邱美玉，劉軍，申貴男，崔玉東，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌通過ROS/Akt通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

邱美玉，劉軍，申貴男，崔玉東，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

為研究修飾后的萘醌類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制。采用MTT、流式和Western blot方法觀察2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。結(jié)果表明：2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌可通過促進(jìn)早期ROS水平升高，抑制Akt的磷酸化水平，并選擇性地激活p38，ERK信號(hào)通路，從而抑制肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

萘醌類衍生物；HepG2；增殖抑制；活性氧

原發(fā)性肝癌是全球最常見的癌癥，有較高的死亡率[1-3]。過去20年間，肝癌患者的相對(duì)生存率僅由3%增長(zhǎng)到4%～7%[4]，主要原因歸結(jié)于肝癌的高復(fù)發(fā)性和沒有有效的藥物治療，研究和應(yīng)用有效的新藥仍是未來長(zhǎng)期的持續(xù)性工作[5]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中曾記載紫草具有清熱涼血、活血和解毒去疹的功效，用于血熱毒盛、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等病害[6]。紫草萘醌類化合物是中草藥紫草中的活性成分，因此，人們對(duì)萘醌類化合物抗腫瘤作用產(chǎn)生極大的興趣，合成了大量萘醌衍生物，探討他們的抗腫瘤活性、作用機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系，研究其抗氧化功能[7]，并通過實(shí)驗(yàn)證明開發(fā)紫草萘醌類化合物作為抗腫瘤藥物也具有重要的意義[8]。紫草萘醌類化合物的5，8位羥基被認(rèn)為是產(chǎn)生細(xì)胞毒性的關(guān)鍵基團(tuán)，分析萘醌的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以看出，萘醌類化合物的活性主要來自于萘環(huán)部分羰基的親電作用，但是由于α環(huán)的羥基和β環(huán)的羰基發(fā)生互變導(dǎo)致醌環(huán)親電性的降低，使萘醌的抗癌活性大大降低。研究發(fā)現(xiàn)，α環(huán)的甲基化可以增加羰基的親電性能，同時(shí)避免α環(huán)的羥基和β環(huán)的羰基互變，從而提升萘醌的抗癌活性。β環(huán)的羰基是萘醌類衍生物的特有活性基團(tuán)，故此部分保持不變。利用親核試劑對(duì)α，β-不飽和羰基進(jìn)行攻擊，通過邁克爾加成反應(yīng)添加硫醇或氨基化合物給萘環(huán)的提供電子，并且通過2位的加成反應(yīng)，將原來結(jié)構(gòu)中的1-羥基-4-甲基戊-3-烯基改變?yōu)樾羴嗧炕蛐涟坊梢跃_的比較不同的親核基團(tuán)對(duì)萘醌類化合物生物活性的影響。該實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)比了兩種結(jié)構(gòu)相似的萘醌類衍生物的活性，并且對(duì)生物活性較強(qiáng)的2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌抑制HepG2細(xì)胞增殖的分子機(jī)理進(jìn)行闡述，旨在揭示不同親核基團(tuán)對(duì)萘醌類衍生物構(gòu)效關(guān)系的影響并且明確其發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2肝癌細(xì)胞系購(gòu)自江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.2 試劑及儀器

DMEM/高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自索萊寶公司，抗p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38、p53、Bcl-2、Bad、Cleavaged caspase3、αtubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自碧云天公司，噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Amresco公司，NC膜購(gòu)自PALL公司，ECL購(gòu)自Thermo公司，培養(yǎng)皿購(gòu)自NEST公司。蛋白免疫印跡系統(tǒng)（Amersham Bioscience，美國(guó)）；多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACS Calibur）。

1.3 化合物合成

1.3.1 5，8-二羥基-1，4-萘醌的合成

將無水三氯化鋁（1.06 mol）與氯化鈉（0.484 mol）的混合物加熱至150～155℃攪拌熔融。慢慢加入1，4-二甲氧基苯（0.12 mol）與馬來酸酐（0.24 mol）的混合物。加畢，迅速升溫至170℃，保溫5～10 min后逐漸冷卻至室溫，反應(yīng)物逐漸凝固。加入1 400 mL水使其溶解，再加入100 mL濃鹽酸，攪拌過夜，過濾后棄去廢液，得濾渣，干燥后，用石油醚重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物5，8-二羥基-1，4-萘醌。

