梁鵬舉,姜建輝,*,秦少偉,康 雷

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.南疆化工重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

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響應(yīng)面法優(yōu)化灰棗中黃酮提取工藝研究

梁鵬舉1,2,姜建輝1,2,*,秦少偉1,2,康 雷1,2

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.南疆化工重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

以提取時間、提取溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)為實驗因素,在單因素基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法優(yōu)化灰棗中黃酮提取工藝。確定灰棗中黃酮最佳提取工藝條件為:提取時間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶29(g∶mL),乙醇體積分數(shù)70%,實際提取量為3.266 mg/g。實際提取值與模型預測值之間的RSD為0.38%,實際優(yōu)化的工藝條件與理論預測擬合程度高。

新疆灰棗,響應(yīng)面,黃酮,提取

灰棗又名羌棗,為鼠李科棗屬植物的成熟果實,是中國唯一在樹上自然吊干的紅棗?；覘椀妹且驗榍紬椩诔墒熳兗t之前,通體發(fā)灰,好似掛了一層霜,所以得名“灰棗”?；覘椀脑耘嗥鹪从诤幽闲锣?有2700余年栽培歷史,后大面積栽培種植于新疆等地[1]。灰棗具有增強人體免疫力、增強肌力、保護肝臟、抗過敏、鎮(zhèn)靜安神、健脾益胃、補氣養(yǎng)血的作用[2-4]。Guangpu Liu等[5]以甲醇為紅棗多糖提取溶劑,進行了黃河灘棗多糖保肝作用的研究;Huanxia Zhao等[6]以乙醇為提取溶劑,進行了7個不同品種的中國紅棗酚類化合物抗氧化活性的研究;趙志永等[7]研究了新疆駿棗中總黃酮的提取,乙醇多次浸提,用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝,得到駿棗總黃酮的平均提取量為2.32 mg/g;Xiaohong Kou等[8]在不同品種紅棗生物活性成分及抗氧化能力的研究中,以80%甲醇為溶劑,用超聲輔助的方法提取了不同品種紅棗中的總黃酮,其中灰棗總黃酮含量在0.67±0.06 mg RE/g FW之間;Sheng Guo等[9]以甲醇為溶劑,超聲輔助的方法提取并進行了Z.jujuba和Z.jujubavar. spinosa兩種紅棗葉子中三萜酸、皂苷和黃酮的定性定量研究分析。近年新疆灰棗資源化利用漸成熱點,但關(guān)于灰棗總黃酮含量的提取及測定鮮見報道。

本文以乙醇為溶劑,利用超聲波輔助法提取灰棗中的總黃酮,對灰棗黃酮的超聲波輔助乙醇提取工藝參數(shù)進行了探索,利用單因素和響應(yīng)面對超聲輔助乙醇提取工藝進行優(yōu)化,旨在為灰棗產(chǎn)業(yè)的綜合發(fā)展和高價值加工利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆灰棗 采購于新疆阿拉爾市果園,灰棗陰干去皮去核、粉碎過篩(40目),收集灰棗粉末備用;蘆丁對照品 純度≥95%,上海藍季科技發(fā)展有限公司;石油醚、氫氧化鈉 分析純,天津市致遠化學試劑有限公司;硝酸鋁 分析純,北京市實驗科學儀器廠;亞硝酸鈉 分析純,上海試劑一廠;無水乙醇 分析純,天津市光復科技發(fā)展有限公司;濃硫酸 分析純,汕頭市西隴化工廠。

電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;標準檢驗篩 上虞市儀器設(shè)備廠;AL104電子分析天平 0.0001 g,上海恒平科學儀器有限公司;KQ-400 KED數(shù)控超聲波清洗器 超聲功率400 W,昆山市超聲儀器有限公司;循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;UT-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取灰棗總黃酮的工藝流程 灰棗→60 ℃干燥→機械剝離法去皮、核→粉碎40目過篩→超聲波輔助乙醇提取→減壓過濾→濾液離心→上清液定容→制備得到待測液。

