張小莉

（陜西省咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 咸陽(yáng) 712000）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

丹珍頭痛膠囊微生物限度檢查方法研究

張小莉

（陜西省咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 咸陽(yáng) 712000）

目的 建立丹珍頭痛膠囊的微生物限度檢查方法。方法 根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的微生物計(jì)數(shù)法，通則1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查中的控制菌檢查法和通則1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。結(jié)果 采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定需氧菌總數(shù)，平皿法－傾注法測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)；控制菌檢查法采用常規(guī)法供試品陽(yáng)性對(duì)照組檢查陽(yáng)性目標(biāo)菌。結(jié)論 該方法可作為丹珍頭痛膠囊微生物限度的檢查方法。

丹珍頭痛膠囊；微生物限度檢查；方法適用性試驗(yàn)；薄膜過(guò)濾法；平皿法－傾注法

丹珍頭痛膠囊由高原丹參、夏枯草、熟地黃、珍珠母、雞血藤、川芎等12味中藥材組方[1]，有平肝熄風(fēng)、散瘀通絡(luò)、解痙止痛的功效，主要用于治療肝陽(yáng)上亢、瘀血阻絡(luò)所致的頭痛，背痛頸酸，煩躁易怒。2005年版《中國(guó)藥典(四部)》中規(guī)定了本產(chǎn)品的微生物限度檢查方法[2]。2015年版《中國(guó)藥典（四部）》[3]藥品微生物限度檢查法與歐美標(biāo)準(zhǔn)接軌[4]，相較2010年版[5]變化很大，尤其是微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)。本研究中根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法（通則1105、通則1106），建立適合該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法，對(duì)3批產(chǎn)品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法有效、可行?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

AD－1000型電子天平（福州志華科學(xué)儀器電子有限公司）；BHC1300IIA2型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BSP－250型生化培養(yǎng)箱（上海迅博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BMJ－250C型霉菌培養(yǎng)箱（上海迅博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FC752型一次性薄膜過(guò)濾器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 試藥、培養(yǎng)基與菌種

試藥：丹珍頭痛膠囊（規(guī)格為每粒 0.5 g，批號(hào)為20160111，20160313，20160402）。培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)為150801），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)為150825），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)為150801），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)為150801），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)為150801），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為151013），RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)為150201），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為 150507），三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)為140519），均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；pH＝7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液（稀釋劑，批號(hào)為141213，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；氯化鈉（分析純，批號(hào)為20160116，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

菌種：金黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus[CMCC (B)26 003]，銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa [CMCC(B)10 104]，枯草芽孢桿菌 Bacillussubtilis[CMCC (B)63 501]，白色念珠菌 Candida albicans[CMCC(F) 98 001]，黑曲霉 Aspergillusniger[CMCC(F)98 003]，大腸埃希菌 Escherichia coli[CMCC(B)44 102]，乙型副傷寒沙門(mén)菌 Salmonella paratyphi B[CMCC(B)50 094]，均為第3代，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

取上述金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌34℃培養(yǎng)20 h新鮮TSB培養(yǎng)物，白色念珠菌25℃培養(yǎng)2 d新鮮SDB培養(yǎng)物分別用0.9%氯化鈉注射液稀釋至1 000～10 000 cfu／m L；黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上，25℃培養(yǎng)7 d，用0.05%（V∶V）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉注射液洗脫黑曲霉孢子，稀釋成1 000～10 000 cfu／mL的孢子菌懸液（供菌落計(jì)數(shù)用）。

上述大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌34℃培養(yǎng)20 h新鮮TSB培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉注射液稀釋至10～100 cfu／mL（供控制菌用）。

2.2 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 供試品溶液制備

取供試品10 g，加pH＝7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋至100mL，40℃水浴振蕩15min，制備成1∶10的供試品溶液（1）；分別取供試品溶液50，20，10m L加至50，80，90m L稀釋液中，即得1∶20，1∶50，1∶100的系列濃度供試品溶液。

2.2.2 平皿法－傾注法

試驗(yàn)組[6]：取上述各試驗(yàn)菌液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）0.1m L加9.9 mL供試品溶液（1）搖勻，取5組各樣1m L注皿（直徑90mm，下同），每組平行2皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基34℃培養(yǎng)3 d，進(jìn)行需氧菌總數(shù)測(cè)定；分取后2組樣1mL注皿，每組平行2皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)3 d。進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。分別取金黃色葡萄球菌液0.1m L，加至9.9m L系列濃度供試品溶液，搖勻，同法操作，測(cè)定金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)。

