王歡歡，陳美玲，樓立峰，張 雷，張成先，陳賢惠，章學東*

(1. 杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310024； 2. 浙江光大種禽業(yè)有限公司，海寧 310016)

雞GNAS基因啟動子突變及其與膚色性狀的相關性

王歡歡1，陳美玲1，樓立峰1，張 雷1，張成先2，陳賢惠2，章學東1*

(1. 杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310024； 2. 浙江光大種禽業(yè)有限公司，海寧 310016)

為研究雞GNAS基因突變情況及其對烏骨雞膚色的影響，本試驗選擇東鄉(xiāng)綠殼蛋雞樣本，采用PCR-RFLP和DNA測序方法，篩查膚色相關的GNAS突變位點；采用熒光定量PCR方法，檢測EDN3、MC1R、GNAS、ADCY3基因的表達量；本試驗還對3個雞種進行了突變檢測。結果顯示，在家雞20號染色體的11 167 660堿基位置存在T/C突變，該T2270C突變點是GNAS基因啟動子的關鍵位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)DraI酶切電泳后，CC純合基因型出現(xiàn)一條342 bp的條帶；TC雜合基因型出現(xiàn)171和342 bp兩條帶；TT隱性純合基因型出現(xiàn)一條171 bp的條帶。3種基因型的膚色L值差異極顯著(P<0.01)，CC基因型的L值最小，表現(xiàn)為膚色最深；TT基因型的L值最大，表現(xiàn)為膚色淺白。EDN3基因的表達量以CC基因型最高，TT基因型最低，3種基因型間差異極顯著(P<0.01)。MC1R、GNAS和ADCY3基因的表達量以CC基因型最高，但基因型間的表達差異均不顯著(P>0.05)；GNAS與上游MC1R基因的表達量無顯著相關性，而與下游ADCY3基因的表達量極顯著相關(P<0.01)。江山烏骨雞、伊莎蛋雞、東鄉(xiāng)×伊莎測交組合雞的突變分型結果符合理論值(P>0.05)。本研究表明，雞GNAS基因啟動子T2270C突變與膚色性狀強相關，突變檢測可輔助用于烏骨雞的膚色分型育種。

雞；GNAS基因；突變；膚色

鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α亞基(Guanine nucleotide-binding protein Gs subunit alpha，GNAS)是位于細胞膜內(nèi)側的一類信號傳導蛋白，參與細胞的多種生命活動[1]。在黑色素代謝通路中，GNAS與具有跨膜結構的黑素皮質素受體(MC1R)偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶(ADCY)，催化ATP生成第二信使cAMP，進而影響胞內(nèi)黑色素的合成[2]。據(jù)家雞全基因組測序數(shù)據(jù)，雞GNAS基因位于20號染色體，全長為48 456 bp，含有10個外顯子。研究表明，烏骨雞真皮、內(nèi)臟等部位的黑色素沉積現(xiàn)象，又稱纖維化黑色變(Fibromelanosis，F(xiàn)m)，是由20號染色體上的Fm區(qū)域所決定的，烏骨雞在該區(qū)域存在著兩段拷貝數(shù)重復區(qū)(CNVs)，其中一段CNVs包含有與黑色素沉積密切相關的EDN3基因[3-4]，而GNAS等數(shù)個基因則處在兩段CNVs的中間序列。同時，醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，人的GNAS基因突變導致黑色素瘤(Melanoma)、纖維骨性病變(Fibro-osseous)、纖維性發(fā)育不良(Fibrous dysplasia)等疾病的發(fā)生[5-7]。以上結果均提示，GNAS可能與黑色素性狀有關。

國內(nèi)多數(shù)烏骨雞種的群體內(nèi)膚色往往深淺不一，例如東鄉(xiāng)綠殼蛋雞的冠、喙、皮、肉、骨、脛、趾多呈烏黑色，但還有一定比例的白膚個體[8]。這種情況表明雞種內(nèi)存在烏膚主效基因的純合與雜合，會對后續(xù)的育種應用造成影響。本研究目的在于篩選雞的GNAS基因突變，探究GNAS突變是否與雞的烏膚性狀相關，以期為尋找有效的分子標記輔助育種方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 突變檢測樣本

試驗選用浙江光大種禽業(yè)有限公司保存的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞150只、江山烏骨雞60只、伊莎蛋雞B系60只，以及東鄉(xiāng)綠殼蛋雞的測交后代67只。由專人飼養(yǎng)管理，按程序免疫。采集所有供試個體的翅靜脈血液，加入70%乙醇中，酚/氯仿法抽提基因組DNA，于-20℃保存。