將灰棗陰干,去皮、去核,粉碎并過40目篩,得灰棗干粉。每次準確稱取過篩后的灰棗粉末1 g,將其轉(zhuǎn)入到250 mL的圓底燒瓶中,按實驗工藝流程分別設(shè)定不同的提取時間、配制不同的料液比以及不同比例的乙醇用量、不同提取溫度,逐步對灰棗中黃酮進行提取,得黃酮提取液。

1.2.2 灰棗總黃酮含量測定

1.2.2.1 繪制蘆丁標準曲線 配制濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液,確定對照品溶液在波長為510 nm處具有最大吸收[6]。分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL蘆丁溶液[10],用雙光束紫外可見分光光度計在波長為510 nm處測定不同溶液的吸收度值。以縱坐標為吸光度A,橫坐標為蘆丁質(zhì)量濃度C(mg/mL)繪制標準曲線,并做回歸處理,得回歸線方程為y=8.6000x+0.0102,R2=0.9992。

1.2.2.2 總黃酮提取量的計算 樣品溶液測定將所得提取液定容于25 mL的容量瓶中得樣品溶液,分別準確移取樣品溶液2.00 mL于10 mL容量瓶中,按標準曲線的測定方法測定所制備實驗樣品溶液的吸光度,再對照所繪制標準曲線查得對應(yīng)的黃酮濃度,依據(jù)下式計算灰棗總黃酮量。

總黃酮提取量(mg/g)=CV1V0/V2W

其中:C-標準曲線查得的黃酮濃度(mg/mL);V0-灰棗黃酮初次提取液經(jīng)定容后的體積(mL);V1-實驗樣品溶液測定時定容后的體積(mL);V2-實驗樣品溶液測定時的體積(mL);W-灰棗粉末質(zhì)量(g)。

1.2.3 超聲輔助提取灰棗中總黃酮

1.2.3.1 單因素實驗 以提取時間(min)、提取溫度(℃)、料液比(g:mL)、乙醇體積分數(shù)(%)為考察因素,以灰棗中總黃酮得率為指標,確定響應(yīng)面實驗因素水平。

提取時間:準確稱取灰棗粉末1 g,將其置于圓底燒瓶中,按照1.2.1中實驗工藝對材料預處理。固定提取溫度30 ℃、料液比1∶20、乙醇體積分數(shù)90%，分別在提取時間為10、20、30、40、50 min的條件下進行超聲輔助提取。

提取溫度:確定最優(yōu)的提取時間,固定料液比1∶20、乙醇體積分數(shù)90%，分別在溫度為20、30、40、50、60 ℃條件下超聲輔助提取。

料液比:確定最優(yōu)的提取時間、提取溫度,固定乙醇體積分數(shù)90%，分別在料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g∶mL)條件下超聲輔助提取。

乙醇體積分數(shù):確定最優(yōu)的提取時間、溫度和料液比,分別在乙醇體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%條件下超聲輔助提取。

1.2.3.2 灰棗總黃酮提取的響應(yīng)面實驗設(shè)計 采用Design-Expert軟件處理數(shù)據(jù)[11],根據(jù)單因素實驗結(jié)果,提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、乙醇體積分數(shù)(D)為實驗因素,以黃酮提取量為響應(yīng)值,進行實驗的設(shè)計,響應(yīng)面因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平

1.2.4 灰棗總黃酮提取重復性實驗 為驗證通過實驗選定的最佳提取工藝重復性[12],分別準確稱取6份灰棗粉末1 g,以上述過程選定的最佳提取工藝參數(shù)條件下分別進行6次平行實驗,并顯色及測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 以黃酮提取率為考察指標,用Design Expert V 8. 0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,應(yīng)用響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology,RSM)對結(jié)果進行數(shù)模分析并優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間 由圖1可知,超聲輔助提取時間為30 min時所得灰棗黃酮提取量最大,當超聲輔助時間繼續(xù)延長后灰棗總黃酮提取量反而下降。這表明超聲時間對灰棗總黃酮提取具有明顯影響,可能由于超聲時間過長,致使提取過程中超聲波強大的空化作用導致溶液中雜質(zhì)含量增加及黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,因而黃酮提取量出現(xiàn)下降。超聲輔助提取灰棗總黃酮的最佳提取時間確定為30 min。