1.3.2 5，8-二甲氧基-1，4-萘醌的合成

用25 mL鄰二氯苯溶解萘茜（0.01 mol）、無水碳酸鈉（0.05 mol）、對(duì)甲苯磺酸甲酯（0.04 mol），加熱回流2 h，冷卻后過濾，回收濾液，加入大量石油醚，析出橙棕色固體，過濾，回收固體，真空干燥，再利用石油醚重結(jié)晶，得到5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

1.3.3 2 -辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌的合成

將5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（1.38 mmol）溶于30 mL甲醇，加正辛硫醇（1.65 mmol），室溫?cái)嚢? h，加入濃硫酸（0.23 mmol）、重鉻酸鈉（0.76 mmol），繼續(xù)攪拌5 min，移至分液漏斗，加入30 mL飽和鹽水，60 mL氯仿萃取兩次，用無水硫酸鈉脫水，濃縮干燥后，柱層析提純得2-辛巰基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

將上一步合成得到的2-辛巰基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（0.2 mmol）溶于25 mL二氯甲烷。加入間氯過氧苯甲酸（0.22 mmol），0℃反應(yīng)2 h，加入少量碳酸氫鈉水溶液停止反應(yīng)，移至分液漏斗，加入50 mL飽和鹽水，用20 mL二氯甲烷提取兩次，無水硫酸鈉脫水，濃縮干燥后，柱層析提純得目標(biāo)產(chǎn)物2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

將5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（1.38 mmol）溶于30 mL甲醇、加正辛胺（2.07 mmol），室溫?cái)嚢? h，反應(yīng)混合物加入飽和鹽水，二氯甲烷提取兩次，濃縮干燥經(jīng)柱層析提純，得目標(biāo)產(chǎn)物2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

1.4 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基（DMEM；Invitrogen），含有10%滅活的新生胎牛血清（FBS；Hyclone，Logan，UT，USA）和1%的抗生素（青霉素/鏈霉素）并置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以200 mm-2接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度兩種化合物，處理24 h。每孔加入20 μL的MTT （5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液后每孔加入100 μL DMSO溶液，吹打混勻，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡及ROS水平檢測(cè)

ROS的分析，用ROS的指示劑（1 mM，CM2-DCFDA）與處理過的HepG2細(xì)胞在 37℃孵育10 min后，用PBS洗3次，再用500 μL的PBS重懸，利用流式細(xì)胞儀分析10 000個(gè)細(xì)胞內(nèi)所帶的ROS指示劑的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞凋亡檢測(cè)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

將處理后的細(xì)胞回收，加入蛋白質(zhì)裂解液裂解，充分混勻，在12 000 r·min-1，4℃條件下離心20 min，提取細(xì)胞總蛋白并定量，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠上進(jìn)行凝膠電泳，分離20 μg總蛋白，電印跡轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（nitrocellulose membranes Millipore，USA），再用5%Skim milk封閉1 h，TBST（含15 mmol·L-1NaCl、0.2%Tween-20和10 mmol·L-1Tris-Hcl）洗滌5次，每次5 min，隨后用一抗在室溫下孵育1 h。再用TBST洗滌5次，每次5 min，與HRP標(biāo)記的鼠或兔二抗（1:5 000）孵育2 h，洗膜5次，進(jìn)行ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光顯影及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1萘醌類衍生物的鑒定

以上分析數(shù)據(jù)顯示，獲得的2種化合物均屬于萘醌類衍生物，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量符合預(yù)先的合成設(shè)計(jì)，保證了化合物的準(zhǔn)確性?；衔锝Y(jié)構(gòu)與名稱如圖1所示。

圖1 兩種萘醌類衍生物的結(jié)構(gòu)與名稱Fig.1 The structures and names of two kinds of naphthoquinone derivatives

2.2 2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌和2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率比較

