沈德利 郭喜順

（大連市第三人民醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116033）

甘草酸對大鼠空腸收縮作用的研究

沈德利 郭喜順

（大連市第三人民醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116033）

目的分析甘草酸對胃腸收縮的作用。方法制作大鼠離體空腸標(biāo)本，記錄不同濃度的甘草酸對大鼠離體空腸平滑肌正常收縮的影響。結(jié)果甘草酸劑量依賴性地促進(jìn)了大鼠離體空腸的平滑肌收縮；甘草酸對腸平滑肌的興奮作用可分別被 M 受體阻斷藥阿托品及鈣通道阻滯劑維拉帕米阻斷。討論甘草酸明顯促進(jìn)大鼠離體空腸平滑肌收縮作用，呈劑量依賴性；在4種不同低收縮狀態(tài)下，其興奮作用仍然存在。

甘草酸；空腸；平滑肌收縮

甘草酸是甘草中最重要的活性成分，有抗衰老、抗炎、抗過敏、降壓、增強(qiáng)免疫力、抑制癌細(xì)胞生長等作用[1-2]。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘草煎劑能增加大鼠胃底縱行肌和環(huán)行肌張力、胃體縱行肌張力和幽門環(huán)行肌運(yùn)動指數(shù)，具有促進(jìn)胃腸動力作用[3-4]。本研究考察了甘草酸對大鼠離體空腸收縮的調(diào)節(jié)作用并初步揭示其作用機(jī)制。見下文。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：①實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠，雄性，180～220 g，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。②主要儀器、設(shè)備。HM-3S型pH計(jì)：日本東亞電波工業(yè)株式會社產(chǎn)品；MA240D型電子分析天平：上海第二天平儀器廠產(chǎn)品；CJ-1磁力攪拌器：上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；漩渦混合器：江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品；PS-9型電泳儀：大連捷邁科技公司；UVP凝聚成像系統(tǒng)：英國UVP有限公司；FTC51F2D PCR儀：英國巴羅世界科技公司；HW-400S恒溫平滑肌槽，BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 離體小腸平滑肌條的制備：大鼠預(yù)先禁食48 h，但給水，脫頸處死大鼠，剖腹，取1.5～2 cm空腸，除去腸系膜，放于克氏液中備用。浴管內(nèi)克氏液保持恒溫37 ℃。L型管置于浴管內(nèi)。

1.2.2 標(biāo)本連接：將平滑肌置入裝有20 mL的37 ℃克氏液浴槽中，并通以95%O2和5% CO2，穩(wěn)定約50 min，開始記錄收縮曲線。

1.2.3 便秘模型建立：健康雌雄各半的SD大鼠正常飼養(yǎng)3 d后，剔除有異常反應(yīng)或體質(zhì)量有明顯差異的大鼠后，隨機(jī)分為正常對照組，便秘模型組，便秘模型給藥組，每組6只，單只單籠飼養(yǎng)，事先稱重。

1.2.4 Western blotting：在各實(shí)驗(yàn)組大鼠取血后，自幽門下10 cm處切取空腸8 cm，4 ℃克氏液洗凈，切成2 cm長的腸段，立即置于液氮中，然后-80 ℃保存待測?？偟鞍滋崛。悍Q量空腸組織，配裂解液，裂解液與組織按500 μL：100 mg混合，剪碎組織，勻漿，離心15000 r，15 min，取上清，測蛋白濃度，將所有樣品蛋白濃度均稀釋至最低濃度，按1∶1加上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存。電泳：配12%分離膠和5%濃縮膠，上樣，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可，停止電泳，取膠。轉(zhuǎn)膜：按濾紙（3層）-PVDF膜-膠-濾紙（3層）放入電轉(zhuǎn)槽，吸干電轉(zhuǎn)液，通電25 min。封閉。免疫反應(yīng)：將MLC、P-MLC、MLCK以及β-actin蛋白抗體分別配成1∶1000和1∶800的濃度，4 ℃孵育過夜，然后用TTBS室溫下脫色搖床洗3次，每次5 min。同上方法用稀釋二抗（1∶2000），室溫下孵育90 min，用TTBS室溫下，脫色搖床上洗3次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影，凝膠圖像分析：將發(fā)光底物工作液A和B等體積混合1 min后，將蛋白與此混合液充分避光接觸1 min，顯影，進(jìn)行圖像掃描分析。1.3 統(tǒng)計(jì)處理：用統(tǒng)計(jì)分析方法處理平滑肌收縮幅度變化。SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，t檢驗(yàn)，P＜0.05具有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常收縮狀態(tài)下甘草酸對大鼠空腸收縮作用：平滑肌收縮穩(wěn)定后，在浴槽中依次加入不同濃度的甘草酸，其終濃度分別為20、40、80 μmol/L。觀察并記錄5 min內(nèi)的收縮曲線，取均數(shù)后作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。甘草酸對大鼠空腸平滑肌的收縮活動有興奮作用，且與劑量呈正向關(guān)系。

