黃志軍 梁 鵬 余 黎 李 霞 肖 飛 趙 剛

(1 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,武漢,430070; 2 健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司藥物研究院,武漢,430052; 3 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京,210023)

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小金膠囊藥材組分過敏性研究

黃志軍1,2梁 鵬1余 黎3李 霞2肖 飛2趙 剛2

(1 武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院,武漢,430070; 2 健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司藥物研究院,武漢,430052; 3 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京,210023)

目的:探討小金膠囊主要藥材組分的過敏性。方法:實驗分為12組,包括空白對照組、陽性對照組和10組不同藥材組,通過灌胃方式對大鼠給藥,隔天1次,15 d后取抗血清,對RBL-2H3細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),進(jìn)行抗原攻擊后,檢測培養(yǎng)液中組胺和β-氨基己糖苷酶的釋放量。結(jié)果:制木鱉子組的細(xì)胞組胺釋放量明顯高于空白對照組(P<0.05),人工麝香組、制木鱉子組和乳沒組的細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放量明顯高于空白對照組,但自制木鱉子組和制乳沒組的細(xì)胞組胺和β-氨基己糖苷酶釋放量與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:小金膠囊致敏藥材可能為人工麝香、木鱉子和乳沒,經(jīng)適當(dāng)方法炮制可降低其致敏性。

小金膠囊;藥材;過敏性;大鼠;RBL-2H3細(xì)胞

小金膠囊處方源于中醫(yī)經(jīng)典名方“小金丹”,主要由人工麝香、木鱉子(去殼去油)、制草烏、楓香脂、乳香(制)、沒藥(制)、當(dāng)歸(酒炒)、五靈脂(醋炒)、地龍、香墨等組成。方中制草烏溫經(jīng)散寒、通經(jīng)絡(luò)、化頑痰、消腫瘤,治惡瘡,木鱉子散結(jié)消腫,攻毒療瘡,治惡瘡,瘰疬,共為君藥。地龍活血化痰通經(jīng),當(dāng)歸、五靈脂、乳香、沒藥活血散瘀,消腫止痛,共為臣藥。楓香脂涼血解毒,活血止痛,香墨止血生肌,消癰腫,人工麝香辛香走竄,活血通經(jīng),消腫止痛,為佐藥。諸藥合用,共奏散結(jié)消腫,化瘀止痛之功。小金膠囊主要用于陰疽初起,皮色不變,腫硬作痛,多發(fā)性膿腫,癭瘤,瘰疬,乳巖,乳癖等癥[1]。臨床上可用于甲狀腺結(jié)節(jié)[2-4]、淋巴結(jié)核、子宮肌瘤、乳腺增生[1,5-6]、乳腺癌、前列腺增生[7]等多種疾病[8-12]的治療。

通過檢索關(guān)于小金系列產(chǎn)品(小金膠囊、小金丸等)的不良反應(yīng)報道文獻(xiàn),可以發(fā)現(xiàn)小金丸不良反應(yīng)居多,而小金膠囊明顯要少[13]。趙敏等[14]指出,小金膠囊相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生時間、累及器官和臨床表現(xiàn)均與小金丸相似,但發(fā)生率較小金丸明顯低。原因可能是小金丸崩解困難,藥品在胃中很難完全崩解,使得小金丸在胃中的毒性和引起不良反應(yīng)的機(jī)會增加。此外,藥品的服法不當(dāng)也是小金丸引起不良反應(yīng)的可能原因之一。而小金膠囊是對小金丸進(jìn)行了劑型改進(jìn),膠囊崩解迅速,藥物釋放速度快,使其在胃中的毒性和引起不良反應(yīng)的可能性大為減小。

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院張征[15]通過對其醫(yī)院應(yīng)用的小金丸和小金膠囊不良反應(yīng)進(jìn)行整理分析,同樣得出小金丸不良反應(yīng)發(fā)生率明顯高于小金膠囊(前者約為后者的4.6倍)。張征通過綜述,一方面肯定了小金產(chǎn)品的療效,另一方面指出其不良反應(yīng)在停藥后可減輕至消失,癥狀較嚴(yán)重的通過抗過敏治療預(yù)后良好。但為了探明其發(fā)生原因,本文將設(shè)計實驗對其主要藥材成分進(jìn)行過敏性研究,以探討產(chǎn)品的致敏物來源。

1 材料與方法

1.1 藥品 人工麝香、香墨、楓香脂、木鱉子、制木鱉子(去殼、去油)、乳香、沒藥、制乳香(醋炒)、制沒藥(醋炒)、制草烏、制地龍、制五靈脂(醋炒),健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供;卵白蛋白(南京都萊生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),批號:P0010)。