為了檢測(cè)不同親和基團(tuán)的DMNQ衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制效果，以1、3、5、10、20、40、60、80、100 μmol·L-1濃度的2種萘醌類化合物處理HepG2細(xì)胞24 h，通過MTT assay方法對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用進(jìn)行檢測(cè)（圖2）。結(jié)果顯示，2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌在3 μmol·L-1濃度下即可表現(xiàn)出抑制HepG2細(xì)胞增殖的效果，并且抑制作用呈濃度依賴性，而2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌在1～100 μmol·L-1的濃度下均未顯示出對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果證明，添加不同親和基團(tuán)（辛亞砜與辛胺基）的萘醌類衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用有明顯差異，辛亞砜的加入可保持較好的抑制HepG2細(xì)胞增殖的生物活性，而辛胺基的加入大幅降低了萘醌類衍生物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性。

2.3 2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS和發(fā)生凋亡

2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，為了更加明確這一現(xiàn)象發(fā)生的分子機(jī)理，我們通過10 μmol·L-12-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌處理0、3、6、12 h，檢測(cè)細(xì)胞凋亡和ROS水平。結(jié)果顯示，2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌在10 μmol·L-1濃度下處理3 h時(shí)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高（圖3B），分別處理3 h，6 h，12 h，細(xì)胞均會(huì)發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象并且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性（圖3A）。

圖2 兩種萘醌類衍生物對(duì)HepG2增殖抑制作用的影響Fig.2 Effect of two kinds of naphthoquinone derivatives on HepG2 cell viability

圖3 2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌抑制HepG2細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)ROS水平升高Fig.3 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-dimethoxy-1，4-naphthoquinone induce apoptosis and elevate intracellular ROS level of HepG2 cell

2.4 2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡，MAPKs，Akt信號(hào)通路的影響

MAPKs家族，是將細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的重要傳遞者。該家族通過影響哺乳動(dòng)物內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)（如增殖、分化、轉(zhuǎn)化以及凋亡等）[9]。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因改變及其凋亡信號(hào)傳導(dǎo)路徑的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)MAPKs途徑在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮了極為重要的作用[10]；PI3K/Akt信號(hào)通路在外界刺激引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，Akt處于許多線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的交匯點(diǎn)，可以通過磷酸化或與細(xì)胞死亡因子相互作用直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[11]。因此，為了檢測(cè)2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制，對(duì)Akt及MAPKs信號(hào)通路進(jìn)行了檢測(cè)。在10 μmol·L-12-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌處理0 h、3 h、6 h、12 h后，檢測(cè)HepG2細(xì)胞的凋亡信號(hào)關(guān)鍵蛋白，MAPKs信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白以及Akt的活化程度（圖4）。結(jié)果顯示，凋亡相關(guān)蛋白Cleavaged caspase3隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，抗凋亡蛋白Bcl-2減少，促凋亡蛋白Bad增加，抑癌基因P53表達(dá)量升高（圖4A）。MAPKs家族成員p38，ERK的磷酸化水平都隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，JNK的磷酸化水平無明顯變化（圖4B）。與細(xì)胞生存密切相關(guān)的Akt的磷酸化水平隨藥物處理時(shí)間的增加而明顯降低（圖4C）。結(jié)果顯示，2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌可以激活MAPKs信號(hào)通路，降低Akt的磷酸化水平。

3 討論

肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，預(yù)后差。盡管肝癌的手術(shù)治療與局部治療近年來取得了一定的進(jìn)步，但大多數(shù)肝癌患者在確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，藥物治療對(duì)于肝癌仍然不可或缺[5]。目前，大多數(shù)藥物的療效都難盡人意，因此新藥開發(fā)是突破肝癌治療瓶頸的重要策略。癌癥的開始和發(fā)展過程中都伴隨著凋亡減少和增殖能力的增加，因此，誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡是治療癌癥的重要策略之一。紫草萘醌類化合物具有抗腫瘤活性，對(duì)紫草萘醌類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及構(gòu)效關(guān)系分析是新藥開發(fā)的重要內(nèi)容。紫草萘醌類化合物的5，8位羥基被認(rèn)為是產(chǎn)生細(xì)胞毒性的關(guān)鍵基團(tuán)，將萘醌的5，8位經(jīng)過甲基化由紫草素的羥基改為甲氧基，可降低其細(xì)胞毒性，且通過2位的加成反應(yīng)，將原來結(jié)構(gòu)中的1-羥基-4-甲基戊-3-烯基替換為辛亞砜或辛胺基可以比較不同的親和基團(tuán)對(duì)萘醌類化合物生物活性的影響。

