許海燕 鄭伶俐

(1 陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，咸陽，712046； 2 步長(zhǎng)集團(tuán)咸陽制藥廠，咸陽，7120003)

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Box-Behnken優(yōu)化咳露口服液提取工藝

許海燕1鄭伶俐2

(1 陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，咸陽，712046； 2 步長(zhǎng)集團(tuán)咸陽制藥廠，咸陽，7120003)

目的：利用響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化咳露口服液的提取工藝。方法：以處方中君藥黃芩的主要成分黃芩苷為優(yōu)化指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為自變量，以水為提取溶劑，黃芩苷含量為響應(yīng)值，應(yīng)用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究各自變量及其交互作用對(duì)黃芩苷含量的影響，建立二次多項(xiàng)回歸方程預(yù)測(cè)數(shù)學(xué)模型。結(jié)果：提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比3個(gè)因素對(duì)黃芩苷含量均有顯著影響。確定咳露口服液提取的最佳工藝參數(shù)提取時(shí)間70 min，提取次數(shù)2次，料液比1∶13，在此條件下，口服液中黃芩苷的含量為0.96 mg/mL。結(jié)論：響應(yīng)面法可用于咳露口服液提取工藝的優(yōu)化，該方法快速、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，對(duì)口服液提取工藝優(yōu)化有一定參考價(jià)值。

咳露口服液；響應(yīng)曲面法；提取工藝；黃芩苷

咳露口服液處方由川貝母、枇杷葉、紫菀、麻黃、黃芩、罌粟殼、甘草、薄荷腦等8味中藥組方而成[1]。具有清熱，宣肺，平喘，化痰止咳的功效，是治療痰熱咳嗽的常用中成藥之一，廣泛用于風(fēng)熱犯肺內(nèi)郁化火所致的咳嗽痰多或吐痰不爽，咽喉腫痛，胸滿氣短，感冒咳嗽及慢性支氣管炎等證[2]，臨床應(yīng)用廣泛。通過藥材性質(zhì)、生產(chǎn)工藝條件、節(jié)約能源及有效成分最大限度的提取等因素的綜合考慮，咳露口服液的提取選擇了水提工藝。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步優(yōu)化該口服液的提取工藝，通過響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以該口服液中君藥黃芩中的主要成分黃芩苷含量為指標(biāo)，對(duì)該口服液的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters2195，美國(guó))；電子天平E-10d(賽多利斯科學(xué)儀器，北京有限公司)；ΜPT-1-10高純水機(jī)(北京子涵公司)；超聲波清洗器Q2200DB(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ш(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：140715 201416鑒別或含量測(cè)定用，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所)；川貝母、枇杷葉、紫菀、麻黃、黃芩、罌粟殼、甘草、薄荷腦8味藥材均為飲片，購(gòu)自陜西省西安市萬壽路藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院生藥教研室雷國(guó)蓮教授鑒定均為正品。所用試劑乙腈為色譜純，其余均為分析純。

1.3 黃芩苷的含量測(cè)定

1.3.1 口服液制備方法[3]按處方量取上述八味藥材，除去薄荷腦外，取麻黃，用水蒸氣蒸餾，其藥液及蒸餾液收集備用；藥渣混合其余幾味藥材，加水煎煮，煎煮液合并，過濾，濾液與麻黃蒸餾液及藥液合并，濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15(50 ℃)，加入薄荷腦，定容至1 000 mL，即得。

1.3.2 色譜條件[4-7]Waters2195型高效液相色譜儀；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相:乙腈-0.6%磷酸水溶液(45∶60)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量15 μL；理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

1.3.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品2.5 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，靜置，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 供試品溶液的制備 精密吸取上述制備好的口服液10 mL置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.5 陰性對(duì)照品制備 按照咳露口服液制備工藝制得不含黃芩苷的陰性樣品制劑，再取陰性樣品制劑10 mL置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置，過濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.6 干擾試驗(yàn)考察 精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各15 μL，按照1.3.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，繪制色譜圖，如圖1。供試品溶液和對(duì)照品溶液都在相同時(shí)間出現(xiàn)黃芩苷的色譜峰，而陰性對(duì)照品溶液則在此時(shí)間下無峰。這種情況則表明樣品中其他成分對(duì)黃芩苷含量測(cè)定無影響。

圖1 咳露口服液HPLC圖

注：A.對(duì)照品溶液，B.供試品溶液，C.陰性對(duì)照品溶液請(qǐng)?jiān)谙鄳?yīng)圖譜下標(biāo)注，1.黃芩苷。

1.3.7 線性回歸方程[8]精密量取黃芩苷對(duì)照品溶液適量，加水稀釋成系列溶液，按1.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，把進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明黃芩苷進(jìn)樣量在0.160 5～1.259 8 μL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2232350.6X+282972.9,r=0.999 6(n=5)。

