陳偉健 謝煒星 溫龍飛 李鉞 任東成 晉大祥 丁金勇 龔水帝 郭惠智 陳嘵俊

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

OP是一種常見的全身性骨代謝疾病，以骨量減少和骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，并進(jìn)一步導(dǎo)致患者骨質(zhì)脆性增加和易于發(fā)生骨折。骨骼是一個(gè)動(dòng)態(tài)的活性組織，它需要通過不斷的重塑來維持骨礦化平衡及骨結(jié)構(gòu)的完整，持續(xù)的骨重建是保護(hù)骨骼健康的重要前提，由OC介導(dǎo)不斷吸收骨基質(zhì)，隨后由OB負(fù)責(zé)替代新骨。在骨重塑的過程中骨形成和骨吸收保持一種動(dòng)態(tài)平衡，稱為骨穩(wěn)態(tài)。OP就是由于這種骨穩(wěn)態(tài)被打破而導(dǎo)致的。OB和OC之間的相互調(diào)節(jié)，是保持骨形成和骨吸收之間骨穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。

Smad蛋白家族是近年通過基因篩查的辦法在無脊椎動(dòng)物中鑒定出來的新的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白。TGF-β通路與BMP通路是調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的重要通路。隨著不斷深入研究 Smad 蛋白家族發(fā)現(xiàn)，Smad 主要參與TGF-β通路與BMP通路的信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)OB與OC的形成與分化發(fā)揮重要作用。

1 Smad蛋白的介紹

1.1 Smad蛋白家族的發(fā)現(xiàn)

人們最初通過對(duì)果蠅進(jìn)行基因篩查的研究，發(fā)現(xiàn)了在TGF-β家族信號(hào)通道下游的 Mad 多肽有一個(gè)高度保守且未知的結(jié)構(gòu)域，而這一結(jié)構(gòu)域與從線蟲中分離的 3 種 cem-1、cem-2、cem-3 多肽相比較，具有高度的相似性， Mad 從此就作為了一個(gè)新的蛋白質(zhì)家族出現(xiàn)在人們面前。接著人們又通過基因篩查在新小桿線蟲上發(fā)現(xiàn) Sma-2、Sma-3、Sma-4 都有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，編碼屬于同一個(gè)蛋白家族，而且都處于 TGF-β 信號(hào)通道的下游，結(jié)構(gòu)與Mad蛋白相近，說明Sma蛋白與Mad蛋白聯(lián)系密切。后來進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mad蛋白和Sma蛋白都作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(分別稱為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體)下游，因此人們將 Mad蛋白 和 Sma 蛋白及其類似物統(tǒng)稱為 Smad 蛋白家族[1]。

