李朝慧， 任本洪， 孫雪嬌， 寇俊婷， 賀 春， 王曉霞

(山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001)

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·論 著·

順鉑耐藥對食管癌細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成的影響*

李朝慧， 任本洪， 孫雪嬌， 寇俊婷， 賀 春， 王曉霞△

(山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001)

目的： 探討順鉑(cis-dichlorodiamine platinum，cDDP)耐藥對人食管癌KYSE150細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成的影響。方法: 首先采用順鉑濃度遞增的方法，歷經(jīng)10個月左右的時間成功建立了人食管癌順鉑耐藥細胞系KYSE150/cDDP。采用MTT法測定其藥物敏感性，并通過形態(tài)學觀察、MTT實驗、集落形成實驗、DAPI染色、劃痕愈合實驗及小管形成實驗比較順鉑耐藥后食管癌細胞生物學行為的改變。結(jié)果: KYSE150細胞和KYSE150/cDDP細胞在形態(tài)上無明顯差異；MTT實驗結(jié)果顯示，與KYSE150細胞相比，KYSE150/cDDP細胞對cDDP的耐藥指數(shù)為 6.35，細胞活力下降；集落形成實驗結(jié)果顯示，KYSE150/cDDP細胞的集落形成率為(15.00±3.05)%，而KYSE150細胞的集落形成率為(86.70±6.57)%；DAPI染色顯示KYSE150/cDDP細胞的凋亡率為(0.63±0.09)%，而KYSE150細胞的凋亡率為(8.46±1.33)%；劃痕愈合實驗顯示，與KYSE150細胞相比，KYSE150/cDDP細胞的劃痕愈合能力更強，其遷移率較KYSE150細胞的遷移率高；小管形成實驗顯示，KYSE150/cDDP細胞的血管生成數(shù)為76.20±3.18，而KYSE150細胞的血管生成數(shù)為50.60±1.33;Western blot實驗結(jié)果顯示KYSE150/cDDP細胞中MMP-2和VEGFR2的表達均高于KYSE150細胞。結(jié)論: KYSE150/cDDP細胞具有耐藥表型，耐藥后生長緩慢，凋亡能力降低，遷移和血管生成能力增加，這可能是臨床化療失敗的重要原因。

順鉑； 耐藥性； 食管癌； 細胞遷移； 血管生成

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。近年來食管癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，我國每年因食管癌死亡的患者人數(shù)居惡性腫瘤的第4位[1]。化療是治療食管癌的主要有效方法之一，但其耐藥性的產(chǎn)生是導致腫瘤治療失敗的重要原因[2]。美國癌癥協(xié)會研究表明，90%以上的腫瘤患者會不同程度地受到所用化療藥物的毒副作用及其耐藥性的影響[3]。因此，研究耐藥的機制及尋求耐藥逆轉(zhuǎn)的有效方法具有重要的意義。目前，建立腫瘤耐藥細胞系是體外研究化療耐藥的有效方法和重要手段，對未來開展腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)研究及提高臨床化療的療效具有重要價值[4-6]。本研究采用食管癌常用化療藥物順鉑(cis-dichlorodiamine platinum，cDDP)為誘導劑，以人食管癌細胞株KYSE150為誘導對象，采用化療藥物濃度遞增的方法，歷經(jīng)10個月左右的時間，成功誘導建立了人食管癌耐藥細胞系KYSE150/cDDP，并在此基礎(chǔ)上，研究順鉑耐藥對人食管癌KYSE150細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

食管癌細胞株KYSE150由本實驗室保存；人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購于江陰齊氏生物科技有限公司；順鉑購于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于HyClone；胰蛋白酶-EDTA消化液、DAPI試劑均購于北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購于Sigma；4%的多聚甲醛購于武漢博士得生物工程有限公司;兔抗人血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)單克隆抗體購于上海生物工程技術(shù)服務有限公司；兔抗人MMP-2單克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Santa Cruz；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠Ⅱ抗均購于Promega。

2 方法

2.1 耐藥細胞系KYSE150/cDDP的建立及細胞形態(tài)的觀察 采用順鉑濃度遞增的方法建立耐藥細胞系。從低濃度順鉑開始作用處于對數(shù)生長期的KYSE150細胞，培養(yǎng)48 h后棄去含藥物培養(yǎng)液，換用新鮮不含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次，以洗去死亡的細胞，待其恢復生長后，提高順鉑劑量繼續(xù)作用于該細胞，反復作用直到細胞可在濃度為0.5 mg/L 順鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，此時KYSE150/cDDP耐藥細胞系建成。在此過程中于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