1.2 PCR-RFLP分析

根據(jù)雞GNAS基因全序列(GenBank Accession No.：NC_006107.4)，采用Primer 6.0軟件設計啟動子區(qū)引物(表1)，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 突變檢測引物信息

Table 1 The information of primer for gene mutation detection

引物名稱Primer引物序列(5′?3′)Primersequence堿基位置/bpBaseposition產(chǎn)物長度/bpProductlengthGNAS＿promo3F：ACGACAGCAGGAAACGT11167489～11167505R：TGTGGCAGGCAGGTAACTGTGT11167809～11167830342

F. 上游引物；R.下游引物。表2同

F. Forward primer; R. Reverse primer. The same as Table 2

PCR反應體系：DNA 20 ng，2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各10 μmol·L-1，加水補至 25 μL。上ABI 9700型PCR儀(ABI，美國)進行擴增，反應程序：94 ℃ 5 min；然后進入PCR循環(huán)，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶DraI進行酶切，反應體系：PCR產(chǎn)物5 μL，10×buffer 2 μL，酶1 μL，加水補至20 μL。37 ℃酶切1 h。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，并送杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行DNA測序。

1.3 膚色和表達量檢測樣本

于126日齡時，采用美能達CR400型色差計(Konica Minolta，日本)測定150只東鄉(xiāng)綠殼蛋雞的胸側膚色L、a、b值。L為明度值(0～100)，0表示黑色，100表示白色；a為紅綠光值，正值表示偏紅，負值表示偏綠；b為黃藍光值，正值標示偏黃，負值表示偏藍。

同一日齡，分別選取各基因型的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞各6只，屠宰取胸側皮膚樣，液氮保存。采用TRIzol Plus RNA純化試劑盒(Invitrogen，美國)提取總RNA，SuperScript Ⅲ反轉錄試劑盒(Invitrogen，美國)合成單鏈cDNA，于-20 ℃保存。

1.4 定量PCR

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中相關基因的mRNA序列，采用Primer 6.0軟件分別設計EDN3、MC1R、GNAS、ADCY3 4個目的基因和18S內(nèi)參基因的mRNA引物(表2)，并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 表達量檢測引物信息

Table 2 The information of primer for gene expression detection

基因名稱GeneGenBank序列號GenBankNo．引物序列(5′?3′)Primersequence產(chǎn)物長度/bpProductlength18SAF173612．1F：CCGGACACGGACAGGATTGACAR：CAGACAAATCGCTCCACCAACTAAG94EDN3XM＿015296553．1F：CATCTGGATCAACACCCCAGR：ACTTTGATTCTGGCCCGTAG97MC1RNM＿001031462．1F：CCTGCTCTGCCTCATTGGCTTCTR：GGTAGATGGTGGGCTGCTTCTG131GNASXM＿015296547．1F：GCACCTCCAGTTGAACTAGCCAATR：CTCCGGTGGGAAATCGAAGTCT96ADCY3XM＿015285193．1F：CTGACTTTGACGCACTCCTGGATGR：CCATGTAGGTGCTGCCGATGGT78

定量PCR反應體系：cDNA 1 μL，Power SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，加水補至20 μL。上CFX384多重實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)進行擴增，反應程序：95℃ 1 min；然后進入PCR循環(huán)，95℃ 15 s，63℃ 25 s，40個循環(huán)。55～95℃繪制熔解曲線，每0.2℃讀板一次。每個樣本做3個重復，記錄Ct值，2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計分析

人(Homosapiens)、豬(Susscrofa)、小鼠(Musmusculus)、爪蛙(Xenopustropicalis)、雞(Gallusgallus)、鵪鶉(Coturnixjaponica)、斑馬魚(Daniorerio)的GNAS基因序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫，分別以轉錄起始位點為基準，取其上游5 000 bp至下游1 000 bp共6 kb序列進行生物信息學分析。采用MEGA 5.1軟件構建進化樹[9]；比對雞-鵪鶉-人、雞-鵪鶉-豬、雞-鵪鶉-小鼠、雞-鵪鶉-爪蛙、雞-鵪鶉-斑馬魚共5組序列，計算各組每500 bp的保守堿基率(保守堿基數(shù)/堿基總數(shù))。

以雞GNAS基因的轉錄起始位點為基準，取其上游1～3 000 bp序列進行生物信息學分析。采用Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)和FFROM(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter)在線軟件預測啟動子。

