孫玉霜，李 穎，李秀梅，楊 穎

（天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402）

食源性單增李斯特菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

孫玉霜，李 穎，李秀梅，楊 穎

（天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402）

單增李斯特菌是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的人獸共患病。目前單增李斯特菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)方法、酶聯(lián)免疫法、免疫膠體金技術(shù)、PCR檢測(cè)技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)、生物芯片技術(shù)等。本文對(duì)各方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、應(yīng)用情況及發(fā)展前景進(jìn)行了概述。

單增李斯特菌；檢測(cè)；進(jìn)展

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是李斯特菌屬中致病力最強(qiáng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種常見(jiàn)的食源性致病菌。由于其在細(xì)胞內(nèi)寄生，可穿越宿主的三道屏障，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的人獸共患病。有研究表明，LM在即食性食品中的污染率達(dá)31%。近年來(lái)，由此引發(fā)的食品中毒病例不斷增加。20世紀(jì)90年代世界衛(wèi)生組織（WHO）將其列為四大食源性致病菌之一。近年來(lái)，我國(guó)建立了全國(guó)食品污染物監(jiān)測(cè)網(wǎng)和食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)，重點(diǎn)監(jiān)測(cè)LM。國(guó)家食品安全法規(guī)定食物中不得檢出LM。由于LM的嚴(yán)重危害性，各國(guó)學(xué)者們也針對(duì)食品中LM的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了大量研究，以尋求快速、簡(jiǎn)單、高靈敏度的檢測(cè)方法。

1 傳統(tǒng)生物學(xué)分離培養(yǎng)與生化鑒定法

傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法是將通過(guò)分離培養(yǎng)后產(chǎn)生的可疑菌落進(jìn)行生化反應(yīng)、溶血實(shí)驗(yàn)、協(xié)同溶血實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、典型運(yùn)動(dòng)后，再進(jìn)行血清分開(kāi)，耗時(shí)長(zhǎng)，且工作量大。目前我國(guó)常用的是國(guó)標(biāo)法和顯色培養(yǎng)基診斷法。

1.1國(guó)標(biāo)法（EB法）

國(guó)標(biāo)法是我國(guó)國(guó)標(biāo)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB4789.30—2008）采用的方法。該方法一般需要5～14 d，在食品中檢出英諾克李斯特菌的幾率比LM高。但該方法容易造成假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)，且存在雜菌與LM肉眼難區(qū)分的缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2顯色培養(yǎng)基診斷法

該方法是利用酶與底物的相互作用產(chǎn)生顯色物質(zhì)或熒光物質(zhì)，將能與LM的毒力因子PI-PLC酶和β-D-葡萄糖苷酶反應(yīng)的一類(lèi)底物加入分離培養(yǎng)基中，使LM與其他菌落形成色差。該方法比EB法節(jié)省了時(shí)間、人力和原材料投入。

2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)方法主要是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性來(lái)進(jìn)行定性或定量分析，與傳統(tǒng)方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速、可同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。目前，該方法已成功用于食品中LM的檢驗(yàn)。

2.1酶聯(lián)免疫法（ELISA）

1987年，F(xiàn)aber等首次報(bào)道了針對(duì)LM鞭毛抗原的單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)。我國(guó)學(xué)者利用該方法進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明2～3 d內(nèi)從自然污染樣品中可檢出該細(xì)菌。1992年，Bhuria等利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備了一株能穩(wěn)定分泌抗單核細(xì)胞增生性李斯特菌的單克隆抗體的細(xì)胞株EM-7GI，以此抗體建立的夾心ELISA法能在20～24 h內(nèi)檢測(cè)出細(xì)菌8～10個(gè)/mL（g），并與其他種李斯特菌等無(wú)交叉免疫反應(yīng)，具有高度特異性。Kim等采用5株特異性單抗體建立了夾心 ELISA，將待檢樣品富集培養(yǎng)后檢測(cè)LM，實(shí)驗(yàn)表明該法在 LM和英諾克李斯特菌的檢測(cè)中具有較高的靈敏度和特異性，適合大量食品樣品的初篩檢驗(yàn)。