1.3.8 樣品含量測(cè)定 取樣品溶液，按照1.3.4項(xiàng)下制成供試品溶液，依1.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。精密吸取15 μL樣品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，依據(jù)線性回歸方程計(jì)算黃芩苷的含量。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)考查 咳露口服液，是以水為提取溶劑，采用水提醇沉法制備而成。本研究以黃芩苷含量為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇對(duì)口服液提取工藝影響最顯著的3個(gè)主要因素：提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比進(jìn)行優(yōu)化組合，試驗(yàn)水平表如下。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)黃芩苷含量的影響 在固定提取次數(shù)為1次，料液比為1∶10的情況下，考察提取時(shí)間對(duì)咳露口服液提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黃芩苷含量的影響

由上圖可知，提取時(shí)間對(duì)咳露口服液中黃芩苷含量有較明顯影響，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，其含量也隨之上升而后減少，當(dāng)提取時(shí)間超過60 min時(shí)，黃芩苷含量逐漸平緩趨于下降，可能隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，藥材中的雜質(zhì)也被相應(yīng)的提出。因此選擇提取時(shí)間為60 min作為咳露口服液的最適提取時(shí)間。

2.1.2 提取次數(shù)對(duì)黃芩苷含量的影響 在提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶10的情況下，考察不同提取次數(shù)對(duì)咳露口服液提取結(jié)果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，提取次數(shù)為1次時(shí)，黃芩苷含量較低，隨著提取次數(shù)的增加，含量也有所上升，但當(dāng)提取次數(shù)超過2次后，含量增長(zhǎng)緩慢，幾乎持平，從節(jié)約能源及時(shí)間綜合考慮，選取提取次數(shù)為2次作為咳露口服液的最適提取次數(shù)。

圖3 提取次數(shù)對(duì)黃芩苷含量的影響

2.1.3 料液比對(duì)黃芩苷含量的影響 固定提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為2次的情況下，考察不同料液比對(duì)咳露口服液工藝的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖4 料液比對(duì)黃芩苷含量的影響

由圖5可知，料液比對(duì)黃芩苷提取率也有很大影響，當(dāng)提取溶劑量從5倍增加到15倍時(shí)，提取效果明顯提高，這是因?yàn)殡S著溶劑的使用量越大，黃芩苷在溶劑中的溶解度就越大。液料比繼續(xù)增加時(shí)，由于黃芩苷的含量趨于平緩，此時(shí)提取率的增長(zhǎng)較為緩慢。綜合實(shí)際及節(jié)約成本考慮，選取液料比1∶10最佳。

2.2 響應(yīng)面分析 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以黃芩苷含量為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，三因素三水平共15組，其中5組實(shí)驗(yàn)為中心點(diǎn)試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

回歸模型方程的建立及方差分析：依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面法對(duì)咳露口服液中黃芩苷含量的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果設(shè)計(jì)15組試驗(yàn)。應(yīng)用Design-Expert.8.05b軟件分析數(shù)據(jù)，得到了多元二次回歸模型方程：R1=0.68733+0.014894A+0.33121B+0.12404C-6.66667×10-5AB-1.73333×10-4AC-3.85000×10-3BC-9.13426×10-5A2-0.061458B2-4.09833×10-3C2。方程式中R1為黃芩苷含量，A為提取時(shí)間，B為提取次數(shù)，C為料液比。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 回歸方程方差分析表

依據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)曲面圖及等高線圖，確定提取時(shí)間、提取次數(shù)和液料比3個(gè)因素對(duì)咳露口服液中黃芩苷提取效果的影響，響應(yīng)曲面圖和等高線圖如下。