膚色和表達量數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行方差齊性檢驗，對齊性數(shù)據(jù)用單因素方差分析(Duncan法)，對不齊性數(shù)據(jù)用獨立樣本非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis法)。表達量數(shù)據(jù)之間的相關性采用SPSS 21.0軟件中的雙變量相關分析(Pearson相關系數(shù))。突變檢測值與理論值的符合度采用SPSS 21.0軟件中的卡方檢驗(Fisher’s法)。上述分析均以P<0.05為差異顯著，以P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 突變篩查和位點情況

7個物種的進化樹見圖1A，雞和鵪鶉具有較高同源性，因此設定都包含有雞和鵪鶉的5組比對序列，其保守堿基率曲線見圖1B。在0～-3 000 bp范圍內(nèi)，5組保守堿基率稍低于兩側區(qū)域；同時，從雞GNAS基因的SNP統(tǒng)計(圖1C)來看，0～-3 000 bp的SNP個數(shù)稍高于兩側，這些均表明GNAS基因的轉錄起始位點上游3 000 bp以內(nèi)更具篩查意義，因此選擇-3 000～-1區(qū)域進行啟動子突變探查。

A. 7個動物物種根據(jù)GNAS基因生成的進化樹，采用最大似然法的Tamura-Nei模型，以斑馬魚為遍歷根。B. 5組比對序列的每500 bp的保守堿基率曲線，X軸0表示GNAS基因的轉錄起始位點。C. 雞GNAS基因的每500 bp的SNP個數(shù)統(tǒng)計值曲線，X軸0表示轉錄起始位點A. Show the phylogenetic tree of 7 species by GNAS genetic distance, based on the Tamura-Nei model of maximum likelihood method, in zebrafish traversal root. B. Show the GNAS conserved rates for each 500 bp of 5 groups, X-axis “0” represents the transcription start site. C. Show the GNAS SNP statistical curve for each 500 bp, X-axis “0” represents the transcription start site圖1 GNAS基因進化樹、保守堿基率和SNP統(tǒng)計Fig.1 The phylogenetic tree, conserved rates and SNP statistics of GNAS

經(jīng)探查和篩選，得到位于-2 270 bp處的突變位點(染色體上堿基位置11 167 660，rs號314048279)。該SNP為T/C突變(簡稱T2270C)，DraI酶切電泳后有3種條帶結果：CC純合基因型出現(xiàn)一條342 bp條帶；TC雜合基因型出現(xiàn)171和342 bp兩條帶；TT隱性純合基因型出現(xiàn)一條171 bp條帶，酶切圖和測序圖分別見圖2A和圖2B。

兩種軟件的啟動子預測結果見表3，當T2270C堿基(即查找序列的714處)為T時，在該點附近均預測到啟動子；而T2270C突變?yōu)镃時，該點附近的啟動子消失，表明T2270C是啟動子的關鍵位點。

A. Dra I酶切電泳結果，CC、TC、TT分別代表3種基因型，M為DNA相對分子質量標準。B. 3種基因型的測序結果，箭頭所指堿基為突變位點A. The electrophoresis result after Dra I enzyme digestion, CC, TC, TT represent the 3 genotypes respectively, M mean DNA marker. B. The sequencing result of the 3 genotypes, and the bases pointed by arrows are the mutation sites圖2 突變位點酶切和測序圖Fig.2 The digestion and sequencing maps of the mutation site

表3GNAS基因啟動子預測結果

Table 3 The prediction results ofGNASgene promoter

軟件名稱SoftwareT2270C為T時的預測結果PredictionresultwhenT2270CwasTT2270C為C時的預測結果PredictionresultwhenT2270CwasCNeuralNetworkStartEndScorePromoterSequence7037530．94AGGTAGTCCTTAAAAACAGTGGTGCCTGGCTTC?ACCCTGGGCATATCAG160416540．90CATGTGATAATCAAAATTCCCCCCACTCTTGGACT?GCTGCATCTGCCCTGStartEndScorePromoterSequence160416540．90CATGTGATAATCAAAATTCCCCCCACTCTTGGAC?TGCTGCATCTGCCCTGFFROM1promoter/enhancer(s)arepredictedPromoterPos：746LDF：-0．722TATAboxat712+7．427TTAAAAA0promoter/enhancer(s)arepredicted

帶方框淺灰底色字符為突變位點

The character with border and light-gray shading are the mutation sites

2.2 突變與膚色的相關性

3種突變基因型的膚色L、a、b值見圖3(n=150)。組間L值差異極顯著(P<0.01)，CC基因型的L值最小，表現(xiàn)為膚色最深；TT基因型的L值最大，表現(xiàn)為膚色淺白。a為正值，b為負值，但3組間均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 不同突變基因型的相關基因表達量