1.2 試劑 胎牛血清(Invitrogen公司提供,批號:871310);0.25% Trypsin-EDTA(Invitrogen公司提供,批號:1074908);DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen公司提供,批號:8112066);MTT(Biosharp公司提供,批號:BS030A);DMSO(成都市科隆化工試劑廠生產(chǎn),批號:20091001);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品,批號:20120330);其他試劑均為分析純。

1.3 動物及分組 SD大鼠,雄性,SPF級,250～300 g,南京中醫(yī)藥大學(xué)提供,動物合格證號:SYXK(蘇)2007-0030。所有動物隨機(jī)分成12組,根據(jù)給予受試物藥材灌胃情況分別為人工麝香組、香墨組、楓香脂組、制木鱉子組(去殼、壓榨法去油)、自制木鱉子組(去殼、石油醚索氏提取法脫脂)、乳沒組(乳香、沒藥等比混合給藥)、制乳沒組、制草烏組、制地龍組、制五靈脂組、空白對照組以及陽性對照組,每組6只動物。

1.4 藥品配制及動物給藥 取CMC-Na 5 g,加入超純水1 000 mL,加熱攪拌至全部溶解,放冷備用。小金膠囊各藥材均以CMC-Na溶液進(jìn)行混懸,配制灌胃液。根據(jù)小金膠囊臨床推薦用量換算大鼠給藥量,各受試組大鼠給藥量分別為:人工麝香組29.5 mg/kg,香墨組11.8 mg/kg,其余各組均為147.5 mg/kg;空白對照組大鼠給予同體積空白CMC-Na溶液;陽性對照組大鼠給予卵白蛋白多點皮下注射5 mg/只。所有動物隔天給藥1次,共3次,首次給藥后15 d,腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉,頸動脈采血,分離出抗血清,于-20 ℃冰箱保存。

1.5 細(xì)胞試驗 細(xì)胞培養(yǎng):RBL-2H3嗜堿性粒細(xì)胞,ATCC細(xì)胞株,購于上海研生實業(yè)有限公司。將RBL-2H3細(xì)胞以含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混懸,于37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長后,2～3 d換液1次,進(jìn)行傳代及凍存。過敏試驗:調(diào)整細(xì)胞濃度至1～1.5×106個/mL,細(xì)胞懸液0.5 mL/孔接種于48孔板中,生長過夜。取前述制備的各組抗血清,50 μL/孔加入細(xì)胞培養(yǎng)體系,于37 ℃,5% CO2條件下共培養(yǎng)3 h。將各組藥物粉末以過量方式加入DMSO超聲溶解30 min,之后取DMSO提取液加入細(xì)胞培養(yǎng)體系,DMSO濃度不超過0.5%。樣品加入后半小時內(nèi)迅速收集各組細(xì)胞液50 μL/孔,加入ELISA板中,按照試劑盒說明書進(jìn)行組胺含量檢測。剩余的細(xì)胞培養(yǎng)液24 h后分別取100 μL/孔,按照試劑盒說明書進(jìn)行β-氨基己糖苷酶含量檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,以P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RBL-2H3細(xì)胞組胺釋放結(jié)果 小金膠囊各藥材組分經(jīng)灌胃給藥后抗血清對RBL-2H3細(xì)胞的組胺釋放結(jié)果見圖1。由圖可見,RBL-2H3細(xì)胞組胺釋放量較空白對照組高的為制木鱉子組(P<0.05),說明制木鱉子具有一定的致敏性,但自制木鱉子組的細(xì)胞組胺釋放量則與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。小金膠囊成品采用的是經(jīng)過去殼去油炮制的自制木鱉子,相對于普通制木鱉子致敏性明顯降低。

2.2 RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放結(jié)果 小金膠囊各藥材組分經(jīng)灌胃給藥后抗血清對RBL-2H3細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放結(jié)果見圖2。由圖可見,RBL-2H3細(xì)胞β-氨基己糖苷酶釋放量較高的為人工麝香組(P<0.01)、制木鱉子組(P<0.05)和乳沒組(P<0.01)。與組胺釋放結(jié)果一致的是制木鱉子具有顯著致敏性,而自制木鱉子致敏性明顯降低,與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外,本部分實驗結(jié)果還顯示,人工麝香組和乳沒能明顯增加β-氨基己糖苷酶的釋放,而制乳沒組細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶釋放量與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小金膠囊各藥材組分抗血清對RBL-2H3細(xì)胞釋放組胺的影響