1.2 Smad蛋白的分類

目前已經(jīng)有 9 種 Smad 成員相繼被報(bào)道，分別用Smad 1～ Smad 9表示。按照結(jié)構(gòu)和功能，Smad 可以被分為 3類: 第一類，受體調(diào)節(jié)的 Smads(R-Smads)，包括 Smad 1、2、3、5、8、9。Smad 2和Smad 3是TGF-β或活化素的特異性中介物，Smad 2和Smad 3因TGF-β和TGF-βⅡ型受體與激活素受體樣激酶類ALK4/5/7之間形成的復(fù)合物或活化素和活化素受體2發(fā)生磷酸化，負(fù)責(zé)參與TGF-β和活化素信號(hào)傳導(dǎo)途徑； BMPs I型受體ALK1/2/3/6、BMPs II型受體或活化素受體2形成的復(fù)合物則可激活Smad 1、5、 8，可能還有Smad 9，參與傳導(dǎo)BMP信號(hào)傳導(dǎo)。較早的研究已證實(shí)BMP-2/4就是通過Smad 1、5、8傳遞信號(hào)。第二類，共同介導(dǎo)的Smads(Co-Smad)，目前發(fā)現(xiàn)只有一種，就是 Smad 4。Smad 4就像一個(gè)中央傳感器，既不能被磷酸化，也不能結(jié)合TGF-β受體或BMP受體，但它幾乎能與所有激活的 R-Smads 形成異源的多聚復(fù)合物，并因此參與和調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因?yàn)镾mad 4有一個(gè)富含脯氨酸的Smad 4活化區(qū)(Smad 4 activiation domain,SAD) 能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活和抑制因子的相互作用，這是激活 R-Smads 所依賴的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所必需的。第三類，抑制性的 Smads(Ⅰ-Smads)，包括 Smad 6和Smad 7。在大多數(shù)靜息細(xì)胞中，Ⅰ-Smads 位于細(xì)胞核中，當(dāng)受到 TGF-β 刺激或泛素化調(diào)節(jié)因子Smurf1 過度表達(dá)時(shí)，Smad 6、7 從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，Ⅰ-Smads 與Ⅰ型受體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性的干擾 R-Smads募集和磷酸化，并同時(shí)抑制R-Smads 和 Co-Smad 復(fù)合物的形成和活性。Smad 6、7 還可以與泛素化連接酶Smurf E3 相作用，使其結(jié)合到Ⅰ型受體，導(dǎo)致受體降解，終止信號(hào)傳導(dǎo)。Smad 7 也能直接在細(xì)胞核上發(fā)揮作用，抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。Ⅰ-Smads蛋白可以作為TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)自我調(diào)節(jié)的一種負(fù)反饋信號(hào)，因?yàn)門GF-β可以誘導(dǎo)Ⅰ-Smads的mRNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所以Ⅰ-Smads能起到負(fù)反饋的作用緊密地控制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ⅰ-Smads能抑制Smad蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Smad 6主要抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Smad 7則能抑制TGF-β和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-4]。

1.3 Smad蛋白的結(jié)構(gòu)特征

Smad蛋白的N區(qū)和 C區(qū)有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別稱為MH1(Mad homology domain-1) 和 MH2(Mad homology domain-2),富含脯氨酸(Pro)。 MH1 和 MH2 之間是氨基酸序列與長度可變化的中間連接區(qū)(L)。MH2是功能效應(yīng)區(qū)，MH2 的功能包括與I 型受體發(fā)揮效應(yīng)，形成 Smad 多聚復(fù)合物，結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄共激活劑或共抑制劑。MH2在所有的 Smad 蛋白中是高度保守的。MH1是MH 2的功能抑制區(qū), 在未激活時(shí)，MH1抑制 MH2 的功能；當(dāng)激活后，MH1 負(fù)責(zé)結(jié)合到特異性的 DNA 序列。與MH2不同，MH1 只有在 R-Smad 和 Co-Smad中才是保守的。Smad蛋白的MH 1與MH2以結(jié)合狀態(tài)存在，當(dāng)受體與配體結(jié)合被活化后兩者解離，形成Smad復(fù)合體向核內(nèi)移行，在核內(nèi)蓄積引起靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前L區(qū)的功能尚不清楚[5]。

1.4 Smad通路作用機(jī)制

盡管Smad通路存在大多數(shù)的細(xì)胞類型和組織，但它是受TGF-β/BMP激活的額外通路。在TGF-β通路中，當(dāng)TGF-β 家族配體結(jié)合到Ⅱ型受體就激活Ⅱ型受體激酶，然后磷酸化Ⅰ型受體激酶上游富含甘氨酸 /絲氨酸的GS 區(qū)，GS 區(qū)的磷酸化又會(huì)激活Ⅰ型受體激酶，導(dǎo)致Ⅰ型受體發(fā)生自我磷酸化和細(xì)胞內(nèi)的 R-Smads一過性地與Ⅰ型受體直接進(jìn)行配體結(jié)合形成復(fù)合物，R-Smads的 C 區(qū)的Ser-Ser-Val/Met-Ser 序列(SSXS 區(qū))發(fā)生磷酸化。磷酸化的 R-Smads與Ⅰ型受體分離并與 Smad4 形成復(fù)合物。在BMP通路中，BMP首先與二型受體(BMP RⅡ)結(jié)合使其磷酸化，然后活化的BMP RⅡ磷酸化一型受體(BMP R I)并與其結(jié)合形成復(fù)合物?；罨氖荏w復(fù)合物進(jìn)一步激活一系列下游受體調(diào)節(jié)R-Smads，磷酸化的R-Smads與受體分離，與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物。通過TGF-β通路和BMP通路形成的這些復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與不同的 Smad結(jié)合原件(Smad-binding elements，SBE)、DNA 轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共激活劑或共抑制劑結(jié)合，并向核內(nèi)移行,在核內(nèi)蓄積引起正性或者負(fù)性調(diào)控調(diào)控靶基因的表達(dá)[6-8]。Ⅰ-Smads 的N區(qū)與其他通路的特異性有關(guān)并且缺乏MH1，能與R-Smad競(jìng)爭(zhēng)TGF-β和BMPs的I型受體，從而抑制R-Smad的磷酸化，抑制Smad通路，具體見圖1[9]。