2.2 甘草酸對空腸收縮作用的機(jī)制探討：鈣離子是平滑肌收縮的關(guān)鍵因子，M受體是興奮平滑肌的經(jīng)典受體，能夠促進(jìn)平滑肌的收縮。因此，在本實(shí)驗(yàn)中考察鈣離子，M受體與甘草酸所起興奮作用的關(guān)系。

平滑肌收縮穩(wěn)定后，分別向克氏液中加入1.0 μmol/L鈣通道阻滯劑維拉帕米（verapamil）及10.0 μmol/L M受體阻斷劑阿托品（atropine），然后依次加入不同濃度的甘草酸，其終濃度分別為20、40、80 μmol/L。觀察并記錄5 min內(nèi)的收縮曲線，取均數(shù)后作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。鈣通道和M受體被阻斷情況下甘草酸對大鼠空腸平滑肌的收縮活動有興奮作用，且與劑量呈正向關(guān)系。

2.3 甘草酸對肌球蛋白磷酸化的影響：模型大鼠小腸組織中肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）和肌球蛋白磷酸化水平均顯著低于正常對照組，甘草酸可以顯著增加MLCK的含量和肌球蛋白磷酸化水平。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，在20、40、80 μmol/L濃度條件下，甘草酸對空腸平滑肌收縮均可起到明顯的興奮作用，并且隨著濃度增大，興奮作用更加明顯。本結(jié)果提示，在20～80 μmol/L劑量范圍內(nèi)，甘草酸對空腸平滑肌收縮起到劑量依賴性的興奮作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證甘草酸的作用，本研究又探討了在低鈣、低鉀、腎上腺素、硝普鈉4種不同條件造成的平滑肌低收縮狀態(tài)下，甘草酸對空腸平滑肌收縮作用的影響。結(jié)果表明，在這4種條件造成的平滑肌低收縮情況下，甘草酸對空腸平滑肌收縮依然可起到明顯的興奮作用。提示，甘草酸對空腸平滑肌的收縮的興奮作用進(jìn)一步得到驗(yàn)證[5-6]。

本研究還研究了甘草酸對空腸平滑肌收縮所起到作用可能的機(jī)制。平滑肌收縮是在鈣離子參與下，肌球蛋白輕鏈激酶催化肌球蛋白輕鏈磷酸化實(shí)現(xiàn)的。胃腸道中存在的M受體能興奮平滑肌的收縮。本研究中分別應(yīng)用鈣通道阻斷劑維拉帕米和M受體阻斷劑阿托品來探討機(jī)制。結(jié)果表明，在克氏液中加入維拉帕米后，平滑肌收縮急劇下降，待收縮平衡后，再分別加入20、40、80 μmol/L的甘草酸，結(jié)果3個劑量的甘草酸對平滑肌收縮均不能起到興奮作用。這表明維拉帕米阻斷了甘草酸對平滑肌收縮的興奮作用，甘草酸對空腸平滑肌收縮的興奮作用是鈣依賴性的。在克氏液中加入M受體阻斷劑阿托品后，平滑肌收縮基本沒發(fā)生變化，待平滑肌收縮穩(wěn)定后，再分別向克氏液中加入20、40、80 μmol/L的甘草酸，結(jié)果這3個劑量的甘草酸對平滑肌收縮的興奮作用檢測不到了。表明阿托品阻斷了甘草酸對空腸平滑肌收縮的作用，即甘草酸對平滑肌收縮的興奮作用依賴于M受體的激活。

為進(jìn)一步研究甘草酸對空腸平滑肌收縮所起到的作用，我們考察了甘草酸對小腸組織中肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）含量及肌球蛋白磷酸化的影響。結(jié)果表明，便秘模型組小腸組織中MLCK含量及肌球蛋白磷酸化水平顯著低于正常對照組，加入甘草酸可以顯著恢復(fù)MLCK含量和肌球蛋白磷酸化水平。結(jié)果揭示了甘草酸是通過增強(qiáng)肌球蛋白磷酸化水平實(shí)現(xiàn)對平滑肌收縮的興奮作用。

簡而言之，本研究的結(jié)果提示，在20～80 μmol/L劑量范圍內(nèi)，甘草酸對空腸平滑肌收縮所起到顯著的興奮作用，這種興奮作用是鈣依賴性的，并依賴于M受體的激活，增強(qiáng)肌球蛋白磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。

[1] 周榮漢.中藥資源學(xué)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1993:299.

[2] 鄭虎占,董澤宏,余靖,等.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用[M].北京:學(xué)苑出版社,1997:1256-1279.

[3] 劉麗萍,任翠愛,趙宏艷.甘草酸的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(6):272-276.

[4] 齊敏.甘草酸藥理作用及機(jī)制的研究進(jìn)展[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,30(3):79-81.

[5] 徐立昌,鄭淑玲,張偉東,李魁興.甘草酸的藥理機(jī)制研究進(jìn)展[J].中外醫(yī)療,2009,28(26):174-175

[6] 鄒龍,王連平.正交試驗(yàn)法優(yōu)選護(hù)肝醒酒濃縮丸的醇提工藝[J].中南藥學(xué),2013,11(1):14-18.

R282.710.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1671-8194（2017）30-0023-02