嚴(yán)忠雍, 顧蓓喬, 張小軍, 方 益, 李佩佩, 龍 舉, 高學(xué)慧

(1浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021；3 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316021)

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間接酶聯(lián)免疫吸附測定河豚魚中河豚毒素*

嚴(yán)忠雍1,2, 顧蓓喬1,2, 張小軍1,2, 方 益1,2, 李佩佩1,2, 龍 舉1,2, 高學(xué)慧3

(1浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2 浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021；3 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316021)

為有效確保食用河豚魚的安全性，進(jìn)一步監(jiān)測河豚魚中河豚毒素，本方法應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附測定河豚魚中河豚毒素的含量，評估河豚魚的安全風(fēng)險(xiǎn)程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，間接酶聯(lián)免疫吸附法測定河豚毒素靈敏度高，方法的在線性范圍為2～135 μg/L內(nèi)有良好的線性關(guān)系，且方法的回收率達(dá)到82.4%～92.5%，檢出限能達(dá)到2 μg/kg。本方法快速、簡單，完全滿足實(shí)際工作的需要。

間接酶聯(lián)免疫吸附；河豚魚；河豚毒素

河豚毒素(TTX)是一種天然海洋生物神經(jīng)毒素，分布廣泛，主要存在于河豚魚中，在蟾蜍、藍(lán)環(huán)章魚、螺類等其他動(dòng)物體內(nèi)也有存在。河豚毒素毒性極強(qiáng)，食用0.5 mg就可致人死亡，河豚毒素可通過對細(xì)胞納離子通道的阻斷作用而抑制神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，使感覺神經(jīng)麻痹，四肢癱瘓，呼吸困難，最后因呼吸抑制而死亡[1-3]。因此每年都有因食河豚魚而導(dǎo)致中毒的事件發(fā)生。鑒于河豚中毒的嚴(yán)重危害，我國嚴(yán)禁河豚鮮售鮮食。但由于人們嗜食習(xí)慣和河豚的昂貴的價(jià)格，我國鮮河豚非法制售活動(dòng)屢禁不止。因此建立快速、有效的檢測和控制河豚毒素的方法顯得非常必要。

目前，河豚毒素的檢測方法有生物測定法、高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法及免疫化學(xué)測定法等[4]。其中生物測定法[5-7]一般需要專門動(dòng)物，適用性差，且操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力重復(fù)性差；物理化學(xué)檢測法[8-10]雖靈敏度較高，但檢測成本高，儀器昂貴且檢測周期長。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法[11]靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測成本低，其中國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.206-2007《鮮河豚魚中河豚毒素的測定酶聯(lián)免疫》[12]是目前我國檢測河豚魚中河豚毒素時(shí)普遍使用的方法。但是該方法前處理非常復(fù)雜，且酶聯(lián)免疫反應(yīng)耗時(shí)長，操作難度較大。因此，有必要建立一種快速、高效、簡便、靈敏的檢測方法。本研究建立一種以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測方法，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高快速、操作簡便、經(jīng)濟(jì)快捷的特點(diǎn)，滿足河豚毒素快速篩檢的需要，適合實(shí)際檢測工作。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

MK3微孔板酶標(biāo)儀，美國Thermo Labsystems公司；MS2漩渦混合器，德國IKA公司；Centrifuge5810高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；T18勻漿機(jī)，德國IKA公司；恒溫孵育箱，上海一恒科技有限公司；純度≥98%的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr公司；河豚毒素試劑盒，購自江蘇美正生物有限公司。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。

1.2 溶液系統(tǒng)

TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液：將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.2 mol/L pH：4.0乙酸鹽緩沖液中，配制成濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃避光保存，保存期為6個(gè)月。

1.3 樣品采集與制備

1.3.1 樣品采集

于我國東南沿海11月間野捕河豚魚，采集后低溫冷藏處理，保存在冷凍狀態(tài)中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 樣品制備

對冷藏樣品解凍后，用蒸餾水清洗魚體表面污物，濾紙吸干，將魚分解成肌肉、肝臟、卵巢(雄性為精囊)等部分，各部分組織分別用蒸餾水洗去血污，濾紙吸干水分后充分均質(zhì)稱重。

1.4 樣品提取

稱取上述均質(zhì)樣品(1.00±0.02)g于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入樣品提取液1 mL，渦旋振蕩3 min，4000 r/min離心10 min，取50 μL供分析。

1.5 樣品測定

將試劑盒回溫至室溫，加樣品50 μL每孔到微孔中，加河豚毒素抗體試劑每孔50 μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置孵育箱25 ℃避光反應(yīng)30 min。揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗板液250 μL每孔到微孔中。充分洗滌4次(每次間隔10 s)后，加河豚毒素酶標(biāo)物溶液100 μL每孔到微孔中，用蓋板膜蓋板25 ℃避光反應(yīng)30 min，洗滌4次。加入底物液A每孔50 μL,再加入底物液B每孔50 μL，用蓋板膜蓋板置孵育箱25 ℃避光反應(yīng)15 min。加入終止液50 μL每孔到微孔中，于雙波長450/630 nm測定吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍及檢出限