2 Smad與骨質(zhì)疏松癥

隨著全球人口老齡化的趨勢(shì)，OP在全球的發(fā)病率也逐年增高，嚴(yán)重威脅著老年人的健康。OP的發(fā)病機(jī)制主要是由OB介導(dǎo)的骨形成與OC介導(dǎo)的骨吸收之間的骨穩(wěn)態(tài)失衡。OC相對(duì)比OB活躍，即骨吸收的趨勢(shì)大于骨形成的趨勢(shì)。Smad主要通過TGF-β/BMP通路直接參與誘導(dǎo)OB與OC的生成、分化，在調(diào)節(jié)骨代謝方面扮演著不可或缺的角色。

2.1 Smad蛋白與成骨細(xì)胞

負(fù)責(zé)骨形成活動(dòng)的OB是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)分化而來的，OB增殖分化由多種生長因子調(diào)控，包括TGF-β、BMP、Smad等。TGF-β與BMP通路都能促進(jìn)骨形成，而兩者的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都由Smad直接介導(dǎo)。

2.1.1在BMP通路中Smad蛋白與成骨細(xì)胞

BMPs是誘導(dǎo)OB分化和骨形成的有效的親骨因子，在動(dòng)物中已被證實(shí)能誘導(dǎo)骨形成。BMP-2通過增加OB分化的標(biāo)志酶-堿性磷酸酶ALP活化和骨鈣蛋白等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)BMSCs向OB分化，促進(jìn)骨形成。在所有Smad蛋白中，與成骨細(xì)胞分化關(guān)系密切的是 Smad 1和 Smad 5。Smad 1、5通過與BMP-Ⅰ A型或Ⅰ B型受體結(jié)合后直接活化、磷酸化， 接著 與2個(gè)或1個(gè)R-Smad 和 1 個(gè)Smad 4 以異源三聚體或異源二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，作用于成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子 runx2、Osterix等基因序列并上調(diào)其表達(dá)[6-8]。另外，Smad 1或Smad 5能特異地與OB分化密切相關(guān)的PEBP 2αA/AML 3 /CBFA 1基因啟動(dòng)子結(jié)合，一起誘導(dǎo)OB分化。在BMP-2缺乏的情況下，Smad 1或Smad 5過表達(dá)，也可以誘導(dǎo)ALP的活化和OB分化。特異性地敲除Smad1會(huì)引起骨量的減少。部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，mi R-155在BMP-2刺激后表達(dá)下調(diào)，具有抑制成骨細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的能力，其機(jī)理正是通過與Smad 5 mRNA的3’-UTR端結(jié)合抑制其基因表達(dá)[10]。Liu等[11]通過收集50位骨折的老年患者的骨樣本，發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，與年齡相關(guān)的PLEKHO1 mRNA水平上升會(huì)減少Smad 1/5 (p-Smad1/5)的磷酸化，抑制OB的生成。最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號(hào)通路的配體DLL1 在體內(nèi)外都具有促進(jìn) BMP9 誘導(dǎo) BMSCs 成骨分化的作用，且該效應(yīng)可能通過影響 BMP9 信號(hào)通路的多個(gè)環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。DLL1 能促進(jìn) BMP Ⅰ型受體 ALK2 的表達(dá)，同時(shí)也能上調(diào) Smad1 /5 /8 磷酸化水平及 SBE 的轉(zhuǎn)錄活性[12]。這些研究發(fā)現(xiàn)都說明了Smad蛋白是直接參與BMP通路誘導(dǎo)OB形成過程中的信號(hào)通路，OB的形成與磷酸化的Smad密切相關(guān)。

