趙 娜 ， 黃一鳴, ， 潘晶晶, ， 雍 慧, ， 曹福源 ， 張艷淑 ， 姚 林, ， 李 爽

(1.華北理工大學(xué)實驗動物中心 ， 河北 唐山 063000； 2.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 ， 河北 唐山 063000)

小鼠諾如病毒(murinenorovirus，MNV)是一種引起免疫缺陷小鼠腦炎、腦膜炎、肝炎、腸炎和肺炎的傳染性病原，與人類諾如病毒密切相關(guān)[1]。2003年該病毒從轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT-1)以及重組體激活基因2(RAG-2)缺陷(RAG-2-/-/STAT-1-/-)小鼠中被首次發(fā)現(xiàn)[2]，之后美國、加拿大、日本等國的實驗小鼠體內(nèi)均監(jiān)測到該病毒，并發(fā)現(xiàn)MNV是感染實驗動物的重要病原體，幾乎所有的實驗小鼠對此病毒易感[3]。MNV能通過接種細胞進行培養(yǎng)，彌補了人類諾如病毒不能通過細胞培養(yǎng)方式增殖的缺憾，可用于模擬人類諾如病毒的感染和復(fù)制機制[4]。本文對MNV的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷學(xué)方法等進行綜述，為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 病毒學(xué)特征

諾如病毒(Norovirus，NoV)屬杯狀病毒科(Calicivirus)，諾如病毒屬，無囊膜，二十面體對稱，核酸為單鏈正股RNA，是導(dǎo)致急性胃腸炎暴發(fā)的重要病原體之一。據(jù)報道MNV是目前首個能夠在細胞復(fù)制的諾如病毒，可在小鼠巨噬細胞和樹突狀細胞體外感染和復(fù)制[5]。

諾如病毒基因全長約7.3～7.8 kbp，含3個穩(wěn)定的鏈環(huán)結(jié)構(gòu)，具有5′端連接蛋白和3′端poly(A)尾巴。研究表明：3′端poly(A)對于RNA合成是非必需的。MNV基因組包含有3個開放閱讀框架(open reading frames，ORFs)，命名為ORF1、ORF2和ORF3[6]。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括2C螺旋酶、3C蛋白酶和3D聚合酶基序。ORF2和ORF3則分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白VP1和堿性蛋白VP2，其中VP1基因是諾如病毒屬成員基因分型的依據(jù)。MNV各ORF間有部分基因重疊，但不同病毒株的ORF1和ORF2重疊基因的堿基個數(shù)存在差異[7]。此外，Thackray發(fā)現(xiàn)在MNVORF2中存在ORF4，但不在同一閱讀框[8]。

MNV ORF1編碼的氨基酸序列比ORF2更加保守。這是因為ORF1編碼的聚合酶蛋白發(fā)生突變更有可能產(chǎn)生對病毒本身有害的無功能蛋白，而ORF2編碼的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生有害突變的可能性小，并且可能作為逃避宿主免疫監(jiān)視的一種方式[9]。衣殼蛋白VP1內(nèi)部S區(qū)形成二十面體殼，P區(qū)形成衣殼蛋白的突出部分，因此S區(qū)更加保守，而P區(qū)作為主要抗原位點比S區(qū)更加暴露于宿主免疫系統(tǒng)的選擇性壓力之下[10]。Bailey等發(fā)現(xiàn)部分毒株在VP1的第296位點發(fā)生了谷氨酸的突變，推測該突變是適應(yīng)細胞培養(yǎng)環(huán)境的結(jié)果。而原始株MNV1的賴氨酸殘基是免疫功能不全宿主在特定的選擇壓力下的結(jié)果[11]。

2 流行病學(xué)

MNV在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。Rodrigues等[12]對巴西地區(qū)的359只小鼠進行RT-PCR檢測，MNV的感染率為38.16%。Mumphrey等[13]用血清學(xué)的方法檢測美國和加拿大地區(qū)實驗小鼠諾如病毒感染率約為22.1%，是細小病毒感染率的9倍。對歐洲地區(qū)實驗小鼠MNV感染情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)MNV感染率高達58%～64%[14]。2012年，日本報道野生嚙齒類動物中MNV感染率為14.9%[15]。在我國，袁文等用熒光定量RT-PCR的方法檢測344份小鼠盲腸內(nèi)容物，陽性率29.94%[16]。馬暢等[17]對江蘇地區(qū)MNV的感染情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，抽檢的實驗小鼠MNV感染率為13.3%,考慮MNV可能在同一設(shè)施內(nèi)傳播。MNV已成為目前實驗小鼠感染率較高的一種病毒。

3 臨床癥狀

對于不同的免疫缺陷動物，感染諾如病毒后癥狀有一定的差異。先天性免疫系統(tǒng)應(yīng)答因子缺陷的小鼠，如STAT-1-/-小鼠、I型和II型干擾素受體同時缺陷(IFNαβ R-/-/IFNγR-/-)小鼠發(fā)生致死性感染，表現(xiàn)為體重減輕、豎毛和拱背等臨床癥狀，但RAG-1-/-/RAG-2-/-小鼠感染MNV后仍能存活，在持續(xù)感染后90天仍能檢測到病毒存在[18]，表明在某些免疫缺陷動物體內(nèi)MNV能夠持續(xù)感染。