用TTX毒素儲備液分別配制濃度為2，5，15，45，135 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用間接ELISA法測定制作校準(zhǔn)曲線，如圖1所示。該方法的線性范圍為2～135 μg/L，對TTX的最低檢出限為2 μg/L。

圖1 TTX標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 加標(biāo)回收與精密度

在1.00 g陰性河豚魚肉中添加10、40、70、100 μg/kg的TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平平行測定3次，計(jì)算其回收率和精密度，見表1。結(jié)果表明，方法在10～100 μg/kg之間的添加水平的回收率為82.4%～92.5%，完全符合TTX的檢測要求。

表1 TTX的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

注：n=3。

2.3 ELISA檢測方法與液相串聯(lián)質(zhì)譜法的比較

用本方法和液相串聯(lián)質(zhì)譜法(采用文獻(xiàn)報(bào)道[13]方法)對6份河豚魚肉樣品分別進(jìn)行TTX檢測，并比對兩種方法的檢測結(jié)果，結(jié)果如表2所示。由表2可知，兩種檢測方法的測定結(jié)果基本符合，并無明顯差異，表明本方法的靈敏度和準(zhǔn)確度完全滿足TTX的檢測要求。

表2 ELISA法與液質(zhì)聯(lián)用法的檢測結(jié)果

*ND為未檢出。

2.4 實(shí)際樣品測定

用本方法對我國東南沿海野捕的10河豚魚樣品進(jìn)行檢測，檢測發(fā)現(xiàn)6個(gè)陽性樣品。6個(gè)陽性樣品對應(yīng)的TTX濃度分別為8.92、20.31、82.56、15.84、25.27和37.72 μg/kg，表明野生河豚魚多數(shù)帶毒。因此，有必要對河豚魚進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測和嚴(yán)格控制。

3 結(jié) 論

本方法在原有的檢測標(biāo)準(zhǔn)上進(jìn)行條件優(yōu)化，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短檢測時(shí)間，提高工作效率。本方法的靈敏度和準(zhǔn)確度完全滿足日常TTX的檢測需要，適宜推廣于實(shí)際工作使用。

[1] 計(jì)融,王健偉,羅雪云,等.河豚魚類中河豚毒素直接競爭抑制性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定方法的研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2005,14(5):7-10.

[2] 李世平,焦新安,黃金林,等.河豚毒素兩種定量檢測方法的比較研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,25(2):58-60.

[3] 紀(jì)元,劉巖,宮慶禮.小鼠生物法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)定量監(jiān)測沿海5省養(yǎng)殖河豚魚中的河豚毒素(TTX)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2010,34(4):589-597.

[4] 周曉翠,謝光洪,劉國文,等.河豚毒素檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2008,35(7):43-45.

[5] 張理,謝克勤,趙金山,等.用昆明小鼠定量測試河豚毒素的研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2004,16(6):497-500.

[6] 段發(fā)淼,謝心磊,朱寶平.用小鼠單位法檢測河豚毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2000,10(4):463-464.

[7] 林蔚,林健,黃宗銹.用ICR小鼠生物法測定烤魚片河豚毒素的研究[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2008,14(4):49-50.

[8] 陳唯真,朱偉華,俞如英.HPLC法測定河豚毒素的含量及穩(wěn)定性[J].藥物分析雜志,2004,24(1):41-43.

[9] Margaret A O’leary, Jennifer J Schneider, Geoffrey K Isbister. Use of high performance liquid chromatography to measure tetrodotoxin in serum and urine of poisoned patitents[J].Toxicon,2004(44):549-553.

[10]張虹,柳正良,黃蓓琳,等.反向離子對-高效液相色譜法測定河豚毒素[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2001,18(3):197-198.

[11]宮慧芝,計(jì)融,江濤,等.河豚毒素單抗ELISA檢測試劑盒的研制[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(12):1423-1424.

[12]國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.206-2007鮮河豚魚中河豚毒素的測定酶聯(lián)免疫[S].2007.

[13]李愛峰,于仁成,周名江.液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析河豚毒素[J].分析化學(xué),2007,35(3):397-400.

Determination of Tetrodotoxin in Puffer by Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay*

YANZhong-yong1,2,GUBei-qiao1，2,ZHANGXiao-jun1，2,FANGYi1,2,LIPei-pei1,2,LONGJu1,2,GAOXue-hui3

(1 Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhejiang Zhoushan 316021; 2 Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Zhejiang Zhoushan 316021; 3 Zhejiang Ocean University,Zhejiang Zhoushan 316021, China)

An indirect ELISA method was developed to monitor tetrodotoxin in puffer and assess the security risk level of the puffer. The indirect ELISA method ensured the safety of puffer fish consumption and monitoring of tetrodotoxin in puffer fish. The indirect ELISA method was sensitive, the quantification limit of the method was 2 μg/kg with satisfactory sensitive. The recovery of tetrodotoxin was 82.4%～92.5% in the range of 2～135 μg/L. The method was rapid and simple, met the needs of practical work.

indirect enzyme-linked immunosorbent assay; puffer; tetrodotoxin

浙江省科研院所公共科技服務(wù)項(xiàng)目(2016F30020)；舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C31011)。

嚴(yán)忠雍(1990-)，男，助理工程師，學(xué)士，主要從事漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測和水產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。

O656.31

B

1001-9677(2016)023-0098-03