盧冠男 孫 宏

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013)

突變特異性免疫組織化學(xué)法檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變

盧冠男 孫 宏

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132013)

目的探討應(yīng)用突變特異性免疫組織化學(xué)(IHC)法檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中表皮生長因子受體(EGFR)基因突變的臨床使用價值。方法隨機(jī)選取94例NSCLC患者，采用突變特異性IHC法和羅氏454下一代測序系統(tǒng)法進(jìn)行檢測EGFR基因突變狀態(tài)，比較兩種方法的特異性和靈敏度。結(jié)果EGFR基因突變陽性定位在腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜或細(xì)胞膜中。突變特異性IHC法檢測NSCLC患者中EGFR基因突變陽性率為36.17%，其中腺癌的突變率為48.44%，鱗癌的突變率為10.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05),羅氏454下一代測序系統(tǒng)法檢測NSCLC患者中EGFR基因突變陽性率為38.30%，其中腺癌的突變率為51.56%，鱗癌的突變率為10.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。突變特異性IHC法能夠有效檢測NSCLC EGFR基因突變，其結(jié)果與羅氏454下一代測序系統(tǒng)法具有極好的一致性(Plt;0.001)。結(jié)論突變特異性IHC法能夠有效檢測NSCLC EGFR基因突變,并且突變特異性IHC法能夠與EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)治療快速的反應(yīng)，具有耗時短、易判讀、檢測費(fèi)用少等特點(diǎn)。

免疫組織化學(xué)法；非小細(xì)胞肺癌；表皮生長因子受體基因；突變

治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的方法主要是靶向治療與化療，表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是主要的治療晚期NSCLC的靶向藥物〔1〕。研究表明，EGFR基因突變狀態(tài)是決定TKIs療效最重要的預(yù)測因子〔2〕。EGFR基因的突變主要發(fā)生在外顯子18～21點(diǎn)上，其中外顯子19的缺失突變(E746-A750)與外顯子21點(diǎn)上的突變(L858R)所占的比例最大。目前，針對檢測EGFR基因突變的方法有擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)、直接測序法、液相芯片法、數(shù)字PCR法等。羅氏454法是下一代測序法的代表性方法，它是一種高通量的測序方法，在臨床中被廣泛使用。本實驗對患者同時采用突變特異性免疫組織化學(xué)(IHC)法和羅氏454下一代測序系統(tǒng)法進(jìn)行檢測EGFR基因突變狀態(tài)，比較這兩種方法的特異性和靈敏度。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取吉林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自2015年2月至2016年12月確診的94例NSCLC患者，其中手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本64例，纖維支氣管鏡、淋巴結(jié)穿刺、經(jīng)皮肺穿刺等取得的活檢標(biāo)本30例。標(biāo)本均由病理科醫(yī)生鑒定腫瘤存在，并用4%的甲醛溶液固定，石蠟包埋組織。男53例，女41例，腺癌62例，鱗癌32例，年齡34～73(中位56)歲?；颊呔橥?。

1.2突變特異性免疫組織化學(xué)法檢測EGFR突變蛋白的表達(dá) 采用Labvision一步法二抗檢測系統(tǒng)對EGFR突變蛋白表達(dá)的情況進(jìn)行檢測。由具有豐富經(jīng)驗的專家，采用雙盲法對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。

1.3DNA提取、PCR擴(kuò)增和EGFR突變檢測 按照codas DNA試劑盒的說明對樣本進(jìn)行制備，分光光度計對提取并重懸后DNA的含量進(jìn)行測定，調(diào)整至所需濃度后加入到擴(kuò)增的混合物中，EGFR基因外顯子18、19、20、21由PCR擴(kuò)增，并應(yīng)用羅氏測序系統(tǒng)檢對EGFR突變情況進(jìn)行檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