2.2 MTT法測定細胞對cDDP的敏感性 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整其細胞密度為每孔1×104，接種于96孔板內(nèi)，37 ℃培養(yǎng) 12 h待細胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加藥孔內(nèi)加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基100 μL，共設6個濃度梯度，每個濃度梯度設置10個復孔同時設空白對照孔。培養(yǎng)48 h后，于每孔中加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h后，棄凈各孔中的溶液，加入DMSO 100 μL，充分溶解后，于490 nm處檢測各孔的吸光度(A)值，計算各藥物濃度作用下細胞的相對抑制率(%)=(1-加藥孔A值/對照孔A值)×100%，通過IC50軟件計算50% 細胞生長抑制所需的藥物濃度(IC50)，耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

2.3 MTT法測定細胞生長曲線 將每孔800個細胞接種于96孔板，分3組，分別為空白組(只加等量RPMI-1640培養(yǎng)基，不含細胞)、對照組(接種KYSE150細胞)、實驗組(接種KYSE150/cDDP細胞)，每組設置3個復孔，37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，采用上述方法檢測各孔的吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞吸光度值為縱軸，繪制細胞的生長曲線。

2.4 集落形成試驗檢測細胞生長能力 取對數(shù)生長期的細胞制備成單細胞懸液并計數(shù)，每個60 mm培養(yǎng)皿中接種1 000個細胞，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 d換液1次，14 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，于顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的集落數(shù)，最終得出集落形成率。集落形成率=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

2.5 DAPI染色檢測細胞對UV誘發(fā)凋亡的敏感性 取對數(shù)生長期的細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，待細胞密度為80%時，將培養(yǎng)基棄去，用UV照射細胞20 s，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。然后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，之后DAPI 避光染色15 min，于熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)的變化。選取隨機視野計數(shù)細胞總數(shù)以及核濃縮、核碎裂細胞數(shù)，每組細胞計數(shù)3個視野。凋亡率(%)=核濃縮、核碎裂細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取單層細胞已鋪滿60 mm培養(yǎng)皿的細胞，用200 μL的槍頭劃痕， PBS洗2遍，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，于劃痕后的0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察細胞的愈合情況。

2.7 體外 HUVEC小管形成試驗檢測細胞培養(yǎng)上清液促小管形成能力 基質(zhì)膠4 ℃過夜凍融，在預冷的96孔板中每孔加入50 μL基質(zhì)膠，37 ℃孵育45 min。HUVECs經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，調(diào)整其濃度為5×108/L，在各孔分別加入20 μL HUVECs懸液并使其分布均勻，之后在孔中分別加入提前經(jīng)饑餓處理48 h的細胞上清液20 μL，孵育6 h后鏡下觀察并拍照。每孔取3個視野計數(shù)小管形成數(shù)。

2.8 Western blot 檢測蛋白的表達水平 收集對數(shù)生長期細胞加入細胞蛋白裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑)，冰上裂解40 min，120 000 r/min離心20 min收集上清液，獲得細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE進行蛋白分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入稀釋好的MMP-2、VEGFR2或β-actin抗體，4 ℃搖床中過夜，PBST洗膜10 min、3次，加入相應的 II 抗室溫孵育2 h，PBST洗膜10 min、3次，化學發(fā)光成像，使用Quantity One對結(jié)果進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 KYSE150/cDDP耐藥細胞系的建立及細胞形態(tài)學的觀察

采用順鉑濃度遞增的方法對KYSE150細胞進行體外誘導，歷經(jīng)10個月左右的時間成功建立了在含0.5 mg/L 順鉑的培養(yǎng)液中可以穩(wěn)定生長的耐藥細胞系，將其命名為KYSE150/cDDP。其中，在處于對數(shù)生長期的KYSE150細胞中加入順鉑后的24 h～48 h內(nèi)，細胞生長已基本停止，于加藥后第4天開始，細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化，部分細胞由于死亡而呈現(xiàn)漂浮狀態(tài)，培養(yǎng)液變黃變渾濁，殘存的貼壁細胞變得大小不一，形態(tài)不規(guī)則，有巨細胞的產(chǎn)生，胞內(nèi)顆粒增多。每隔1～2 d換液 1 次，以洗去死亡的細胞，25 d左右的時間出現(xiàn)細胞克隆，待其恢復穩(wěn)定生長后傳代，細胞逐漸接近原來的細胞形態(tài)，見圖1。

Figure 1.The cell morphology observed under inverted microscope (×100). The images showed the morphology of normal KYSE150 cells (A), KYSE150 cells treated with cDDP for 4 d (B) and 25 d (C), as well as KYSE150/cDDP cells (D).

圖1 倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)

2 細胞耐藥性及其生長曲線的測定

通過MTT法得出順鉑對KYSE150/cDDP細胞的IC50為(15.50±0.21)μmol/L，對KYSE150細胞的IC50為(2.44±0.14) μmol/L，耐藥指數(shù)為6.35。與KYSE150細胞相比，KYSE150/cDDP細胞的生長速率較為緩慢，見圖2。

Figure 2.The growth curves of KYSE150/cDDPs cells and KYSE150 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.