2.2膠體金免疫層析法（GIGC）

GIGC是在抗原抗體反中以膠體金作為免疫示蹤物的免疫標(biāo)記方法，在食品檢測(cè)中普遍應(yīng)用。羅立新等[1]利用檸檬酸鈉改良方法制備膠體金，檢測(cè)了冷凍豬肉、牛奶、冰淇淋以及不同稀釋度的LM標(biāo)準(zhǔn)樣品，靈敏度為87.5%，證明了該方法的可行性。謝士嘉等[2]建立的膠體金免疫層析技術(shù)快速定量檢測(cè)方法能在10 min內(nèi)完成定性和半定量檢測(cè)。劉美辰等[3]研制的雙抗夾心法免疫層析試紙條靈敏度可達(dá)1×10-6CFU/mL，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

3 核酸探針檢測(cè)技術(shù)

核酸探針檢測(cè)技術(shù)是以目標(biāo)菌的毒力基因?yàn)榘谢颍脡A基配對(duì)原理使互補(bǔ)的2條核酸單鏈雜交形成雙鏈，以鑒別待測(cè)樣品中目標(biāo)菌。Byron等[4]針對(duì)李斯特屬16S核糖體亞單元的特異序列設(shè)計(jì)了6個(gè)熒光標(biāo)記的肽核酸探針，與整個(gè)細(xì)胞進(jìn)行原位熒光雜交。續(xù)文彬[5]選擇LM同源性較高致病基因hlyA設(shè)計(jì)了21 bp大小的發(fā)光探針與目的核酸片段雜交，利用差分水解，水解速度緩慢的DNA-RNA雜交體探針在加入堿性H2O2后被發(fā)光儀檢測(cè)到，實(shí)驗(yàn)僅需30 min且具有高度特異性；利用該方法同時(shí)檢測(cè)100份雞肉樣品，其陽(yáng)性率為15%，與常規(guī)生化鑒定結(jié)果一致。張廣騰等[6]在玻碳電極表面修飾金納米顆粒，利用金-硫鍵固定巰基修飾的ssDNA探針，制備了電化學(xué)DNA生物傳感器。該方法靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、選擇性良好，可用于快速檢測(cè)。

4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法

美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在1985年發(fā)明了PCR。由于該技術(shù)具有高度特異性、敏感性、快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在檢測(cè)食品中LM等方面展現(xiàn)了巨大潛力。

4.1單重PCR

單重PCR利用LM具有特異性的毒力基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)該致病菌。Wieckouska等利用PCR擴(kuò)增編碼李斯特溶血素基因（hlyA）片段以檢測(cè)牛奶中的單增李斯特菌，檢測(cè)極限為50 CFU/L牛奶樣品。Almeida等以LM的inl基因?yàn)榘谢驍U(kuò)增得到760 bp特異性片段進(jìn)行檢測(cè)。單重PCR與上述其他方法比較，靈敏度較高，但由于前期需經(jīng)過(guò)增菌稀釋干擾成分，因此耗時(shí)2 d才能完成檢測(cè)。于豐宇等[7]針對(duì)LM的hlyA、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ和prfA 等基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明內(nèi)化素基因（inlA、inlB、inlC和inlJ）的缺失可能是導(dǎo)致菌株毒力降低的原因。

4.2套式PCR

設(shè)計(jì)2對(duì)PCR引物進(jìn)行2次擴(kuò)增，得到首次PCR引物擴(kuò)增片段后，將第2對(duì)引物（又稱(chēng)巢式引物）結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第2次擴(kuò)增片段短于第1次，降低了1次擴(kuò)增產(chǎn)生錯(cuò)誤片段的概率。馬保華等[8]根據(jù)LM的iap基因設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，建立的套式PCR能有效排除干擾成分，檢測(cè)限為10 CFU/mL，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可在7 h內(nèi)完成，適用于食品中LM的快速檢測(cè)。但由于該方法需進(jìn)行2次擴(kuò)增，檢測(cè)中在第1次擴(kuò)增結(jié)束后需打開(kāi)PCR管添加第2對(duì)引物，存在易污染的缺點(diǎn)。

