鄭錦輝，駱 翔，宋艷志，鄧意輝

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聚唾液酸衍生物/泊洛沙姆407混合膠束中多西他賽的含量測定

鄭錦輝，駱 翔，宋艷志，鄧意輝*

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016)

目的建立聚唾液酸衍生物P-G/泊洛沙姆407混合膠束中多西他賽含量的測定方法。方法采用溶劑法處理樣品，并用HPLC法測定混合膠束中多西他賽的含量。色譜柱為Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長為230 nm，流動相為乙腈-水（體積比55∶45），流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。結(jié)果體積分數(shù)為55%乙腈水溶液可完全破壞混合膠束且多西他賽回收率較高；空白膠束載體材料與多西他賽峰分離度良好，對多西他賽含量測定無干擾；多西他賽質(zhì)量濃度在0.98~117.60 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好，=0.999 8；日內(nèi)、日間精密度RSD均小于2.0%；低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品回收率均在95%~105%內(nèi)，平均回收率為98.4%，RSD小于2.0%。結(jié)論該方法可用于混合膠束中多西他賽的含量測定。

藥劑學(xué)；含量測定；高效液相色譜法；多西他賽；聚唾液酸衍生物；泊洛沙姆407

多西他賽（docetaxel，DTX）又稱多西紫杉醇（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），是由法國羅納普朗克·樂安公司開發(fā)的第二代紫杉烷類抗腫瘤藥[1]，其作用機制是通過與細胞內(nèi)的微管結(jié)合、穩(wěn)定并防止其解聚，將細胞阻滯于G2/M期，從而導(dǎo)致細胞凋亡。與第一代紫杉烷類藥物紫杉醇相比，其抗癌活性提高了1.3~12倍[2]，被認為是臨床應(yīng)用中最有效的化療藥[3]。目前，主要應(yīng)用于乳腺癌、非小細胞肺癌、胃癌、頭頸癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌以及前列腺癌等多種癌癥的治療[4]。

Fig. 1 Chemical structure of docetaxel

圖1多西他賽化學(xué)結(jié)構(gòu)式

由于DTX水溶性較差，目前上市制劑采用吐溫80對其增溶，但吐溫80易引起患者產(chǎn)生過敏、神經(jīng)毒性和腎毒性等不良反應(yīng)，因此有必要開發(fā)新的劑型[5]。

近年來，兩親性聚合物膠束以其獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)在難溶性藥物増溶及腫瘤藥物靶向遞送方面取得了顯著進展。聚合物膠束通常粒徑較小（一般10~100 nm），外殼具有柔韌性和親水性，能夠有效避免單核吞噬細胞系統(tǒng)的識別并借助實體瘤的高滲透長滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)達到被動靶向目的；另外，在聚合物膠束表面修飾唾液酸、甘露糖、葉酸等配體后，還可實現(xiàn)主動靶向功能[6-7]。

在膠束載體材料的選擇方面，泊洛沙姆（Poloxamer）系列因其具有無毒、無免疫原性、生物相容性好等特點，受到廣泛關(guān)注。泊洛沙姆由聚氧乙烯（poly (ethylene oxide)，PEO）-聚氧丙烯（poly (propylene oxide), O）-聚氧乙烯（PEO）三嵌段構(gòu)成，隨著親水EO（ethylene oxide，EO）鏈和疏水PO（propylene oxide，PO）鏈數(shù)目的不同，具有不同的親水親油平衡值（hydrophilic lipophilic balance，HLB）、臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）和油水分配系數(shù)[8]。常見的泊洛沙姆型號包括Kolliphor?F 68（P188）、F87（P237）、F108（P338）和F127（P407），其中P188和P407以其較低的毒性已被收載入《美國藥典》。與P188相比，P407的CMC值較低，更適用于膠束的制備[9-10]。