圖2 KYSE150/cDDP細胞與KYSE150細胞的生長曲線

3 細胞集落形成能力的變化

集落形成試驗顯示，KYSE150與KYSE150/cDDP細胞集落形成率分別是(86.70±6.57)% 和(15.00±3.05)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且KYSE150細胞形成的集落較大(圖3)。這表明順鉑耐藥導致細胞的集落形成能力有所下降，與上述MTT實驗結(jié)果的變化趨勢一致。

Figure 3.The efficiency of colony formation of KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsKYSE150.

圖3 KYSE150細胞與KYSE150/cDDP細胞的集落形成情況

4 細胞凋亡的變化

經(jīng)UV誘導照射后DAPI染色結(jié)果顯示，KYSE150細胞出現(xiàn)核碎裂、核濃縮等細胞凋亡現(xiàn)象(圖4中箭頭所示)，細胞凋亡率為(8.46±1.33)%，而KYSE150/cDDP細胞的凋亡率為(0.63±0.09)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示順鉑耐藥抑制細胞的凋亡，見圖4。

Figure 4.The apoptosis of KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells under fluorescence microscope (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsKYSE150.

圖4 熒光顯微鏡下觀察KYSE150細胞與KYSE150/cDDP細胞的凋亡情況

5 細胞遷移能力的變化

劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，劃痕24 h后KYSE150/cDDP細胞已基本愈合，其遷移率為(96.80±0.60)%；而KYSE150細胞尚未愈合完全，其遷移率為(68.60±1.47)%，表明耐藥細胞的遷移能力較強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Western blot實驗結(jié)果顯示，KYSE150/cDDP細胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2的表達量明顯高于KYSE150細胞，灰度比值分別是0.48±0.02和0.08±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

6 血管形成能力的變化

通過體外HUVEC小管形成實驗，我們發(fā)現(xiàn)KYSE150/cDDP細胞形成的小管管腔更為完整，血管生成數(shù)為76.20±3.18，而KYSE150細胞的血管生成數(shù)為50.60±1.33，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),表明耐藥細胞的血管生成能力較強。Western blot實驗結(jié)果顯示，KYSE150/cDDP細胞中的VEGFR2表達量明顯高于KYSE150細胞，灰度比值分別為1.15±0.02和0.56±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖6。

討 論

目前，許多惡性腫瘤在治療期間出現(xiàn)對化療藥物的耐受現(xiàn)象，因而導致腫瘤治療的失敗。因此研究化療耐藥性產(chǎn)生的原因?qū)τ谂R床腫瘤治療具有重要的意義。繼Broggini在1988年首次成功建立了對阿霉素耐藥的結(jié)腸癌細胞株后，一系列腫瘤耐藥細胞株開始成功建立：如卵巢癌順鉑耐藥細胞株COC1/DDP[7]、肺腺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP[8]、人胃癌順鉑耐藥細胞株BGC-823-cDDP[9]等。順鉑是臨床上治療食管癌的主要化療藥物之一，是一種鉑類金屬絡合物，其作用機制主要是使DNA鏈間及鏈內(nèi)發(fā)生交鏈，形成順鉑-DNA的復合物發(fā)揮作用，進而干擾DNA的復制和合成[10]，順鉑也可以與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合，引起腫瘤細胞的凋亡，因此順鉑可以作為一種較為廣譜的抗腫瘤化療藥物[11]。但是，近年來，隨著臨床化療的普遍開展，不少腫瘤患者均出現(xiàn)了順鉑耐藥的現(xiàn)象[12-14]。因此，體外誘導腫瘤細胞耐藥的方法將會為進一步研究腫瘤耐藥的機制提供細胞實驗模型，有助于探討臨床腫瘤化療失敗的原因。

Figure 5.The migratory ability of KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells. A: the wound healing abilities of KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells (×100); B: the protein expression of MMP-2 in KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsKYSE150.

圖5 KYSE150細胞與KYSE150/cDDP細胞的遷移情況

Figure 6.The abilities of tube formation of KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells. A: the numbers of tube formation of KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells (×400); B: the protein expression of VEGFR2 in KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsKYSE150.