3種突變基因型的EDN3、MC1R、GNAS和ADCY3基因表達量見圖4(n=3×6)。EDN3基因表達量的組間差異極顯著(P<0.01)，以CC基因型的為最高，TT基因型的為最低。MC1R、GNAS和ADCY3基因表達量的組間差異均不顯著(P>0.05)，但以CC基因型的表達量最高。GNAS基因與上游MC1R基因的表達量之間的相關性不顯著，而與下游ADCY3基因表達量之間的相關性極顯著(P<0.01)。

柱形圖上方數(shù)據(jù)為各基因型的膚色平均值，肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。柱形圖的灰度根據(jù)各基因型的膚色L值模擬生成The data upon each column is the average value of skin color of each genotype, and the different superscript lowercase letters represent significant difference (P<0.05), meanwhile the different superscript uppercase letters represent extremely significant difference (P<0.01). The gray level is simulated according to the skin color L value of each genotype圖3 突變基因型的膚色值Fig.3 The skin color values of the mutation genotypes

圖中的散點表示各基因型的基因表達量，橫豎線分別表示平均值和標準差。EDN3基因上方的“**”表示基因型間的差異極顯著(P<0.01)。MC1R和GNAS、GNAS和ADCY3基因之間的數(shù)值為表達量的相關性值，“**”表示相關性極顯著(P<0.01)The scatters in each column represent the gene expression level of each genotype, and the horizontal and vertical line represent the mean and standard deviation, respectively. The “**” upon EDN3 gene represent extremely significant difference among 3 genotypes (P<0.01). The value between MC1R and GNAS, GNAS and ADCY3 are the correlation values of gene expression, and the “**”represent extremely significant difference (P<0.01)圖4 突變基因型的相關基因表達量Fig.4 The expression levels of the related genes of the mutation genotypes

2.4 不同雞種的突變檢測情況

3個雞種的GNAS突變檢測結果見表4。江山烏骨雞膚色全黑，經(jīng)檢測基本為CC基因型。伊莎蛋雞B系的膚色白，檢測全為TT基因型。將東鄉(xiāng)綠殼蛋雞公雞與伊莎蛋雞B系母雞進行膚色測交，檢測無白膚后代的家系群體(有3個家系，3♂×18♀的后代共67只，均無白膚)基本為TC基因型。卡方檢驗表明，以上檢測結果與理論值相符(P>0.05)。

表4 雞種的GNAS突變檢測結果

Table 4 The detection results ofGNASgene mutation in chicken breeds

雞種Chickenbreed只數(shù)/只Number基因型GenotypeCCTCTTP值Pvalue江山烏骨雞JiangshanBlack?bonechicken6056400．119伊莎蛋雞B系ISAlayerBline600060-東鄉(xiāng)綠殼蛋雞×伊莎蛋雞B系DongxiangBlue?eggshellcock×ISAhen6706250．058

3 討 論

據(jù)報道，和GNAS同屬鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(GNA)基因家族的GNAQ、GNA11基因的突變型與惡性黑色素瘤病人存在相關性[10-11]，而人GNAS基因第5外顯子T393C多態(tài)與黑色素瘤、膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤生存期顯著相關[5,12-13]；第8外顯子R201H、R201C突變在纖維性發(fā)育不良病中的發(fā)生率達86%[7]。本研究篩查到了雞GNAS基因的啟動子區(qū)突變，其不同基因型間的膚色明度值差異顯著，但在針對雞相應于人GNAS的外顯子區(qū)的突變篩查中沒有發(fā)現(xiàn)類似位點。雖然人的黑色素瘤、纖維性發(fā)育不良和雞的纖維化黑色變(Fm)都牽涉機體的黑色素、纖維組織等成分，但與這些表象相關聯(lián)的GNAS突變并不一樣，這應是因為物種以及具體性狀不同所致。本研究同時檢測了與黑色素沉積密切相關的EDN3基因表達量，發(fā)現(xiàn)在GNAS基因T2270C突變的CC純合基因型中，其EDN3表達量要高于TT隱性基因型10倍以上，這一結果與B. Dorshorst等關于絲羽烏骨雞(烏膚純合)、新漢普夏雞(白膚對照)的檢測結論一致[3]，也反映出該GNAS突變確實與黑色素以及烏膚性狀有關。

