11(32):5053-5056.

[38]Duseja A，Chawla Y K.Obesity and NAFLD:the role of bacteria and microbiota[J].Clin Liver Dis，2014，18(1):59-71.

[39]Yang J，Bindels L B，Segura Munoz R R，et al.Disparate Metabolic Responses in Mice Fed a High-Fat Diet Supplemented with Maize-Derived Non-Digestible Feruloylated Oligo-and Polysaccharides Are Linked to Changes in the Gut Microbiota[J].PLoS One，2016，11(1):e0146144.

[40]Conlon M A，Topping D L.Dietary polysaccharides and polyphenols can promote health by influencing gut microbiota populations[J].Food Funct，2016，7(4):1730.

[41]Zhou S S，Xu J，Zhu H，et al.Gut microbiota-involved mechanisms in enhancing systemic exposure of ginsenosides by coexisting polysaccharides in ginseng decoction[J].Sci Rep，2016，6:22474.

[42]王令儀，王碩，王源，等.麥冬多糖MDG-1對糖尿病小鼠糖耐量及腸道菌群的影響[J].世界華人消化雜志，2011，19(19):5.

[43]Xu J，Wang Y，Xu D S，et al.Hypoglycemic effects of MDG-1，a polysaccharide derived from Ophiopogon japonicas，in the ob/ob mouse model of type 2 diabetes mellitus[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，49(4):657-662.

[44]石林林，王源，馮怡.麥冬多糖MDG-1對膳食誘導(dǎo)肥胖模型小鼠腸道益生菌群多樣性影響的研究[J].中國中藥雜志，2015，40(4):6.

[45]單俊杰，王順春，劉滌，等.黃芪多糖的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2000，14(3):5.

(2016-10-27收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Study on Anti-Obesity Effect and Modulation of Gut Microbiota by Astragalus Polysaccharides in Mice

He Xuyun1, He Jiaojiao1, Zheng Ningning1, Wang Shunchun2, Li Houkai1

(1CenterforChineseMedicalTherapyandSystemBiology,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203,China; 2InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective:To explore relationships between the anti-obesity effect and modulation of gut microbioata by APS in high-fat diet (HFD)-fed mice.Methods:1. A total of 50 male C57bl/6J mice were randomly divided into five groups including control group (Con), HFD group, and three APS groups with low, middle and high dosages (2 %, 4 %, 8 % APS mixed in HFD). All animals were fed with corresponding diet for consecutive eight weeks during which their body weight was measured weekly. At the end of the experiment, fecal samples were collected for analysis of gut microbiota by 16S rDNA sequencing approach. 2. To investigate the contribution of gut microbiota to body weight reduction of APS, two groups of mice (n=5/each group) were transplanted with intestinal bacteria from mice that were fed with or without APS (2 % APS in HFD). The receiver mice were designated as HFD_R and APS_R, respectively. The receiver mice were fed with chow diet for consecutive eight weeks first, and then switched to HFD for another four weeks.Results:APS effectively suppressed the HFD-induced obesity formation, attenuated the hepatic steatosis, decreased hepatic TG level, improved insulin sensitivity, restored the balance of gut microbiota in HFD-fed mice by increasing the relative abundance of Bacteroidetes and Firmicutes, and reducing the abundance of Proteobacteria bacteria. Moreover, the anti-obesity effect of APS could be transferred to mice that were transplanted with intestinal bacteria from APS-fed mice in the context of HFD, but not chow diet.Conclusion:APS could inhibit the HFD-induced obesity formation, at least partially, by modulating gut microbiota.

Astragalus polysaccharides; Obesity; Gut microbiota; Insulin sensitivity; Hepatic steatosis; 16S rDNA

國家自然科學(xué)基金項目(編號:81673662),上海市科委“浦江人才”計劃(編號:14PJD031)，上海市教委一流學(xué)科創(chuàng)新項目(編號：ZYX-CXYJ-017)，上海市高校特聘教授(東方學(xué)者)人才計劃(2014)，上海市教委“曙光學(xué)者”人才計劃(2016)

何旭云，碩士研究生，Tel：(021)51322748，E-mail:hexuyun@qq.com

李后開，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥防治肥胖及脂肪肝的機理研究，Tel:(021)51322748，E-mail:houkai1976@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.046