余瀟苓， 趙燕娜， 鄭智茵， 高瑞蘭， 尹利明

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州 310006)

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地西他濱抑制K562白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化的作用*

余瀟苓， 趙燕娜， 鄭智茵， 高瑞蘭， 尹利明△

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州 310006)

目的： 觀察地西他濱(DAC)抑制白血病K562細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)分化的作用。方法: 不同濃度的DAC處理K562細(xì)胞。MTT法和半固體集落生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K562細(xì)胞增殖能力；瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分化相關(guān)抗原CD11b和CD42b陽性表達(dá)率；Western blot 檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1)、細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子P27、紅系分化核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1及粒系分化核轉(zhuǎn)錄因子PU.1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果: DAC能夠減少K562 細(xì)胞集落形成的數(shù)量，降低細(xì)胞活力，減少核質(zhì)比，抑制K562細(xì)胞進(jìn)入S期，并阻滯在G2/M期，提高分化相關(guān)抗原CD11b和CD42b陽性表達(dá)率，上調(diào)P27、GATA-1 和PU.1蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)CDK2和cyclin E1蛋白表達(dá)。結(jié)論: DAC可能通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制K562細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)多向分化。

地西他濱； 白血病； 細(xì)胞增殖； 分化； 細(xì)胞周期

白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在兒童和青年的惡性腫瘤中位居首位，其生物學(xué)特征是造血細(xì)胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過程發(fā)生障礙，以致異常分化的細(xì)胞大量增殖。近年研究發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞抑癌基因啟動(dòng)子CpG島高度甲基化，導(dǎo)致抑癌基因沉默，可能是白血病細(xì)胞增殖失控和分化阻滯的原因之一[1]。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠誘導(dǎo)甲基化沉默基因表達(dá)，而表達(dá)的抑癌基因能夠調(diào)控細(xì)胞增殖。地西他濱(decitabine; 商品名Dacogen，DAC)是一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，低劑量能夠誘導(dǎo)DNA去甲基化和造血干細(xì)胞分化[2]，而高劑量則有細(xì)胞毒作用。目前，治療骨髓增生異常綜合征的療效確切[3]，而用于白血病的治療正在探索中[4-6]。本研究觀察DAC 抑制K562白血病細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化的作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

K562細(xì)胞由浙江省中醫(yī)院血液病研究所保存；DAC 購自Sigma；注射用水和細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為20 mmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆?；IMDM培養(yǎng)基購自 Gibco；小牛血清購自杭州四季青公司；PE標(biāo)記的小鼠抗人CD11b和CD42b抗體購自BD；抗細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)、細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1)、P27、GATA-1和PU.1抗體購自Cell Signaling Technology；抗β-actin抗體購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將K562細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的IMDM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L，分別加入不同濃度DAC和陽性對(duì)照藥物佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)，分別接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2×104細(xì)胞(200 μL)，復(fù)種6孔。DAC 終濃度分別為0、0.1、0.2和0.4 μmol/L，TPA終濃度為0.1 μmol/L。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入5 g/L MTT 20 μL，在相同條件下繼續(xù)孵育4 h。離心棄上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，微量振蕩器振蕩5 min，使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度)/對(duì)照組吸光度×100%。

2.3 K562細(xì)胞半固體集落形成實(shí)驗(yàn) 計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/L，進(jìn)行K562白血病細(xì)胞集落培養(yǎng)，分別加入不同濃度的DAC和TPA。DAC終濃度為0、0.1、0.2和0.4 μmol/L，TPA終濃度為0.1 μmol/L。培養(yǎng)體系為IMDM培養(yǎng)液、30%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U青/鏈霉素和0.3%瓊脂，接種于24孔板， 每孔2.5×102個(gè)細(xì)胞(0.5 mL)，重復(fù)3孔。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。以大于40個(gè)細(xì)胞的聚合為一個(gè)K562白血病細(xì)胞集落，記錄K562白血病細(xì)胞集落數(shù)，并計(jì)算抑制率(%)=(對(duì)照組集落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù))/對(duì)照組集落數(shù)×100%。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 瑞氏染色(Wright’s staining)觀察細(xì)胞形態(tài)的改變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L，分別加入不同濃度DAC 和TPA，分別接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105細(xì)胞(3 mL)。DAC 終濃度分別為0、0.1、0.2和0.4 μmol/L，TPA終濃度為0.1 μmol/L。上述培養(yǎng)體系置37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，培養(yǎng)7 d后收集細(xì)胞，細(xì)胞離心涂片機(jī)制作細(xì)胞涂片。瑞氏染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分化相關(guān)抗原陽性表達(dá)率 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，取100 μL細(xì)胞懸液分別加入抗分化相關(guān)抗原CD11b和CD42b的單克隆抗體，4 ℃孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞陽性表達(dá)率，每一個(gè)檢測(cè)標(biāo)本記錄10 000個(gè)細(xì)胞。DIVA軟件進(jìn)行陽性率的分析。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot 法檢測(cè)K562細(xì)胞CDK2、cyclin E1、P27、GATA-1和PU.1的蛋白表達(dá) 按照本研究所已報(bào)道的方法[7]，采用細(xì)胞裂解液(含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將40 μg蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液20 μL中煮沸后，經(jīng)SDS-PAGE分離后，將蛋白條帶用電轉(zhuǎn)移到NC膜上，分別加特異性的抗CDK2、cyclin E1、P27、GATA-1和PU.1抗體，4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑。采用灰度掃描系統(tǒng)測(cè)定并分析目的蛋白條帶。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，藥物實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 地西他濱抑制K562細(xì)胞增殖