在靶向配基的選擇方面，唾液酸及其衍生物具有獨特的優(yōu)勢。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸（sialic acid，SA）修飾的脂質(zhì)體能夠靶向小鼠S180 腫瘤，50%的荷瘤小鼠被治愈，并且2個月內(nèi)不復(fù)發(fā)腫瘤[11]。但是由于該材料的親水性較弱，制劑粒徑較大，穩(wěn)定性較差，因此，本課題組希望利用親水性更好的聚唾液酸（polysialic acid，PSA）替代SA，首次合成了PSA兩親性衍生物（P-G），并將其修飾于P407膠束表面，以期同時實現(xiàn)腫瘤的被動和主動靶向功能。本文主要報道混合膠束樣品的處理方法和含量測定的方法，為制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（配有UV228紫外檢測器、P230高壓恒流泵，大連依利特分析儀器有限公司），HW-2000色譜數(shù)據(jù)處理工作站（大連依利特色譜有限公司），BS124s分析天平（德國Sartorius公司），Anke TDL80-2B臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），KQ5200B超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），F(xiàn)DU-110凍干機（日本東京理化器械股份有限公司），Hypersil BDS C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司）。

多西他賽（docetaxel，DTX，上海新先鋒藥業(yè)有限公司），泊洛沙姆407（Kolliphor? F 127，P 407，德國BASF公司），聚唾液酸衍生物（P-G，實驗室自制），無水乙醇（分析純，天津富宇精細化工有限公司），甲醇（色譜純，天津大茂化學(xué)試劑廠），乙睛（色譜純，美國Sigma公司），，-二甲基甲酰胺（DMF，分析純，天津博迪化工股份有限公司），二甲基亞砜（DMSO，分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠），試驗用水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 DTX混合膠束樣品處理方法的研究與確定

2.1.1 樣品處理溶劑的選擇

用乙腈、甲醇、DMSO、DMF、體積分數(shù)為55%的乙腈水溶液（流動相）作為破壞溶劑，分別考察溶解現(xiàn)象、色譜峰形及DTX的回收率。

對照溶液：精密稱取DTX原料藥適量，用流動相稀釋制成質(zhì)量濃度為192 mg·L-1的DTX溶液，作為對照溶液。

樣品溶液：精密稱取DTX混合膠束凍干內(nèi)容物適量，分別加入乙腈、甲醇、DMF、DMSO、體積分數(shù)為55%乙腈水溶液各1 mL，渦旋3 min，1×104r·min-1離心10 min。將所得到的上清液分別用流動相稀釋至質(zhì)量濃度為52、52、30、30和104 mg·L-1的DTX溶液，進樣檢測，結(jié)果見表1和圖2。

Table 1 DTX recoveries in different solvents

Ⅰ—DTX;Ⅱ—P-G; Ⅲ—DMSO; Ⅳ—DMF

結(jié)果表明：混合膠束在乙腈和甲醇溶液中出現(xiàn)白色絮狀不溶物，而在DMSO、DMF和體積分數(shù)55%乙腈水溶液中可形成均一透明溶液，圖2中峰形結(jié)果顯示3種溶劑中DTX峰形均較好；回收率結(jié)果表明，DTX除在甲醇中回收率較低外，在其他4種溶劑中回收率均大于95%，而在DMSO和體積分數(shù)55%乙腈水溶液中有相對更好的回收率。綜合考慮，選擇體積分數(shù)55%乙腈水溶液作為破壞溶劑。

2.1.2 溶劑比例的考察

對照溶液：精密稱取DTX原料藥適量，用流動相稀釋制成質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的DTX溶液，作為對照溶液。

樣品溶液：精密量取DTX混合膠束溶液適量，分別加入體積分數(shù)35%、45%、55%和75%乙腈水溶液各1 mL，渦旋3 min，1×104r·min-1離心10 min。所得到上清液分別用各溶劑稀釋至質(zhì)量濃度為99 mg·L-1的DTX溶液，進樣檢測，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，雖然DTX在體積分數(shù)35%乙腈水溶液中回收率略低，但在其余各濃度乙腈水溶液中回收率均大于95%，且4種溶劑中總RSD為2.8%，小于5%，表明乙腈濃度對DTX回收率影響不大。

Table 2 DTX recoveries in different concentrations of acetonitrile

2.1.3 樣品處理條件的考察

對照溶液：精密稱取DTX原料藥適量，用流動相稀釋制成質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的DTX溶液，作為對照溶液。

渦旋時間考察：精密稱取DTX混合膠束凍干品適量，加入流動相1 mL，分別渦旋1、3和5 min，再1×104r·min-1離心10 min。將所得到的上清液分別用流動相稀釋至質(zhì)量濃度約為0.1 g·L-1的DTX溶液，進樣檢測，結(jié)果見表3。