4.3多重PCR

多重PCR檢測(cè)可以在1個(gè)反應(yīng)體系中添加多組PCR引物，同時(shí)擴(kuò)增某個(gè)病原菌的或多個(gè)病原菌的基因，提高了實(shí)驗(yàn)的特異性，降低了實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測(cè)。目前該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于許多食源性致病菌的檢測(cè)。李盛豐等[9]采用針對(duì)LM的毒力基因iap和prfA基因分別設(shè)計(jì)引物，利用單個(gè)PCR、套式PCR、多重PCR這3種方法檢測(cè)，結(jié)果表明多重PCR靈敏度為104CFU/mL，在特異性方面比其他2種PCR更具優(yōu)勢(shì)，而套式PCR在靈敏度方面存在顯著優(yōu)勢(shì)。

4.4實(shí)時(shí)熒光PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR在PCR定性基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便、高通量、靈敏性高、特異性高特點(diǎn)，且由于擴(kuò)增檢測(cè)體系封閉，交叉污染率低，又可分為探針類(lèi)和非探針類(lèi)。非探針類(lèi)具有操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)成本低優(yōu)點(diǎn)，僅需觀察實(shí)驗(yàn)中以溫度和熒光信號(hào)改變量建立的溶解曲線(xiàn)即可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。探針類(lèi)是在反應(yīng)體系中增加了特異性探針，特異性更高。Barbau-Piednoir等[10]建立的熒光PCR方法可對(duì)單增李斯特菌和李斯特菌屬其他菌種進(jìn)行定性實(shí)驗(yàn)，區(qū)分李斯特菌屬的不同菌種，檢測(cè)精確度高達(dá)98.08%。閆冰等[11]以LM毒力基因hlyA為靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針進(jìn)行對(duì)人工污染牛乳樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，經(jīng)1 h增菌，可檢出3×102CFU/mL，經(jīng)3 h增菌，活菌檢測(cè)限可達(dá)30 CFU/mL；經(jīng)6 h增菌，檢測(cè)限為17 CFU/mL，驗(yàn)證了該方法的高特異性。但該技術(shù)需要專(zhuān)門(mén)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，且對(duì)引物和探針要求較高，實(shí)驗(yàn)成本較一般PCR偏高，因此限制了RT-PCR在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

4.5免疫磁珠PCR

將磁性球用抗體或其他配體包被后產(chǎn)生特異性抗體獲取靶細(xì)胞，再將富集磁珠上的病原進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，不需要提取核酸，可直接從待檢樣品增菌培養(yǎng)物種富集目的菌排除其他雜菌，具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，因此其應(yīng)用與研究前景十分廣泛。李敏等[12]將免疫磁珠與雙重PCR相結(jié)合檢測(cè)LM，在保證靈敏度的前提下提高了檢測(cè)特異性，將假陽(yáng)性的可能性降至最低，為下一步篩選節(jié)省了人力、物力和時(shí)間。但由于該技術(shù)存在成本高、檢測(cè)抗原單等缺點(diǎn)，未能得到普及應(yīng)用。

除上述PCR檢測(cè)技術(shù)外，還有以PCR與ELISA技術(shù)相結(jié)合的PCR固相分析法。有研究者還將PCR-ELISA與多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相結(jié)合，檢測(cè)肉品和牛奶中的大腸桿菌，兼具了PCR、分子雜交、ELISA這3種方法的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、特異性高、設(shè)備要求低，因此PCR-ELISA也是今后檢測(cè)LM的發(fā)展趨勢(shì)。