DAC處理K562細(xì)胞3 d，0.1～0.4 μmol/L組的A值分別為0.61±0.04、0.54±0.03和0.50±0.03，其中0.2和0.4 μmol/L DAC組的A值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。DAC處理K562細(xì)胞7 d，0.1～0.4 μmol/L組的K562細(xì)胞集落數(shù)分別為109.3±8.1、72.3±7.9和48.0±8.4(每103個(gè)K562細(xì)胞)，顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The proliferation of K562 cells detected by MTT assay (A) and colony formation assay (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 MTT實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)DAC抑制K562細(xì)胞增殖

2 DAC 誘導(dǎo)K562細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

DAC 處理K562細(xì)胞7 d，瑞氏染色顯示隨著藥物濃度增大，K562細(xì)胞體積增大，胞漿豐富，核漿比減少，胞漿內(nèi)可見空泡等細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，見圖2。

3 地西他濱提高K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原陽性表達(dá)率

地西他濱處理K562細(xì)胞7 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562細(xì)胞分化程度，結(jié)果顯示K562細(xì)胞分化相關(guān)抗原CD11b和CD42b陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組，且呈一定的劑量依賴關(guān)系，見圖3、表1。

4 DAC 對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

不同濃度DAC處理K562細(xì)胞72 h，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，S期細(xì)胞的比例逐漸減少，G2/M期的細(xì)胞比例逐漸增加，見圖4、表1。

5 DAC 對(duì)K562細(xì)胞周期和分化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，CDK2和cyclin E1的蛋白表達(dá)水平逐漸降低，而P27、GATA-1和PU.1的蛋白表達(dá)水平逐漸增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 2.The morphologial changes of K562 cells induced by DAC (×400). A: control; B: 0.1 μmol/L DAC; C: 0.2 μmol/L DAC; D: 0.4 μmol/L DAC; E: TPA.

圖2 DAC對(duì)K562細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 3. DAC increased the CD11b and CD42b positive rate in K562 cells.

圖3 DAC提高K562細(xì)胞CD11b和CD42b陽性表達(dá)率

Figure 4. DAC changed the cell cycle distribution of the K562 cells.

圖4 DAC對(duì)K562細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

表1 DAC對(duì)細(xì)胞CD11b和CD42b陽性率和細(xì)胞周期分布的影響

Table 1.The effects of DAC on the CD11b and CD42b positive rates and the cell cycle distribution of the K562 cells (%. Mean±SD.n=3)

TreatmentCD11bCD42bG0/G1SG2/MControl3．51±0．327．92±0．5744．91±4．2147．14±3．857．96±1．200．1μmol/LDAC4．20±0．33?16．10±1．04??35．06±3．14?33．66±2．98?27．49±2．13??0．2μmol/LDAC8．10±0．73??30．21±3．68??36．66±3．11?28．14±2．01??36．20±2．87??0．4μmol/LDAC5．38±0．47?13．80±0．89??35．40±3．24?25．52±2．57??39．09±3．47??TPA12．21±0．44??14．80±0．43??53．84±4．16??37．75±3．11??8．04±0．68

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

討 論

DAC是一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，具有去甲基化的作用。該藥在血液系統(tǒng)疾病如骨髓增生異常綜合征的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用方面已取得令人滿意的療效，并且在治療髓系白血病方面也有較好的療效，但是機(jī)制尚不明確。