供試品對(duì)照組：取上述稀釋劑0.1m L，加至9.9m L系列濃度供試品溶液，搖勻，取1mL加皿，操作同試驗(yàn)組，測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。

菌液對(duì)照組：取上述各試驗(yàn)菌液（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）0.1mL加至9.9mL稀釋液，依法測(cè)定所加菌落數(shù)。

全過(guò)程進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照無(wú)菌落生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，濃度1∶10時(shí)，金黃色葡萄球菌回收率小于0.5，需氧菌后4組的3次試驗(yàn)回收率均大于0.5，不可采用平皿法－傾注法（每1皿為1 m L，直徑為90 mm）進(jìn)行需氧菌總數(shù)測(cè)定。霉菌和酵母菌總數(shù)回收率大于0.5，可采用平皿法－傾注法（濃度為1∶10，稀釋液為pH＝7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，每1皿為1m L，直徑為90mm）測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。

2.2.3 薄膜過(guò)濾法[7]

試驗(yàn)組：取金黃色葡萄球菌液0.1 mL，加至1∶10濃度供試品溶液9.9 m L，搖勻。取樣1 mL注入含有100 m L沖洗液（pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，下同）的薄膜過(guò)濾器中（沖洗液潤(rùn)濕膜后再注入樣），進(jìn)行薄膜過(guò)濾，沖洗量分別為每膜300，500，800 m L，抽干，取出膜貼于胰酪大豆胨瓊脂平板34℃培養(yǎng)2 d，測(cè)定需氧菌總數(shù)（金黃色葡萄球菌）。

供試品對(duì)照組：取0.1 m L稀釋液加上述1∶10供試品溶液9.9m L，搖勻。取樣1m L注入含有100m L沖洗液的薄膜過(guò)濾器中（沖洗液潤(rùn)濕膜后再注入樣），操作同試驗(yàn)組，測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。

菌液組：取金黃色葡萄球菌液0.1mL，加至9.9mL稀釋液，搖勻。取菌液1mL注入含有100mL沖洗液的薄膜過(guò)濾器中（沖洗液潤(rùn)濕膜后再注入菌液），操作同試驗(yàn)組，測(cè)定所加菌落數(shù)。

全過(guò)程進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照無(wú)菌落生長(zhǎng)。結(jié)果顯示沖洗量為每膜800m L，回收率大于0.5。需氧菌總數(shù)用薄膜過(guò)濾法（取1∶10的供試品溶液1m L注入含有100mL的薄膜過(guò)濾器中，稀釋液為pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，沖洗液同稀釋液，沖洗量為每膜800mL，每次100m L）抽干，取膜貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上。

2.3 控制菌檢查方法適用性

2.3.1 大腸埃希菌

供試品溶液組：取1∶10濃度供試品溶液10m L，加至100m L的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中培養(yǎng)18 h，取TSB培養(yǎng)物1 mL加入100 m L麥康凱液體培養(yǎng)基中，按照2015年版《中國(guó)藥典(四部)》通則1106檢查，供試品溶液未檢出菌落。

供試品溶液陽(yáng)性對(duì)照組：取1∶10濃度供試品溶液10 mL，加至 100 m L的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，同時(shí)加少于1 m L（含大腸埃希菌10～100 cfu）培養(yǎng)18 h，按供試品溶液組方法操作，經(jīng)鑒定麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板檢出大腸埃希菌。

陰性對(duì)照試驗(yàn)同步。結(jié)果顯示，供試品溶液陽(yáng)性對(duì)照組檢出菌落，供試品溶液組、陰性對(duì)照組未檢出菌落?？刂凭椒ㄟm用性試驗(yàn)通過(guò)。

2.3.2 沙門(mén)菌

供試品溶液組：取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）100m L，40℃水浴振蕩15min，搖勻，即得供試品溶液，34℃培養(yǎng)18 h，取TSB培養(yǎng)物0.1mL，加至10mLRV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基，按2015年版《中國(guó)藥典(四部)》通則1106檢查，供試品未檢出菌落。