圖5 提取時(shí)間和提取次數(shù)的響應(yīng)曲圖與等高線圖

圖6 提取時(shí)間和料液比的響應(yīng)曲面圖與等高線圖

圖7 提取次數(shù)和料液比的響應(yīng)曲面圖與等高線圖

由上圖可以看出3個(gè)因素的最佳參數(shù)及其之間的交互作用。從圖7可以看出料液比、提取時(shí)間的交互作用比較明顯，曲面較陡峭，說明提取時(shí)間和料液比對(duì)黃芩苷含量的影響較大。圖6和圖8的曲面較為平緩，說明提取時(shí)間與提取次數(shù)及提取次數(shù)與料液比之間的交互作用不太明顯。從圖6可以看出，提取時(shí)間的曲面較提取次數(shù)的曲面陡峭，說明提取時(shí)間對(duì)黃芩苷含量的影響較提取次數(shù)明顯。當(dāng)提取時(shí)間的范圍為60～70 min，料液比的范圍為11～13 g/mL，黃芩苷含量最高，此后，隨著提取時(shí)間及提取次數(shù)的增加，黃芩苷含量明顯降低。選定提取次數(shù)時(shí)，從圖8可以看出，黃芩苷含量隨著提取次數(shù)的增加呈先增大后平穩(wěn)的趨勢(shì)，故提取次數(shù)的最佳水平范圍為2～2.5次。可以看出，該模型可以很好的反映響應(yīng)值和各因素之間的關(guān)系，所以可以用此模型來優(yōu)選咳露口服液的提取工藝。通過對(duì)二次回歸模型的數(shù)學(xué)方程分析計(jì)算，得出咳露口服液最佳提取工藝：提取時(shí)間為68.52 min、提取次數(shù)為2.28次、料液比為12.58 g/mL，在此條件下黃芩苷含量的預(yù)測(cè)值為0.98 mg/mL。為了實(shí)際的操作便利，將最佳工藝參數(shù)確定為提取時(shí)間為70 min，提取次數(shù)為2次，料液比為13 g/mL，平行測(cè)定3次，黃芩苷含量為0.96 mg/mL，與模型預(yù)測(cè)值相差了僅0.02 mg/mL，模擬良好。

3 討論

提取工藝的優(yōu)化傳統(tǒng)上有正交實(shí)驗(yàn)和均勻試驗(yàn)等較為常用，傳統(tǒng)優(yōu)化方法雖然試驗(yàn)次數(shù)少，但精密性差[11]，不能完全作為大生產(chǎn)的參考。響應(yīng)曲面法是集統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、數(shù)學(xué)為一體，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建模型、檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?yōu)化最佳組合條件等對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化[12]，反應(yīng)了響應(yīng)值與各因素之間的影響關(guān)系，這種方法不僅實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，試驗(yàn)時(shí)間也很短，對(duì)各因素進(jìn)行了全面的優(yōu)化研究[13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)咳露口服液的提取工藝進(jìn)行考察，采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面法來優(yōu)化，最終表明在提取過程中的提取時(shí)間、次數(shù)、料液比都會(huì)對(duì)咳露口服液的提取工藝有所影響?？嚷犊诜旱膬?yōu)化是以黃芩苷為衡量指標(biāo)，優(yōu)化后的提取工藝是提取時(shí)間為70 min，提取次數(shù)為2次，料液比是1∶13，口服液中黃芩苷的含量為0.96 mg/mL，為咳露口服液的提取工藝選取了更優(yōu)的參數(shù)，提高了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為中藥口服液大工藝生產(chǎn)提供了一個(gè)良好的參照。

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(2016-03-03收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Optimization of Extraction Process of Kelu Oral Liquid by Box-Behnken

Xu Haiyan1,Zheng Lingli2

(1Medicalcollege，ShaanxiInstituteofInternationalTrade，Xianyang712046,China； 2XiAnBuChangMedicineCO.LTD.，Xianyang712000,China)

Objective:Response surface methodology(RSM)was used to optimize the extraction process of Kelu oral liquid.Methods:Among the prescription，Scutellaria Baicalensis was the principal drug，and the main component，baicalin，was the index of quality control.Based on the single factor analysis，the extraction time，extraction frequency and solid-to-liquid ratio were independent variables，and the amount of baicalinwasresponse value.The research center combined the design of the experiment，studied each independent variable and its interaction effect on the amount ofbaicalin and builded Second-degree polynomials equation mathematical model of prediction.Results:The extraction time，extraction frequency and solid-to-liquid ratio had all significant effects on the amount of baicalin.The optimal technology parameters extraction time of Kelu oral liquid was 70 min，the extraction times was 2 times，and solid-liquid ratio was 1∶13.Under such conditions，the amount of baicalinwas 0.96 mg/mL.Conclusion:Box-Behnken could be used for extraction optimization of extraction process for Kelu oral liquid，and the optimized technology was quick，simple and stable，besides，it had reference value for optimization of extraction of oral liquid.

Kelu Oral liquid； Response surface methodology； Extraction process； Baicalin

陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(編號(hào)：SMXY201301)——咳露口服液絮凝—高速離心技術(shù)的研究

許海燕(1977.03—)，女，碩士研究生，講師，研究方向：主要從事中藥的制劑分析及化學(xué)成分研究，E-mail:xpzwd@126.com

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.059