離心時間考察：精密稱取DTX混合膠束凍干品適量，加入流動相1 mL，渦旋3 min后，1×104r·min-1下分別離心10、15和20 min。將所得到的上清液分別用流動相稀釋至質(zhì)量濃度約為0.1 g·L-1的DTX溶液，進樣檢測，結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，DTX回收率隨渦旋時間的延長而增大，與離心時間增長無明顯趨勢。另外，僅渦旋時間為1 min時回收率小于95%，其他條件下回收率均大于95%。因此，選則渦旋3 min和1×104r·min-1離心10 min作為樣品的處理條件。

Table 3 DTX recoveries under different centrifugation conditions

2.2 混合膠束含量測定方法的建立

2.2.1 溶液配制

對照溶液：取DTX原料藥約10 mg，精密稱定。置于10 mL量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照儲備液。精密量取對照儲備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的DTX對照溶液。

供試溶液：取DTX混合膠束凍干品約61 mg，約含DTX 1 mg，精密稱定。加入體積分數(shù)55%乙腈水溶液1 mL使其溶解，渦旋3 min，1×104r·min-1離心10 min，取上清液作為供試儲備液。精密量取供試儲備液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得供試溶液。

物理混合溶液：按處方量稱取膠束載體材料及DTX，直接用體積分數(shù)55%乙腈水溶液溶解制成質(zhì)量濃度約為1 g·L-1的DTX溶液。精密量取上述溶液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得物理混合溶液。

空白溶液：精密稱取不含DTX的空白混合膠束60 mg，按供試溶液配制方法配制。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：體積分數(shù)55%乙腈水溶液；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm；進樣量：20 μL。

2.2.3 檢測波長的確定

按“2.2.1”條方法配制對照溶液。精密量取對照溶液1.2 mL，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋制成12 mg·L-1的溶液。取此溶液20 μL，在波長200~400 nm內(nèi)進行紫外掃描，DTX的最大吸收波長為230 nm。

2.2.4 專屬性試驗

按“2.2.1”條方法配制對照溶液、空白溶液、物理混合溶液。取流動相、對照溶液、空白溶液和物理混合溶液，按“2.2.2”條色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖3）?？瞻啄z束載體材料與DTX峰分離度為4.8，分離度良好，不干擾DTX的含量測定。

Ⅰ—Carrier materials in blank micelles ;Ⅱ—Docetaxel

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取DTX原料藥9.8 mg，置于10 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為DTX儲備液。分別精密移取DTX儲備液適量，用流動相稀釋或逐級稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.98、9.80、29.40、58.80、78.40、98.0和117.60 mg·L-1的DTX溶液，按“2.2.2”條色譜條件進樣檢測。以DTX峰面積（）對質(zhì)量濃度（）進行線性回歸，得回歸方程：=1.386 8×104- 2.760 9×103，=0.999 8。結(jié)果表明，DTX質(zhì)量濃度在0.98~117.60 mg·L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 檢測限與定量限的確定

量取“2.2.5”條下的DTX儲備液，用流動相逐級稀釋，至其所記錄的色譜圖中信號噪音比值（/）為3和10，分別為定量限和檢測限。經(jīng)計算，DTX的定量限和檢測限分別為19.6 ng和6.9 ng。

2.2.7 精密度試驗

日內(nèi)精密度：稱取DTX混合膠束凍干品適量，按“2.2.1”條方法分別配置對照溶液及6份供試溶液。按“2.2.2”條色譜條件，同日內(nèi)進樣檢測，外標法計算含量。結(jié)果顯示，6份樣品檢測平均含量為97.5%，RSD為0.4%，小于2.0%，表明該方法日內(nèi)精密度良好。

日間精密度：每日稱取DTX混合膠束凍干品適量，按“2.2.1”條方法分別配置對照溶液及供試溶液。按“2.2.2”色譜條件，連續(xù)進樣6 d，外標法計算含量。結(jié)果顯示，6次檢測平均含量為97.3%，RSD為1.0%，小于2.0%，表明該方法日間精密度良好。

2.2.8 回收率試驗

精密量取“2.2.1”條中對照溶液0.5、7.5和1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，再分別加入空白膠束溶液1.0 mL，用流動相稀釋至刻度，制成低（約50 mg·L-1）、中（約75 mg·L-1）和高（約100 mg·L-1）3種質(zhì)量濃度的DTX供試溶液，每個質(zhì)量濃度平行配制3份。按“2.2.2”條色譜條件對上述樣品進樣分析，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果見表4。高、中、低3種質(zhì)量濃度的樣品回收率均在95%~105%內(nèi)，平均回收率為98.4%，RSD為1.9%，小于2.0%，回收率符合要求。