供試品溶液陽(yáng)性對(duì)照組：取供試品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）100 m L，40℃水浴振蕩15 min，即得供試品溶液，同時(shí)加入沙門(mén)菌少于1m L（含沙門(mén)菌10～100 cfu），混勻，34℃培養(yǎng)18 h。同供試品溶液組方法操作，經(jīng)鑒定三糖鐵瓊脂高層斜面檢出沙門(mén)菌。

陰性對(duì)照試驗(yàn)同步。結(jié)果顯示，供試品溶液陽(yáng)性對(duì)照組檢出菌落，供試品溶液組、陰性對(duì)照組未檢出菌落，控制菌方法適用性試驗(yàn)通過(guò)，可用常規(guī)法進(jìn)行該產(chǎn)品控制菌檢查。

3 討論

3.1 菌落計(jì)數(shù)

《中國(guó)藥典》規(guī)定選用濃度1∶10，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)回收率為0.5～2，小于0.5，不符合這一規(guī)定。選擇稀釋制成1∶20，1∶50，1∶100等不同濃度，且稀釋倍數(shù)不能超過(guò)該供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)[8]。本產(chǎn)品提取物均不含原藥材粉，需氧菌總數(shù)微生物限度標(biāo)準(zhǔn)1 000，而1∶1 000無(wú)實(shí)際意義，故選用薄膜過(guò)濾法。

3.2 控制菌檢查

一般情況下，控制菌檢查（除沙門(mén)菌外）選擇1∶10濃度，取10mL（即1 g），藥典規(guī)定檢出限每1 g（耐膽鹽革蘭陰性菌還有0.01，0.001 g）。如樣品特殊，不易制得1∶10，可制成其他濃度，取總量1 g即可。應(yīng)注意的是，試驗(yàn)中按照藥典規(guī)定最短時(shí)間培養(yǎng)[9]，現(xiàn)象不明顯可適當(dāng)延長(zhǎng)，但不得超過(guò)規(guī)定最長(zhǎng)時(shí)間?？刂凭?yáng)性對(duì)照可選擇儀器測(cè)定，但首次使用必須與藥典方法進(jìn)行比對(duì)，以確認(rèn)儀器檢查結(jié)果準(zhǔn)確。

3.3 稀釋液選擇

2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定有①pH＝7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液；②pH＝7.2磷酸鹽緩沖液；③胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基等。最常用的是①，有緩沖能力，提供營(yíng)養(yǎng)，且等滲較③成本低。如供試品含原藥材粉，則選用③較好，因?yàn)樗幍湟?guī)定含原藥材粉應(yīng)控制菌－耐膽鹽革蘭陰性菌，稀釋液選用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，可以制備1份供試品溶液，菌落計(jì)數(shù)和控制菌檢查項(xiàng)目可同時(shí)做。腸溶制劑一般選用②，如樣品特別復(fù)雜，選用其他溶劑時(shí)還應(yīng)加相應(yīng)的中和劑或滅活劑消除抑菌作用[10]。

3.4 薄膜過(guò)濾法

沖洗液及沖洗液總量選擇常用有①0.1%的蛋白胨溶液；②0.9%氯化鈉溶液；③pH＝7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液等。最常用的是①，其保證營(yíng)養(yǎng)使得菌落在沖洗過(guò)程中不受損，也易配制。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)選③有較強(qiáng)的緩沖能力，沖洗效果好。先每膜300 m L沖洗，回收率小于0.5，加至500 mL，直至800m L進(jìn)行沖洗，回收率大于0.5。沖洗次數(shù)少，減少細(xì)菌受損程度，選300m L可依次增加（總量小于1 000m L）直到回收率大于0.5，否則用雙膜法[11]或含有中和劑的沖洗液。值得注意的是，沖洗前加適量沖洗液潤(rùn)濕膜后，再加樣混勻沖洗，否則水溶性膜吸附樣品溶液，不易徹底沖洗殘留樣；貼膜用平板可預(yù)先制備，冰箱保存，用前放至室溫[12]；選用一次性封閉式薄膜過(guò)濾器，簡(jiǎn)單易行[13]。