突變特異性IHC法測得NSCLC患者，EGFR基因突變陽性率為36.17%(34/94)，其腺癌中為48.44%(31/64，E746-A750 15例，L858R 16例)，鱗癌中為10.00%(3/30，L858R 3例)，兩者相比差異顯著(Plt;0.05)。羅氏454 NGS系統(tǒng)法測得NSCLC患者EGFR基因突變陽性率為38.30%(36/94)，其腺癌中為51.56%(33/64，E746-A750 16例，L858R 17例)，鱗癌中為10.00%(3/30，L858R 3例)，兩者差異顯著(Plt;0.05)。突變特異性IHC測得NSCLC患者中突變陽性的1例羅氏454 NGS系統(tǒng)顯示為陰性，3例羅氏454 NGS系統(tǒng)測得為陽性的病例，突變特異性IHC檢測為陰性。兩者具有極好的一致性。

3 討 論

EGFR主要通過基因擴(kuò)增、基因突變活化、蛋白質(zhì)過表達(dá)等機(jī)制來誘導(dǎo)癌變。研究表明，腫瘤患者是否對EGFR-TKI敏感的強(qiáng)預(yù)測因子是EGFR突變，由此可見，檢測EGFR突變是醫(yī)生給予腫瘤藥物的重要指標(biāo)〔3〕。檢測基因突變最直接的方法是直接測序法，目前臨床上常采用這種方法，其優(yōu)點(diǎn)是直觀準(zhǔn)確，它不僅能檢測到突變還能夠定位突變位置。但是直接測序法存在著很大的不足，比如費(fèi)用高、時間長、操作過程復(fù)雜等〔4〕。近年來，隨著高通量測序(NGS)技術(shù)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的測序法受到了巨大的挑戰(zhàn)，這種高通量測序技術(shù)的代表是羅氏454下一代測序系統(tǒng)法。454測序儀相對Sanger測和Solid測序具有價格適中和提供中等讀長的優(yōu)點(diǎn)。近年來國內(nèi)外也有數(shù)篇關(guān)于IHC法檢測E746-A750缺失突變及L858R突變的報道，但靈敏度波動范圍較大，基于這種現(xiàn)狀，急需一種能夠可靠、容易、快速檢測EGFR基因突變的方法，提高其檢測的靈敏度，從而為臨床使用EGFR-TKI提供依據(jù)〔5,6〕。目前，國外有文獻(xiàn)報道，采用突變特異性IHC法檢測NSCLC EGFR基因突變，其靈敏度同羅氏454NGS系統(tǒng)具有較好的一致性，但國內(nèi)的報道較少〔7〕。本實驗結(jié)果提示，突變特異性IHC法具有經(jīng)濟(jì)、簡便、快速、易于推廣等優(yōu)勢，與羅氏454測序具有較好的一致性。

1成志強(qiáng),王曉玫,賀黎升,等.應(yīng)用特異性突變抗體檢測人非小細(xì)胞肺癌組織中EG-FR突變〔J〕.臨床與實驗病理學(xué)雜志,2014;30(5):531-4.

2陳順平,蘇海燕,吳文喬,等.非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與擴(kuò)增及蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析〔J〕.臨床與實驗病理學(xué)雜志,2015；31(6):657-61.

3韓義明,鄭 杰,姜云惠,等.非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變與ERCC1、Ki-67表達(dá)及臨床病理特征的關(guān)系〔J〕.臨床與實驗病理學(xué)雜志,2015；31(7):759-63.

4竇亞玲,祁曉莉,辛 論,等.TaqMan-擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法檢測非小細(xì)胞肺癌組織EGFR基因突變的價值〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志,2013;93(10):768-71.

5趙 靜,趙金銀,趙 肖,等.ARMS技術(shù)聯(lián)合Taqman探針檢測100例非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變〔J〕.中國肺癌雜志,2013;16(1):25-32.

6韓志剛,俞婷婷,申紅麗,等.非小細(xì)胞肺癌中Napsin-A表達(dá)與EGFR基因的相關(guān)性研究〔J〕.實用臨床醫(yī)藥雜志,2014;18(13):1-3.

7王理揚(yáng),黃媚娟,李 倫,等.非小細(xì)胞肺癌組織化療前后表皮生長因子受體基因的突變〔J〕.腫瘤,2011;31(6):517-21.

〔2017-09-17修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R563.9

A

1005-9202(2017)22-5636-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.069

孫 宏(1964-)，女，主任醫(yī)師，主要從事COPD矽肺、肺癌研究。

盧冠男(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事COPD睡眠呼吸病學(xué)研究。