Table 4 Recoveries of DTX

2.2.9 穩(wěn)定性試驗

稱取混合膠束適量，按“2.2.1”條方法配制供試溶液，室溫放置，分別于0、6、14、24和36 h進樣分析，記錄色譜圖，計算RSD。經(jīng)計算，峰面積的RSD為1.4%，小于2.0%，表明供試溶液在室溫條件下36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 DTX混合膠束含量測定

取3批DTX混合膠束凍干樣品，按“2.2.1”條方法配制對照溶液和3批混合膠束的供試溶液，分別進樣分析，記錄色譜圖，外標法計算含量。3批樣品的含量分別為100.0%、99.2%和97.3%。

3 討論

3.1 混合膠束供試品處理方法的選擇

由于DTX包裹入混合膠束的疏水內(nèi)核中，所以在含量測定前，需要對膠束進行破壞。根據(jù)載體材料和DTX的溶解特性，作者嘗試了乙腈、甲醇、DMSO、DMF和體積分數(shù)55%乙腈水溶液作為破壞溶劑。在5種溶劑中，乙腈和甲醇不能完全破壞膠束，溶液中出現(xiàn)白色絮狀不溶物；DMSO、DMF、體積分數(shù)55%乙腈水溶液可完全破壞膠束，溶液均一透明。但HPLC色譜圖顯示，DMSO和DMF處理的樣品，2 min左右出現(xiàn)較大溶劑峰（圖2），雖對DTX檢測無干擾，但樣品中DMSO、DMF溶劑濃度過大容易損傷色譜柱；而體積分數(shù)55%乙腈水溶液無溶劑峰，且DTX峰形較好，因此最終選擇體積分數(shù)55%乙腈水溶液作為破壞溶劑。

3.2 色譜條件的選擇

DTX含量測定方法的文獻雖有一些報道，其中納米制劑中DTX的含量測定方法[12-15]主要采用以有機相體積分數(shù)在65%~75%內(nèi)為流動相的HPLC法檢測，但本品在乙腈-水體積比為65∶35條件下檢測時發(fā)現(xiàn)，載體材料P-G 對DTX的檢測會產(chǎn)生干擾，故在此基礎(chǔ)上對流動相比例進行調(diào)整，當調(diào)整乙腈-水體積比為55∶45時，載體材料P-G對DTX檢測無干擾，且保留時間為5.3 min，檢測時間比較合理。

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(本篇責任編輯：趙桂芝)

Determination of docetaxel in mixed micelle of a polysialic acid derivative (P-G) and poloxamer 407

ZHENG Jinhui, LUO Xiang, SONG Yanzhi, DENG Yihui*

（）

ObjectiveTo establish a method for determination of the content of docetaxel in polysialic acid derivatives P-G and poloxamer 407 mixed micelles.Methods AHPLC method was applied to determinate the docetaxel loaded in micelles. The separation was achieved on the Hypersil BDS CB18Bcolumn (200 mm × 4.6 mm, 5 μm). The Mobile phase consisted of acetonitrile-water (∶= 55∶45) at a flow rate of 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was set at 230 nm. The column temperature was kept at 30℃.Results The micelles were dissolved in 55% acetonitrile to destroy the micellar structure and dissociate docetaxel from mixed micelles. Docetaxel and carrier materials of micelles could be well separated. A good linear relationship was achieved for docetaxel in the range of 0.98~117.60 mg·L-1,=0.999 8; the intra-day and inter-day precision RSD were less than 2.0%; The recoveries were between 95% and 105%. The average recovery was 98.4% and RSD less than 2.0%.ConclusionThis method can be used for the determination of docetaxel loaded in the mixed micelles.

pharmaceutics; mixed micelles; content determination; docetaxel; polysialic acid derivatives; poloxamer 407

（2016）03–0099–08

10.14146/j.cnki.cjp.2016.03.004

R94

A

2015-10-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(81373334)

鄭錦輝(1977-), 女(漢族), 遼寧盤錦人, 碩士研究生, E-mail zhengjinh@126.com;

鄧意輝(1964-), 男(漢族), 湖南花坦人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥物靶向新劑型的研究, Tel. 024-23986316, E-mail dds-666@163.com。