3.5 菌落計(jì)數(shù)－霉菌和酵母菌總數(shù)所用培養(yǎng)基選擇

2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，所用是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）。SDA是廣譜霉菌培養(yǎng)基[14]，且藥典規(guī)定計(jì)入所生長(zhǎng)的細(xì)菌總數(shù)。有時(shí)藥材粉營(yíng)養(yǎng)成分在未處理徹底的情況下，霉菌和酵母菌總數(shù)超標(biāo)?？蛇x用選擇性培養(yǎng)基－玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，如選用含有抗生素的SDA，市場(chǎng)無(wú)商品培養(yǎng)基，加抗生素種類和量也不易控制；選用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，但需經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確認(rèn)。

3.6 方法適用性試驗(yàn)次數(shù)選擇

2010年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，菌落計(jì)數(shù)3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，但2015年版《中國(guó)藥典》未規(guī)定試驗(yàn)次數(shù)，采用2010版的方法和考察方法的可靠性強(qiáng)，一般生產(chǎn)企業(yè)選3個(gè)不同批號(hào)進(jìn)行試驗(yàn)（各1次），對(duì)第1次結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證以考察方法的耐用性?？刂凭鷻z查也同樣做3次試驗(yàn)。

3.7 培養(yǎng)條件選擇

菌落計(jì)數(shù)－霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)中黑曲霉20～25℃一般培養(yǎng)3 d[15]即可，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黑曲霉培養(yǎng)第4天后蔓延成片不好計(jì)數(shù)，故霉菌開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)應(yīng)每天觀察、計(jì)數(shù)。

[1]WS－10633（ZD－0633）－2002－2012Z.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：71－72.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：140－151.

[4]楊曉莉，李 輝，馬英英，等.中國(guó)藥典2015版非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法解讀[J].藥物分析雜志，2016，36（6）：1101－1107.

[5]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅩⅢC80－附錄ⅩⅢC84.

[6]羅達(dá)龍，覃 藍(lán)，李夷君，等.鹽酸氨溴索緩釋膠囊微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志(電子版)，2016，3（12）：2439－2440.

[7]李 芳，劉冬玲，劉 浩，等.氟羅沙星膠囊微生物限度檢查方法研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2016，41（6）：445－447.

[8]達(dá)朝榮，陳建強(qiáng) .藥品微生物限度檢查誤差影響因素的分析[J].北方藥學(xué)，2016，13（1）：177.

[9]楊曉莉，李 輝，馬英英，等.《中國(guó)藥典》2015版非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌法解讀與對(duì)策[J].中國(guó)藥師，2016，19(4)：748－752.

[10]董 芳，王嘉南，王風(fēng)平，等.鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法的驗(yàn)證[J].食品與藥品，2015，17（1）：40－43.

[11]丁 勃，徐曉潔，劉廣楨，等.雙濾膜過(guò)濾方法在藥品微生物限度檢查中的應(yīng)用研究[J].藥物分析雜志，2014，41（6）：2105－2106.

[12]張 穎，安秀華，王建平，等.藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基的滅菌和貯存期驗(yàn)證[J].中國(guó)藥房，2013，24（21）：2002－2004.

[13]劉毅萍，何建平.封閉式薄膜過(guò)濾器（一次性）在藥物藥品微生物限度檢查中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2003，20（1）：68－69.

[14]景榮先，張國(guó)林.2015版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法潔凈環(huán)境及計(jì)數(shù)培養(yǎng)基修訂分析探討[J].中國(guó)衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2015，12（5）：184－185.

[15]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：359.

M icrobial Lim it Test M ethod of Danzhen Toutong Capsules

Zhang Xiaoli
(Xianyang Food and Drug Inspection Center,Xianyang,Shaanxi,China 712000)

Ob jective To establish a microbial limit test method of Danzhen Toutong Capsules.M ethods According to the fourth volume of Chinese Pharmacopoeia(The 2015 edition),general rule 1105:microbial counting method for microbial limit test of non－sterile products,general rule 1106:the control bacteria examination method for microbial limit test of non－sterile products,general rule 1107:the test method for suitability of microbiological limits for non sterile drugs.Results The total number of aerobic bacteria was determined by the membrane－filter method,the total number of molds and yeasts were determined by plate－pour method,the control bacteria were examined by routine method for positive control group.Conclusion The method can be used as the microbial limit test method for Danzhen Toutong Capsules.

Danzhen Toutong Capsules;microbial limit test;operational suitability test;membrane－filter method;plate－pour method

R284.1

A

1006－4931(2017)07－0037－03

2016－11－24；

2017－01－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.011

張小莉，女，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)，（電子信箱）zxl38122885＠163.com。