圖6 KYSE150細胞與KYSE150/cDDP細胞的小管形成情況

通過化療藥物體外誘導建立耐藥細胞株常用的方法主要有大劑量間歇沖擊療法和濃度逐步遞增法 2 種[15]。2種方法比較,第 1 種方法更符合臨床特點，但是由于初始給藥劑量難以掌握容易出現(xiàn)劑量過大導致腫瘤細胞全部死亡;而第2種加藥方法是從小劑量開始的，待腫瘤細胞適應后再逐漸增加劑量，成功率較高，但是比較耗時。目前實驗室建立耐藥細胞株多采用第2種方法。本實驗采用順鉑濃度遞增的方法，最終成功建立了人食管癌順鉑耐藥細胞系KYSE150/cDDP。

本研究發(fā)現(xiàn)，與親本細胞相比，耐藥細胞在前期生長較為緩慢，這可能是由于順鉑藥物的沖擊作用導致的，或者由于順鉑作用于細胞內(nèi)的DNA，進而抑制DNA的復制，導致細胞停滯于G1期[16]，此時細胞生長緩慢，耐藥細胞一旦進入S期后，可以進行正常的有絲分裂，完成整個細胞周期，達到正常的生長速度。此現(xiàn)象與以往在耐藥細胞系中的研究報道結(jié)果一致[17-19]。DAPI染色實驗發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞凋亡較親本細胞少，提示細胞耐藥導致抑制腫瘤細胞的凋亡，此結(jié)果與楊皎娃等[20]在胃癌研究中的結(jié)果一致。劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn)，KYSE150/cDDP細胞的遷移能力明顯高于對照組，同時Western blot實驗結(jié)果證實耐藥細胞中MMP-2的表達量明顯增高。MMP-2作為一種降解基底膜和細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，可以加速細胞外基質(zhì)的降解，促進從原發(fā)部位脫落的腫瘤細胞更快地遷移至新的部位定居，導致腫瘤的惡化[21]。而腫瘤血管生成與細胞遷移及細胞外基質(zhì)降解等過程密切相關(guān)[21]。本研究通過HUVEC小管形成實驗證實耐藥細胞的小管形成能力更強，管腔更完整，說明更多的新生血管為耐藥細胞的增殖和轉(zhuǎn)移提供了營養(yǎng)物質(zhì)。同時研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR2在耐藥細胞中的表達量增高，而VEGFR2在促進內(nèi)皮細胞遷移和血管形成方面發(fā)揮重要的作用，提示順鉑耐藥可能通過活化VEGFR2信號通路來促進腫瘤血管的生成。本研究揭示了順鉑耐藥導致腫瘤細胞凋亡受抑，遷移和血管生成能力增強，因而導致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，進而造成臨床順鉑化療失敗。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of cDDP resistance on proliferation, apoptosis, migration and angiogenesis of esophageal cancer cells

LI Chao-hui, REN Ben-hong, SUN Xue-jiao, KOU jun-ting, HE Chun, WANG Xiao-xia

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:wxiaoxia99007@126.com)

AIM: To investigate the effect ofcis-dichlorodiamine platinun (cDDP) resistance on proliferation, apoptosis, migration and angiogenesis of esophageal cancer cell line KYSE150. METHODS: Using the method of increa-sing concentration of cDDP in culture for 10 months, the human esophageal carcinoma cDDP-resistant cell line named KYSE150/cDDP was established successfully. The drug sensitivity was measured by MTT assay. The changes of the biological behaviors between the parental cell line and resistant cell line were determined by morphological observation assay, MTT assay, colony formation assay, DAPI staining, wound healing assay and tube formation experiment.RESULTS: No significant morphological difference between KYSE150 cells and KYSE150/cDDP cells was observed. Compared with KYSE150 cells, the drug resistance index of KYSE150/cDDP cells was 6.35, and the viability of KYSE150/cDDP cells was decreased. The colony formation rate of KYSE150/cDDP cells was (15.00±3.05)%, while the colony formation rate of KYSE150 cells was (86.70±6.57)%. The apoptotic rate of KYSE150/cDDP cells was (0.63±0.09)%， and that of KYSE150 cells was (8.46±1.33)%. Compared with KYSE150 cells, KYSE150/cDDP cells showed a stronger healing ability of scratch, and the migration rate was higher than that of KYSE150 cells. The results of tube formation experiment showed that the vessel number in KYSE150/cDDP group was 76.20±3.18, while the vessel number in KYSE150 group was 50.60±1.33. The protein expression of MMP-2 and VEGFR2 in KYSE150/cDDP cells was higher than that in KYSE150 cells.CONCLUSION: KYSE150/cDDP cells present drug-resistant phenotype and show a slow growth rate. The ability of apoptosis is decreased, and the abilities of cell migration and angiogenesis are increased. This may be an important reason for the failure of clinical chemotherapy for esophageal cancer.

cis-Dichlorodiamine platinum; Drug resistance; Esophageal cancer; Cell migration; Angiogenesis

1000- 4718(2017)01- 0001- 06

2016- 08- 18

2016- 10- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 81372676)；中國博士后基金資助項目(No. 2014M551058)；山西省自然科學基金資助項目(No. 201601D011130)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.001

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