免疫活性小鼠和大多數(shù)免疫缺陷小鼠感染MNV后不表現(xiàn)臨床癥狀和病理變化，但該病毒疑似能夠改變實驗小鼠的表型，主要是引起炎癥和免疫反應(yīng)。動物諾如病毒很少引起嚴重的臨床癥狀，只有鼠類諾如病毒會引起宿主體內(nèi)發(fā)生嚴重的組織病理性損傷。在免疫功能不全的動物中諾如病毒常引發(fā)嚴重的臨床癥狀，如可使新生犢牛的腸胃炎癥狀加重或復(fù)雜化。

4 病理變化

MNV能夠引起RAG-2-/-/STAT-1-/-小鼠死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為腦炎、腦血管炎、肺炎和肝炎等。試驗鼠接種病毒5周后，其脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和空腸中能檢測到MNV-Ⅰ型的RNA不同基因品系的免疫缺陷的小鼠感染MNV-Ⅰ型后出現(xiàn)全身性感染以及不同組織(肺、肝、腹膜和胸膜腔)的炎性癥狀[13]。免疫機能健全的小鼠感染MNV-Ⅰ型后僅表現(xiàn)一定程度的組織病理變化。因此，可以認為該病僅發(fā)生于先天性免疫系統(tǒng)缺乏的小鼠中。而在北美地區(qū)分離到的新型MNV(Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型)與Ⅰ型毒株在致病性上存在一定差異，將這3種MNV毒株和MNV-Ⅰ型毒株對免疫功能正常的小鼠進行人工感染試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MNV-Ⅰ型毒株的感染過程短暫，新發(fā)現(xiàn)的3種毒株感染后小鼠排毒期長，而且呈現(xiàn)慢性組織感染[19]。由此可以推斷其他的人類諾如病毒毒株或動物諾如病毒毒株同樣會引起這些類似癥狀，從而可能導(dǎo)致病毒傳播和疾病暴發(fā)。

5 診斷

目前MNV的診斷方法主要為分子生物學(xué)方法和血清學(xué)方法。

RT-PCR已廣泛應(yīng)用于諾如病毒的檢測，成為諾如病毒診斷的金標準，其敏感性及特異性均較好。但由于杯狀病毒科基因組高度變異性，學(xué)者選擇多種不同引物對MNV進行檢測。基于小鼠諾如病毒與人類諾如病毒序列的分析，保守性的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列常作為檢測的目的片段。隨著MNV全基因組序列的測定和分析，MNV的5′端和ORF1-ORF2連接位置存在的32 bp和64 bp的保守序列，ORF4和3′非編碼區(qū)間47 bp和73～83 bp的保守序列，為PCR診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。Kitajima等建立了適合于本地區(qū)MNV檢測的巢式RT-PCR，比常規(guī)的PCR敏感性更高，而建立的熒光定量RT-PCR方法將病毒檢測定量化[20]。袁文等建立了一種結(jié)合內(nèi)標的熒光定量RT-PCR方法，其檢測靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10倍，比病毒分離高100倍，能有效地監(jiān)控假陰性的出現(xiàn)，適合用于MNV日常監(jiān)測、臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查[16]。高潔等[21]成功建立MNV實時熒光定量PCR檢測方法，并對北京地區(qū)實驗小鼠MNV感染情況進行調(diào)查，結(jié)果顯示陽性率為39.3%。

血清學(xué)方法主要為ELISA方法。Xiang等[22]利用表達的重組蛋白VP1建立ELISA方法具有較好的特異性和敏感性，對中國的600份小鼠血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，MNV陽性率為11.67%，其中商品化實驗小鼠陽性率(30.97%)遠高于非商業(yè)化銷售小鼠。

6 預(yù)防和控制

設(shè)施消毒是預(yù)防MNV在實驗動物飼養(yǎng)和研究設(shè)施中傳播的重要環(huán)節(jié)。MNV在常溫下尤其是在潮濕的糞便中十分穩(wěn)定，但利用巴氏消毒法(63 ℃～72 ℃)幾秒鐘病毒即可被滅活[23]。電離(紫外線)和非電離(伽瑪射線)照射同樣可滅活病毒[24]。400 MPa高壓處理5 min可使MNV活力降至無檢出水平。與物理滅活方法相比，化學(xué)處理對MNV的效果較差。MNV在pH值2～10具有較強的穩(wěn)定性，次氯酸鹽濃度需達到300 μg/mL才能滅活病毒，氯仿、70%乙醇、氟化物和Vertrel清洗劑對病毒在很大程度上是無效的[25]。利用PCR方法對高壓后的墊料、飼料和飲水進行定期檢測有助于控制該病毒的傳播。在飼養(yǎng)管理方面，屏障內(nèi)工作人員應(yīng)嚴格執(zhí)行屏障生產(chǎn)設(shè)施標準操作規(guī)范，外購動物進入動物設(shè)施前要了解動物健康情況，嚴禁有流行病史動物進入。另外，還應(yīng)該避免野生小鼠、蚊蠅和昆蟲進入動物房。動物飼養(yǎng)人員要經(jīng)過對皮膚表面和服裝消毒之后方可進入動物房內(nèi)，禁止外來人員進入。

[1] Wobus C E,Thackray L B,Virgin H W 4th. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis[J]. J Virol，2006，80(11)：5 104-5 112.