就GNAS的上下游通路基因而言，MC1R已被證實是控制雞黑色素性狀的重要基因[14]，但主要關聯(lián)羽色，本研究檢測到MC1R在皮膚中的表達量低，且與GNAS表達量相關性不強；ADCY3作為GNAS下游的結合效應物，直接受其調(diào)節(jié)，檢測發(fā)現(xiàn)二者的基因表達量呈現(xiàn)出強相關性。據(jù)此推測，GNAS啟動子突變可能是通過影響本底以及下游基因的表達，最終反映到膚色差異，但更明晰的分子調(diào)控機制還需要深入研究發(fā)掘。啟動子突變一般通過轉錄因子結合而調(diào)控靶基因表達，比如TERT基因啟動子的C228T、C250T突變與人黑色素瘤強相關，機制是突變產(chǎn)生ETS轉錄因子的共有結合位點，從而增強了基因的轉錄活性[15-16]；在對雞的Piwil1基因NF-Y轉錄因子、L-FABP基因C/EBPα轉錄因子實行定點突變后，啟動子活性呈顯著下降或升高[17-18]。因此，后續(xù)可重點分析該GNAS突變附近的轉錄因子，研究突變引起的啟動子活性變化情況。

當前，家禽育種領域內(nèi)已有一些基因突變的研究應用，例如K. L. Wells等通過全基因組SNP掃描發(fā)現(xiàn)無毛雞品系的FGF20基因存在R179X突變，并開發(fā)出dCAPS標記方法進行檢測[19]；Q. Chu等通過FMO3基因T329S突變的TaqMan探針法檢測，在北京油雞群體中逐步剔除含魚腥味缺陷的個體[20]。本研究的GNAS基因突變在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞中得到性狀關聯(lián)驗證，即CC純合型的烏膚深色度要顯著高于TC雜合型。因此在早期選擇時，可結合GNAS分子標記，對東鄉(xiāng)綠殼蛋雞進行膚色分型，提高選種效率。進一步地，可擴展研究并應用在其他烏骨雞種中，實現(xiàn)膚色性狀的定向培育。

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(編輯 郭云雁)

GNAS Gene Promoter Mutation in Chicken and the Correlation with Skin Color Traits

WANG Huan-huan1，CHEN Mei-ling1，LOU Li-feng1，ZHANG Lei1，ZHANG Cheng-xian2，CHEN Xian-hui2，ZHANG Xue-dong1*

(1. Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310024，China；2.ZhejiangGuangdaPoultryBreedingCompany，Haining310016，China)

The study aimed to investigate the mutation ofGNASgene and its effect on skin color traits in chicken. Dongxiang Blue-eggshell chicken (Gallusgallusdomestica) was chose and theGNASmutation sites related to skin color were screened using PCR-restriction length polymorphism (RFLP) and DNA sequencing in this study. We detected expression of theEDN3,MC1R,GNASandADCY3 genes using fluorescence quantitative PCR, and the mutation sites among 3 chicken breeds. The results showed that there was a T/C mutation at base 11 167 660 on chicken chromosome 20 and the mutation (T2270C) was crucial for theGNASgene promoter. AfterDraI enzyme digestion for PCR products, the CC homozygous genotype, the TC heterozygous genotype and the TT recessive homozygous genotype presented one band at 342 bp, two bands at 171 and 342 bp, and one band at 171 bp, respectively. The L values of skin color were statistically significantly different among 3 genotypes (P<0.01). The individuals with CC genotype had the lowest L value, which presented the darkest skin, and the individuals with TT genotype had the highest L value, which presented the lightest skin. Expression of theEDN3 gene was highest and lowest in individuals with the CC and TT genotype, respectively, and the difference among 3 genotypes was extremely significant (P<0.01). Expression of theMC1R,GNASandADCY3 genes was highest in individuals with CC genotype, but the difference among genotypes was not significant (P>0.05). The correlation ofGNASwithMC1Rwas non-significant in expression, and the correlation withADCY3 was extremely significant (P<0.01). The typing results according to mutation detection in Jiangshan Black-bone chicken, ISA layer, test-crossing offspring of Dongxiang Blue-eggshell cock and ISA hen, conformed to the theoretical values (P>0.05). The study indicate that the T2270C mutation inGNASgene promoter in chicken is correlated strongly with the skin color traits, and detection of the mutation can be used in the breeding of black-bone chicken.

chicken；GNASgene；mutation；skin color

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.12.004

2016-05-16

國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術體系綜合試驗站(CARS-42-Z07)；浙江省公益技術研究農(nóng)業(yè)項目(2015C32106)

王歡歡(1986-)，女，黑龍江佳木斯人，畜牧師，碩士，主要從事動物遺傳育種工作，E-mail: wennuan2009@163.com

*通信作者：章學東，研究員，E-mail：bigzhengliang@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2016)12-2354-08