注：與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖2 小金膠囊各藥材組分抗血清對RBL-2H3細(xì)胞釋放β-氨基己糖苷酶的影響

注：與空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

本文所研究的不良反應(yīng)為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),致敏原通過刺激機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體,IgE與外周血中的嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)及組織中肥大細(xì)胞(MC)上的IgE受體結(jié)合,使機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機(jī)體,可與吸附在靶細(xì)胞表面的IgE結(jié)合,激發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列酶反應(yīng),使細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺、5-羥色胺等生物活性物質(zhì),引起系列過敏反應(yīng)。在過敏反應(yīng)中,MC和BAS釋放的主要活性物質(zhì)包括組胺和β-氨基己糖苷酶。組胺是過敏反應(yīng)癥狀產(chǎn)生的最主要的活性物質(zhì)之一,通過體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗,培養(yǎng)液中組胺含量的增高可以提示肥大細(xì)胞脫顆粒;β-氨基己糖苷酶是MC等釋放的顆粒溶酶體酶中的一種,是標(biāo)記MC脫顆粒的特異性蛋白,同樣可以反應(yīng)過敏發(fā)生程度[16-17]。

小金丸含有多種成分,地龍為動物源性藥物,制草烏、木鱉子有一定毒性,這些藥物含有蛋白、多肽等大分子物質(zhì),均可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,導(dǎo)致過敏反應(yīng)。制草烏的藥理、藥化以及炮制等理論已較為完善,生產(chǎn)中基本能做到安全用藥,且其中毒反應(yīng)多表現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此,草烏可能不會導(dǎo)致過敏性的發(fā)生。通過實驗結(jié)果可看出,制草烏對RBL-2H3細(xì)胞釋放組胺和β-氨基己糖苷酶均無影響,驗證了這一推測。

分析實驗結(jié)果,小金膠囊中人工麝香、木鱉子與乳沒均具有一定致敏性,但經(jīng)過炮制的乳沒致敏性明顯降低,經(jīng)常規(guī)方法炮制的木鱉子依然具有致敏性,而經(jīng)過自制的方法炮制的木鱉子致敏性降低。綜合實驗結(jié)果分析,小金膠囊致敏藥材可能為人工麝香、木鱉子和乳沒,炮制方法則對藥材的致敏性有很大影響,結(jié)果顯示,本實驗炮制方法可明顯降低藥材致敏性。當(dāng)然,還需通過拆方進(jìn)行更深入的探索以及進(jìn)一步的實驗驗證才可判斷確切的致敏源。

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(2016-09-22收稿 責(zé)任編輯：王明)

Hypersusceptibility Study of Chinese Materia Medica Xiaojin Capsule

Huang Zhijun1,2, Liang Peng1, Yu Li3, Li Xia2, Xiao Fei2, Zhao Gang2

(1SchoolofChemistry,ChemicalEngineeringandLifescience,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan430070,China; 2AcademyofPharmaceuticalResearch,JianminPharmaceuticalGroupCo.,LTD,Wuhan430052,China; 3SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective:To investigate the hypersusceptibility of Chinese Materia Medica Xiaojin Capsule.Methods:Blank control, positive control, and 10 groups of Chinese medicinal materials were set to fulfill the study. Drugs were orally administered every other day for 3 times. Serum was collected on 15 days after the first administration and used to bring up RBL-2H3 cells. Histamine and β-hexosaminidase were detected for hypersusceptibility evaluation.Results:Histamine release from RBL-2H3 cell of Cochinchina Momordica Seed group was obviously higher than that of blank group (P<0.05). β-hexosaminidase release by RBL-2H3 cell of artificial musk group, Cochinchina Momordica Seed group, frankincense and myrrh group was higher than that of blank. However, there was no statistical difference between blank and processed products of Cochinchina Momordica Seed, frankincense and myrrh.Conclusion:The sensitized Materia Medica in Xiaojin capsule may be artificial musk, cochinchina momordicae seed, frankincense and myrrh. The appropriate processing methods can be used to reduce the sensitization.

Xiaojin capsule; Chinese Materia Medica; Hypersusceptibility; Rat; RBL-2H3 cell

2016年國家中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)行動計劃:小金膠囊標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)

黃志軍(1972—),男,博士,教授級高工,研究方向：從事中藥藥理學(xué)研究,Tel:(027)84520229,E-mail:542354589@qq.com

趙剛(1983—),男,博士,高級工程師,研究方向：從事藥物新藥開發(fā)、藥理毒理研究,Tel:(027)84523889,E-mail:158200458@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.049