圖1 超聲輔助提取時間對提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction of effect for flavones

2.1.2 提取溫度 由圖2可知,隨著超聲輔助提取溫度從20 ℃升高到40 ℃,灰棗黃酮的提取量逐漸增加,且呈線性關(guān)系,當超聲輔助提取溫度達40 ℃時灰棗總黃酮提取量最高,再增高超聲輔助提取溫度，灰棗總黃酮的提取量呈下降趨勢,這說明超聲輔助提取溫度對灰棗總黃酮提取量影響顯著,過高的溫度會導致可溶性蛋白質(zhì)溶出變性,影響灰棗細胞的破裂[11],進而阻礙灰棗總黃酮從其細胞的溶出,使灰棗黃酮提取量呈下降趨勢。超聲輔助灰棗黃酮提取最佳溫度確定為40 ℃。

圖2 超聲輔助提取溫度對提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction of effect for flavones

2.1.3 料液比 由圖3可知,隨著料液比的逐漸增大,灰棗黃酮提取量從料液比1∶5到1∶10范圍內(nèi)增加量變化明顯,料液比繼續(xù)增大,灰棗黃酮提取量持續(xù)增高,總黃酮的溶出速度也變大,料液比達1∶30時超聲輔助灰棗黃酮提取量為最大,當料液比繼續(xù)增大灰棗黃酮提取量下降。這表明當料液比高達一定值時總黃酮充分溶出,若持續(xù)增大料液比,灰棗總黃酮的提取量已基本趨于穩(wěn)定,黃酮類物質(zhì)在提取液中趨于飽和[12]。超聲輔助提取灰棗黃酮的最佳料液比確定為1∶30。

圖3 超聲輔助提取料液比對提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio with ultrasonic on extraction of effect for flavones

2.1.4 95%乙醇體積分數(shù) 由圖4可知,隨著乙醇和水互溶單相體系中乙醇體積分數(shù)從50%、60%到70%,灰棗總黃酮提取量基本以線性關(guān)系隨乙醇體積分數(shù)的增加而增大,在體系中乙醇體積分數(shù)達70%時,灰棗黃酮提取量達最大,體系中乙醇體積分數(shù)為80%時,灰棗黃酮提取量明顯下降,乙醇體積分數(shù)高達90%時灰棗黃酮提取量呈最低。乙醇和水都為極性溶劑,兩者配比體積分數(shù)不斷變化時,所形成溶液的極性也會不同,在超聲輔助提取灰棗黃酮時70%乙醇和水的體積比所形成溶液的極性最有利用灰棗中黃酮類化合物的溶出,乙醇體積分數(shù)過大時會增加灰棗中一些脂溶性物質(zhì)溶出,對黃酮類物質(zhì)的溶出造成影響[13],灰棗黃酮提取量下降。超聲輔助提取灰棗總黃酮選用乙醇體積分數(shù)占70%時黃酮溶出量最高。

圖4 超聲輔助提取乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響Fig.4 Effect of the volume fraction of ethanol with ultrasonic on extraction of effect for flavones

2.2 超聲輔助灰棗黃酮最佳提取工藝研究

按照Box-Behnken組合設(shè)計[14],根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)和乙醇體積分數(shù)(D)作為自變量,以新疆灰棗黃酮提取量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面實驗。表2為實驗方案的設(shè)計和結(jié)果,表3為方差分析結(jié)果。

2.2.1響應(yīng)曲面分析 對表2結(jié)果進行統(tǒng)計分析,得二次回歸方程模型為:Y=-8.70567+0.099032A+0.11330B+0.059298C+0.19684D-1.45000E-004AB+7.25000E-005AC+2.175000E-004BC+9.425000E-004BD+3.75000E-005CD-1.07858E-003A2-1.80483E-003B2-1.29858E-003C2-1.67733E-003D2