圖4 2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌對(duì)HepG2細(xì)胞p53、MAPKs和細(xì)胞周期蛋白的影響Fig.4 Effect of 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-dimethoxy-1，4-naphthoquinone on apopotosis associated proteins，MAPKs signaling pathways and Akt signaling pathway

細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展和抗腫瘤藥物治療中都扮演著重要角色[12]。有文獻(xiàn)指出，紫草素能夠通過ROS/Akt和PIPI/NF-KappaB信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。結(jié)果表明，辛亞砜基團(tuán)的添加保留了萘醌類化合物的活性，而辛胺基的添加使其喪失誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白，例如Bad，Bak，Bad，Bcl-Xs，Bid，Bik，Bim和 Bcl-2，BclxL，Bcl-W，Bfl-1和Mcl-1等抗凋亡蛋白[13-15]?；罨腜I3K產(chǎn)生3，4，5-三磷酸鹽磷脂酰肌醇，它能夠招募PDK和Akt絲氨酸，蘇氨酸激酶到細(xì)胞膜上，導(dǎo)致Akt的磷酸化，Akt的磷酸化是和細(xì)胞生存緊密相關(guān)的；Bad是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，Akt可以使Bad的136位絲氨酸發(fā)生磷酸化，從而使Bad與Bcl-2/Bcl-X復(fù)合體分離，失去促凋亡功能；p53為抑癌基因，它通過引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡來維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，在防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。正常情況下，細(xì)胞中p53表達(dá)較少，當(dāng)DNA損傷時(shí)會(huì)引起p53蛋白表達(dá)量和活性的提高。有研究證明p53是通過激活它的下游途徑調(diào)控凋亡的[16]，大量的Bcl-2蛋白和線粒體腺苷酸蛋白在依賴p53的細(xì)胞凋亡中受影響[17]。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在人體中廣泛存在，各種神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子、炎癥因子、促分裂素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等細(xì)胞外刺激信號(hào)均可以通過MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡以及炎癥的生理病理過程[12]。有研究表明，萘醌類化合物可以通過MAPKs家族成員的激活介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

結(jié)果表明，與2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌相比，2-辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌具有更好的活性，它通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，激活p38，ERK，抑制Akt的磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，與2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌相比，辛亞砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌可以有效地抑制HepG2增殖，這種抑制作用是通過ROS/Akt和MAPKs信號(hào)通路來完成的。研究結(jié)果為紫草萘醌類衍生物的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-Dimethoxy-1，4-Naphthoquinone Induce HepG2 Apoptosis through ROS/Akt and MAPKs Pathway

Qiu Meiyu，Liu Jun，Shen Guinan，Cui Yudong，Han Yinghao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To investigate the effects of modified naphthoquinone derivatives on apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its underlying mechanism.The effect of 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-Dimethoxy-1，4-Naphthoquinone on the growth of human hepatocellular carcinoma cells was observed by MTT，flow and Western blot method.The results showed that 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-Dimethoxy-1，4-Naphthoquinone could elevate ROS level，inhibit phosphorylation of Akt，selectively activate p38 and ERK signaling pathway，thus inhibite proliferation and induce apoptosis of HepG2 cell.

naphthoquinone derivatives；HepG2；proliferation inhibition；ROS

R285

A

1002-2090（2016）05-0081-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.016

2016-03-18

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)?？蒲袉?dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（XYB2012-12）。

邱美玉（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級(jí)碩士研究生。

崔玉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：cuiyudong@yahoo.com；韓英浩，男，副教授，E-mail:yinghaohan@byau.edu.cn。