[2] Karst S M,Wobus C E, Lay M,etal. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus[J]. Science，2003，299：1 575-1 578.

[3] Henderson K S. Murinenorovirus, a recently discovered and highly prevalent viral agent ofmice[J]. Lab Anim (NY)，2008，37(7)：314-320.

[4] Thorne L G, Goodfellow I G. Norovirus gene expression and replication[J]. J Gen Virol，2014，95(Pt 2)：278-291.

[5] Scipioni A, Mauroy A, Vinjé J,etal. Animal noroviruses[J]. Vet J，2008，178(1)：32-45.

[6] Hsu C C, Riley L K, Livingston R S. Molecular characterization of three novel murine noroviruses[J]. Virus Genes，2007，34(2)：147-155.

[7] Kim M, Lee H, Chang K O,etal. Molecular characterization of murine norovirus isolates from South Korea[J]. Virus Res，2010，147(1)：1-6.

[8] Thackray L B, Holmes K V. Amino acid substitutions and an insertion in the spike glycoprotein extend the host range of the murine coronavirus MHV-A59[J]. Virology，2004，324(2)：510-524.

[9] Mauroy A, Taminiau B, Nezer C,etal. High-throughput sequencing analysis reveals the genetic diversity of different regions of the murine norovirus genome during in vitro replication[J]. Arch Virol, 2016，Epub ahead of print.

[10] Karst S M, Zhu S, Goodfellow I G. The molecular pathology of noroviruses[J]. J Pathol，2014，235(2)：206-216.

[11] Bailey D, Karakasiliotis I, Vashist S,etal. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence[J]. J Virol，2010，84(6)：2 859-2 870.

[12] Rodrigues D M, Moreira J C, Lancellotti M,etal. Murine norovirus infection in Brazilian animal facilities[J].2016.

[13] Mumphrey S M, Changotra H, Moore T N,etal. Murine Norovirus 1 Infection Is Associated with Histopathological Changes in Immunocompetent Hosts, but Clinical Disease Is Prevented by STAT1-Dependent Interferon Responses[J]. J Virol，2007，81(7)：3 251-3 263.

[14] Pritchett-Corning K R,Cosentino J, Clifford C B. Contemporary prevalence of infectious agents in laboratory mice and rats[J]. Lab Anim，2009，43(2)：165-173.

[15] Tsunesumi N, Sato G, Iwasa M,etal. Novel murine norovirus-like genes in wild rodents in Japan[J]. J Vet Med Sci，2012，74(9)：1 221-1 224.

[16] 袁文，王靜，趙維波，等.結(jié)合內(nèi)標的小鼠諾如病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國實驗動物學(xué)報，2015，23(1)：49-56.

[17] 馬暢，張旭亮，劉捷，等.兩株小鼠諾如病毒的分離與鑒定[J].實驗動物科學(xué)，2016，33(4)：11-17.

[18] Ward J M, Wobus C E, Thackray L B,etal. Pathology of immunodeficient mice with naturally occurring murine norovirus infection[J]. Toxicol Pathol，2006，34(6)：708-715.

[19] Shortland A, Chettle J, Archer J,etal. Pathology caused by persistent murine norovirus infection[J]. J Gen Virol，2014，95(2)：413-422.

[20] Kitajima M, Oka T, Tohya Y,etal. Development of a broadly reactive nested reverse transcription-PCR assay to detect murine noroviruses, and investigation of the prevalence of murine noroviruses in laboratory mice in Japan[J]. MicrobiolImmunol，2009，53(9)：531-534.

[21] 高潔，賀爭鳴.小鼠諾如病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2016，26(12)：70-76.

[22] Xiang Z, Tian S, Wei T,etal. MNV primarily surveillance by a recombination VP1-derived ELISA in Beijing area in China[J]. J Immunol Methods，2014，408：70-77.

[23] Shimizu Y, Kitajima M, Hayakawa Y,etal. Inactivation of Murine Norovirus in Breast Milk by Heat Treatment[J]. Jpn J Infect Prev Contr，2011，26(2)：79-82.

[24] Park G W, Linden K G, Sobsey M D. Inactivation of murine norovirus, feline calicivirus and echovirus 12 as surrogates for human norovirus (NoV) and coliphage (F+) MS2 by ultraviolet light (254nm) and the effect of cell association on UV inactivation[J]. Lett Appl Microbiol，2011，52(2)：162-167.

[25] Hwang S, Alhatlani B, Arias A,etal. Murine Norovirus: Propagation, Quantification, and Genetic Manipulation[J]. Curr Protoc Microbiol，2014，33(33)：15K.2.1-15K.2.61.