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

響應(yīng)曲面傾斜度大說明交互作用大,反之則小。由響應(yīng)面圖(圖6)及p值的分析可得,兩兩因素間對響應(yīng)值均有一定的交互作用[15],其中提取時間-溫度、提取時間-料液比、提取時間-體積分數(shù)、提取溫度-料液比、料液比-體積分數(shù)交互作用不顯著,提取溫度-體積分數(shù)(BD)的交互作用對灰棗黃酮的提取量影響較為顯著[13]。

圖6 各因素交互作用影響灰棗黃酮提取量的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface graphshowing the effects ofvarious factors on the extraction yield of Zizyphus jujube cv. Huizao flavonoids

通過Design-Expert軟件分析得到乙醇溶液提取灰棗黃酮的最優(yōu)工藝條件為提取時間29.56 min,提取溫度40.00 ℃,料液比1∶28.84(g∶mL),乙醇體積分數(shù)69.22%,理論提取量3.259 mg/g。結(jié)合實際實驗條件,確定灰棗黃酮最佳提取條件為:提取時間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶29(g∶mL),乙醇體積分數(shù)70%,經(jīng)5次平行實驗,測得灰棗的實際提取量為3.266 mg/g,理論提取量與實際提取量間的RSD值為0.38%,相差較小?；貧w線分析表明,此方法合理可行。

2.2.2 重復性實驗 按選定的最優(yōu)條件進行6次平行實驗,在吸光度為0.292 A時,灰棗黃酮的平均提取量達3.265 mg/g,RSD為0.52%(n=6),表明用此工藝提取灰棗中總黃酮,重復性顯示良好。通過實驗研究表明灰棗中總黃酮的含量高于駿棗[7]。

3 結(jié)論

本實驗研究了灰棗中黃酮類化合物的提取工藝,通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗得灰棗中總黃酮超聲輔助提取最佳工藝條件為:提取時間30 min,提取溫度40 ℃,料液比1∶29(g∶mL),乙醇體積分數(shù)70%,該條件下實際提取量為3.266 mg/g。建立的實驗模型擬合度高,可用于其它方法對灰棗中總黃酮提取工藝的優(yōu)化篩選。

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Optimization of extraction technique of flavonoids fromZizyphusjujubecv. Huizao by response surface methodology

LIANG Peng-ju1,2,JIANG Jian-hui1,2,*,QING Shao-wei1,2,KANG Lei1,2

(1.College of Life Sciences,Tarim University,Alar 843300,China; 2.Key Laboratory of Chemical Engineering in South Xinjiang,Alar 843300,China)

To optimize the ethanol extraction of total flavonoids fromZizyphusjujubecv. Huizao,the effects of extraction times of ultrasonic,temperature,liquid to solid ratio,the volume fraction of ethanol and their interaction on the extraction yield of jujube flavonoids were studied with Box-Behnken,on the basis of single factor tests. The optimum extraction conditions were obtained as follows:extraction time 30 min,extraction temperature 40 ℃,the ratio of solid to liquid 1∶29(g∶mL),the volume fraction of ethanol 70%.Under the optimal conditions,the extraction rate of total flavonoids fromZizyphusjujubecv.huizao was 3.266 mg/g,which RSD for 0.38% agreed well with the predictive value. The optimized conditions for flavonoids extraction fromZizyphusjujubecv. Huizao were reliable.

Zizyphusjujubecv. Huizao in xinjiang;response surface methodology;flavonoids;extraction

2016-04-18

梁鵬舉(1984-)，男，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學，E-mail：1251851363@qq.com。

*通訊作者:姜建輝(1978-)，男，碩士，副教授，研究方向：天然有機化學，E-mail：xjjjh78@163.com。

國家自然基金(21562035)資助項目。

TS201.1

B

1002-0306(2016)22-0264-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.043