5 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

5.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）

LAMP是2000年由Notomi等[13]開(kāi)發(fā)的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了4條特異性引物，利用特異置換DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。張亞爽[14]以LM的毒力基因hly為靶基因，選擇特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)計(jì)了LAMP反應(yīng)相比較，2種方法相比靈敏度分別為1.4×102CFU/mL和7.3×101CFU/mL，直接檢測(cè)雞肉中LM，檢出限分別為9.6×102CFU/g和8.9×101CFU/g，表明LAMP更快速、更靈敏。姜霞等[15]對(duì)不同培養(yǎng)濃度單增李斯特菌進(jìn)行LAMP與PCR比較，結(jié)果顯示其靈敏度比普通PCR高100倍，在人工污染肉中的檢出限為8.8×10-1CFU/m L，在1 h內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。由于其快速、特異、靈敏度高等顯著優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在我國(guó)食品致病菌檢測(cè)研究中得到廣泛應(yīng)用。

5.2核酸序列等溫?cái)U(kuò)增（NABSA）

NABSA是一種恒溫的體外核苷酸擴(kuò)增方法，又稱(chēng)自主序列復(fù)制。Blais等[16]針對(duì)mRNA建立了擴(kuò)增hlyA基因的NASBA方法，并用于奶制品和蛋制品的48 h增菌培養(yǎng)上清的檢測(cè)。據(jù)國(guó)外報(bào)道，該方法能檢測(cè)到100個(gè)目標(biāo)分子和LM對(duì)數(shù)期的40個(gè)細(xì)胞。另有研究采用NABSA，結(jié)果顯示增菌前靈敏度為500 CFU/反應(yīng)，增菌后可達(dá)0.2 CFU/g。以上都表明NABSA是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用前景十分廣泛。

6 全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，微生物檢測(cè)全面自動(dòng)化將逐漸取代平板、試管等傳統(tǒng)檢測(cè)方式，成為未來(lái)發(fā)展方向。目前，國(guó)外已有多種微生物檢測(cè)系統(tǒng)問(wèn)世。

6.1全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)

目前國(guó)內(nèi)外使用較多的全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)有API、ATB、VITEK和VIDAS等。其中API是手工操作系統(tǒng)，鑒定范圍廣泛，系統(tǒng)收錄了15個(gè)系列的600種微生物生理生化指標(biāo)，且數(shù)據(jù)庫(kù)仍在不斷更新。ATB是在API上建立起來(lái)的，省去了培養(yǎng)并手工接種至試紙條和肉眼判讀的操作，減少了人為誤差，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度。VITEK系統(tǒng)是新一代升級(jí)系統(tǒng)，在我國(guó)也得到廣泛應(yīng)用。李玉等[17]利用API與VITEK系統(tǒng)分別對(duì)20株沙門(mén)氏菌、40株單增李斯特菌、30株金黃色葡萄及30株蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明2個(gè)系統(tǒng)的符合率為100%。

6.2全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)（VIDS）

VIDS可以自動(dòng)化檢測(cè)幾乎所有的國(guó)際規(guī)定的致病菌。孫素霞等[18]采用VIDS和常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)148份凍肉樣品，結(jié)果VIDS法檢測(cè)陽(yáng)性樣品28份，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法陽(yáng)性16份，且16份均為VIDS檢測(cè)陽(yáng)性的樣品。表明VIDS法檢測(cè)凍肉LM靈敏度為100%，特異度為90.9%，且檢測(cè)周期大大減小。

6.3分子生物學(xué)致病檢測(cè)系統(tǒng)