2.1.2在TGF-β通路中Smad蛋白與成骨細(xì)胞

除了BMP通路， Smad也能通過TGF-β通路促進(jìn)OB形成。在該通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，TGF-β先結(jié)合其II型受體，再激活其I型受體，組成受體復(fù)合物，受體復(fù)合物攜帶信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞膜后，因 Smad 受體激活錨蛋白在細(xì)胞膜及早期內(nèi)涵體膜上已錨定 Smad2或Smad3 蛋白，激活的TGF-β識(shí)別并結(jié)合活化Smad 2或Smad 3 蛋白[13]。Smad 2或Smad 3活化后與Smad 4形成復(fù)合物異位入核，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)反應(yīng)的級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，通過MH1區(qū)的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)與DNA上的SBE直接結(jié)合，誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，影響成骨細(xì)胞的增殖、分化及I型膠原蛋白的合成。有學(xué)者報(bào)道，葛根素促進(jìn)骨形成正是通過刺激Smad 2/3 mRNA的表達(dá)和刺激TGF-β1的分泌和合成[14]。此外，TGF-β還可誘導(dǎo)OB自身表達(dá)并誘導(dǎo) BMP-2 在OB中的表達(dá)，增加其成骨能力。

2.2 Smad蛋白與破骨細(xì)胞

負(fù)責(zé)骨吸收活動(dòng)的OC起源于造血干細(xì)胞， OC的形成依賴于核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B Ligand，RANKL)和集落刺激因子1(colony stimulating factor -1，CSF-1)的協(xié)同作用，兩者都源于OB的分泌。CSF-1在未成熟的OC表面結(jié)合其受體激活信號(hào)通路對(duì)于破骨細(xì)胞前體的增殖與存活必不可少；而RANKL對(duì)于OC的成熟、分化更是起核心作用，RANKL在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面與RANK通過可溶性或膜結(jié)合，促使成熟OC的形成，激活和存活。

2.2.1在TGF-β通路中Smad蛋白與破骨細(xì)胞

至今為止，人們知道TGF-β對(duì)OC的生成有密切聯(lián)系， TGF-β可以直接作用于骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages，BMMs)并促進(jìn)OC的形成， RANKL 與巨噬細(xì)胞集落刺激因子結(jié)合誘導(dǎo)OC生成，在這一過程中內(nèi)源性的TGF-β是關(guān)鍵。TGF-β能招募破骨細(xì)胞前體到骨環(huán)境中并在RANKL的幫助下推動(dòng)OC分化，促進(jìn)骨吸收。在破骨細(xì)胞分化過程中，TGF-β與其II型受體結(jié)合并招募和磷酸化I型受體，導(dǎo)致smad 2和Smad 3的磷酸化，負(fù)責(zé)TGF-β通路下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。具體而言，TGF-β增強(qiáng)了RANKL介導(dǎo)smad 2或Smad 3與Smad 4組成的復(fù)合體易位到細(xì)胞核并與Nfatc1靶基因結(jié)合，驅(qū)動(dòng)Nfatc1的表達(dá)，這是調(diào)控OC分化的關(guān)鍵因素，在這過程中，腫瘤壞死因子受體連接因子6與 Smad 3的MH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合也起著關(guān)鍵的作用[15]。然而有趣的是，TGF-β又會(huì)影響B(tài)MMs周圍的基質(zhì)細(xì)胞而間接抑制OC的形成。其次，TGF-β能促進(jìn)OB分泌骨保護(hù)素，通過結(jié)合RANK而影響RANK與RANKL的相互作用，進(jìn)而抑制OC的活性和分化[16]。Yasui等[17]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)阻擋Smad通路后，RANKL誘導(dǎo)OC形成受到抑制，此時(shí)激活的突變Smad 2或Smad 3能翻轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，Smad 2/3直接與TRAF6-TAB1-TAK1組成復(fù)合物，該復(fù)合物能刺激RANKL并對(duì)OC分化起關(guān)鍵作用。阻擋TGF-β信號(hào)通路，卻未發(fā)現(xiàn)TRAF6-TAB1-TAK1復(fù)合物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Smad3的MH2區(qū)對(duì)于TRAF6-TAB1-TAK1 形成復(fù)合體是必要的?？梢?，TGF-β刺激激活Smad2或 Smad 3，Smad 2或 Smad3直接與TRAF6-TAB1-TAK1結(jié)合形成復(fù)合物，可促使RANKL誘導(dǎo)OC形成。