由于分子生物學(xué)檢測(cè)方法的靈敏、快速、特異的顯著優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外各種新型分子生物學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不斷涌現(xiàn)。杜邦的BAX系統(tǒng)采用探針標(biāo)記PCR擴(kuò)增技術(shù)；美國(guó)Bio Control公司推出的全自動(dòng)致病菌磁珠富集和基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果更準(zhǔn)確、更靈敏。杜強(qiáng)等[19]利用全自動(dòng)微生物磁珠分選系統(tǒng)檢測(cè)400份自然樣品并與國(guó)標(biāo)法對(duì)比，結(jié)果顯示該系統(tǒng)簡(jiǎn)單易用、標(biāo)準(zhǔn)化程度高。還有在RT-PCR、rep-PCR、核糖體分型技術(shù)等基礎(chǔ)上建立起來(lái)的全自動(dòng)儀器，此類(lèi)系統(tǒng)都具有有分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，但由于研發(fā)多為國(guó)外公司，存在成本高、后期維護(hù)不及時(shí)等缺點(diǎn)，因此國(guó)內(nèi)推廣應(yīng)用較少。

7 生物芯片技術(shù)

該技術(shù)是從20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的，通過(guò)微陣列方式集成大量生物分子，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。目前許多學(xué)者已經(jīng)建立新型生物芯片技術(shù)，我國(guó)有學(xué)者采用基因芯片檢測(cè)多重PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，可同時(shí)檢測(cè)LM等10種常見(jiàn)致病菌。

8 電子鼻

目前電子鼻等方法在微生物檢測(cè)中也提供了有價(jià)值的分析手段。陳麗萍[20]等利用基于金屬氧化物傳感元件陣列的PEN3型電子鼻傳感器，對(duì)不同食源性致病菌代謝物的差異證明，該方法在低濃度下對(duì)不同致病菌有區(qū)分性。

8 結(jié)論

隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注，單核細(xì)胞增生李斯特菌作為重要的食源性微生物對(duì)人類(lèi)健康的潛在危害越來(lái)越受到重視，因此近年來(lái)檢測(cè)方法得到了很大發(fā)展。傳統(tǒng)方法雖然檢測(cè)效率較低，但作為細(xì)菌分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)，能夠?yàn)槲⑸飳W(xué)研究提供必須材料，因此目前無(wú)法被取代。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的方法，檢測(cè)時(shí)間較傳統(tǒng)方法大大縮短，且檢測(cè)成本較低，是我國(guó)目前使用較為廣泛的方法。而以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的方法，顯著提高了檢測(cè)方法的特異性和靈敏度，提高了檢測(cè)效率，檢測(cè)的同時(shí)可以得到致病菌耐藥性、遺傳性等信息，為流行病學(xué)調(diào)查和綜合防治提供了大量信息，但由于檢測(cè)環(huán)境和成本要求較高，因此應(yīng)用范圍受到了一定限制。另外，還有一些新興的檢測(cè)技術(shù)，如等溫?cái)U(kuò)增、生物芯片、檢測(cè)系統(tǒng)平臺(tái)以及多方法的聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)等，仍需要不斷驗(yàn)證評(píng)估后，才能被廣泛接受應(yīng)用。因此單核細(xì)胞增生性李斯特菌的檢測(cè)技術(shù)仍需要廣大技術(shù)人員不斷探索研究，從而為我國(guó)食品安全快速檢測(cè)提供技術(shù)保障。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Reseach Progress of Detection Technology for Listeria monocytogenes

Sun Yushuang，Li Ying，Li Xiumei，Yang Ying
（Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402）

Listeria monocytogenes is a common foodborne pathogenic，which can cause zoonosis. There are several main detection technology methods of Listeria monocytogenes，including ELISA，GIGC，PCR，isothermal amplif i cation，detection of microbiology automatic，microarray and so on. The theory，advantages and disadvantages，applications and prospect aboat the different methods were reviewed in this paper.

Listeria monocytogenes；diagnosis；progress.

S855.1

B

1005-944X（2017）08-0076-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.021

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2012AA101605）；天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目-食品生物危害物精準(zhǔn)檢測(cè)與控制技術(shù)研究（10ZCZDNC02800）