2.2.2在BMP通路中Smad蛋白與破骨細(xì)胞

在BMPs中，BMP-2與OC的形成有密切關(guān)系，并且BMP-2可刺激OC的骨吸收活動(dòng)。BMP-2 主要可以誘導(dǎo)CSF-1的表達(dá)促進(jìn)OC的形成，而專門介導(dǎo)BMP通路的Smad與CREB結(jié)合蛋白協(xié)同作用能增加CSF-1 的表達(dá)，CSF-1 的表達(dá)的上調(diào)能促進(jìn)OC的生成。而與OC形成和分化密切相關(guān)的RANKL，BMP-2在白細(xì)胞介素-1α的作用下可增加其表達(dá)以此來促進(jìn)OC的形成，并提高OC的存活率和促進(jìn)OC的分化。然而BMP-2自身并不具備使OC的存活率提高的作用。Yoshikawa[18]等發(fā)現(xiàn)在敲除Smad1的初代OB中BMP-2所誘導(dǎo)RANKL mRNA的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致OC的形成減少。

除了負(fù)責(zé)介導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路的Smad 2或 Smad 3和負(fù)責(zé)介導(dǎo)BMP通路的Smad 1和Smad 5被報(bào)道與OC的形成有關(guān)系外，Smad 4作為Co-Smad與因TGF-β/BMP刺激而磷酸化的R-Smads結(jié)合形成復(fù)合物參與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，也與OC的形成密切相關(guān)。Amy等[19]研究發(fā)現(xiàn)分別敲除Smad 1、4、5后，OC的骨吸收的活動(dòng)減弱，OC分化的標(biāo)記物表達(dá)減少，由此可見Smad 1、4、5的表達(dá)對(duì)于OC的分化是必要的。另外，Li 等[20]用敲除Smad7基因外顯子1的小鼠模擬Smad7部分功能缺失，與正常小鼠對(duì)照，左股骨干骺端的形態(tài)和長度沒有明顯差別，但骨量與骨小梁比對(duì)照組減少，在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)OC比對(duì)照組多。由此說明，Smad7部分功能缺失會(huì)抑制骨形成，促進(jìn)骨吸收。由此看出，Smad7似乎也與OC的形成有某種密切的關(guān)系。

3 Smad在骨質(zhì)疏松研究中的前景

綜上所述， OP的發(fā)病機(jī)制主要是由OB介導(dǎo)的骨形成與OC介導(dǎo)的骨吸收之間的骨穩(wěn)態(tài)失衡。而Smad在不同因素下通過TGF-β/BMP通路直接參與誘導(dǎo)OB與OC的生成、分化，在調(diào)節(jié)骨代謝方面作用顯著。然而目前對(duì)Smad的研究仍處于初級(jí)階段，對(duì)骨形成與骨吸收的研究主要還只是局限在動(dòng)物研究方面，較少直接對(duì)骨質(zhì)疏松患者進(jìn)行研究探討，對(duì)其精確的調(diào)節(jié)機(jī)制也未完全清楚，在TGF-β/BMP通路下參與調(diào)節(jié)的Smad都有促進(jìn)OB和OC形成的作用，究竟在其中哪些因素能誘導(dǎo)Smad促進(jìn)OB形成，哪些因素能誘導(dǎo)Smad促進(jìn)OC形成，現(xiàn)在也未完全清楚。今后仍需通過相關(guān)研究，探究Smad在骨形成和骨吸收方面發(fā)揮作用的具體機(jī)理和影響因素，如何促進(jìn)OB的形成而又避免促進(jìn)OC的形成，更是今后防治骨質(zhì)疏松癥的藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。