在一定誘導(dǎo)因素作用下，白血病K562細(xì)胞株可向紅系、粒-單系和巨核系細(xì)胞分化，是研究白血病細(xì)胞增殖與分化的理想細(xì)胞模型。我們觀察到每103個(gè)K562細(xì)胞能夠形成264.7±19.1個(gè)集落，也就是這些集落來自于264.7±19.1個(gè)原始細(xì)胞，表明每個(gè)K562細(xì)胞的增殖能力不同，具有異質(zhì)性的特點(diǎn)，提示能夠形成集落的K562細(xì)胞更原始。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)濃度為0.1～0.4 μmol/L的DAC能夠顯著減少K562細(xì)胞形成集落的數(shù)量，抑制K562細(xì)胞原始細(xì)胞的增殖，抑制率達(dá)到58.7%～81.9%。MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，濃度為0.1～0.4 μmol/L的DAC抑制K562細(xì)胞增殖，抑制率達(dá)到10.3%～25.6%。MTT實(shí)驗(yàn)是以K562細(xì)胞群作為觀察對(duì)象，白血病細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)以K562細(xì)胞群中原始細(xì)胞作為觀察對(duì)象。因此，2種實(shí)驗(yàn)相結(jié)合能夠更全面地觀察和分析DAC抑制K562細(xì)胞增殖的作用。

阻止白血病細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，抑制惡性增殖是抗白血病常用手段和療法[8-9]。研究表明，DAC對(duì)細(xì)胞周期分布的影響具有時(shí)效性和空間性。熊鳴等[10]報(bào)道DAC處理K562耐藥細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞無變化；而處理48 h， G2/M期細(xì)胞比例增加。韓新愛等[11]報(bào)道，DAC處理K562細(xì)胞72 h后，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，S期細(xì)胞比例降低， G2/M期細(xì)胞比例無變化。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道DAC抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，并阻滯在G2/M期[12-13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DAC處理K562細(xì)胞72 h，上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子P27蛋白表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期 CDK2和cyclin E1蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，同時(shí)細(xì)胞阻滯在G2/M期，與已報(bào)道的結(jié)果基本一致，但略有不同，可能是藥物濃度不同所致。此外，陽性對(duì)照藥物TPA增加G0/G1期K562細(xì)胞比例，降低S期細(xì)胞比例，而G2/M期細(xì)胞比例無變化，其對(duì)細(xì)胞周期的作用與DAC不同。

目前，針對(duì)白血病分化阻滯的發(fā)病機(jī)制，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化以治療髓系白血病的方法受到關(guān)注，但是臨床上常用的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑應(yīng)用范圍局限，如砷劑和維甲酸僅限于治療M3早幼粒白血病患者，難于滿足臨床需要。研究發(fā)現(xiàn)，基因組甲基化程度的高低水平調(diào)控細(xì)胞分化能力[14-15]，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)甲基化水平與分化程度呈正相關(guān)。我們觀察了DAC誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的作用，在0.1～0.4 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，DAC能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化，不僅有細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，而且細(xì)胞分化抗原和分化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均也有不同程度的提高，提示DAC非特異性誘導(dǎo)K562細(xì)胞向多系分化。然而，陽性對(duì)照藥TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的作用不同于DAC；TPA增加粒系分化抗原CD11b陽性表達(dá)的細(xì)胞比例較多，而巨核系分化抗原CD42b表達(dá)陽性的細(xì)胞比例較少，提示TPA誘導(dǎo)K562細(xì)胞趨于分化為粒系。

Figure 5.DAC regulated the protein expression of CDK2, cyclinE1, P27, GATA-1 and PU.1 in the K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 DAC對(duì)K562細(xì)胞CDK2、cyclinE1、P27、GATA-1和PU.1蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用

綜上所述，本研究初步探討了DAC誘導(dǎo)髓系白血病分化的作用。但仍有許多問題有待進(jìn)一步解決，譬如DAC臨床應(yīng)用的誘導(dǎo)分化劑量、誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的去甲基化機(jī)制、誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的細(xì)胞周期分布等。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of decitabine on proliferation and differentiation of K562 cells

YU Xiao-ling, ZHAO Yan-na, ZHENG Zhi-yin, GAO Rui-lan, YIN Li-ming

(InstituteofHematology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China.E-mail:yinlm_hz@163.com)

AIM: To investigate the effect of decitabine (Dacogen, DAC) on the proliferation and differentiation of K562 cells. METHODS: The K562 cells were treated with different concentrations of DAC. The colony formation ability of the cells was detected by the colony formation assay with semi-solid culture. The cell viability was detected with MTT assay. The morphologic features were observed under inverted microscope with Wright’s staining. The changes of the cell cycle distribution and the expression of CD11b and CD42b were analyzed with flow cytometry. The protein expression of CDK2, cyclin E1, P27, GATA-1 and PU.1 in the K562 cells was determined by Western blot. RESULTS: DAC significantly decreased the colony number of the cells and cell viability in a dose-dependent manner. The morphological changes of the cells displayed partial differentiation. After treated the K562 cells with DAC for 72 h, the cell proportion in S phase was obviously decreased, while the cell proportion in G2/M phase was obviously increased in a dose-dependent manner. After treated the K562 cells with DAC for 7 d, the percentage of CD11b and CD14 positive cells was further elevated, and the protein expression of P27, GATA-1 and PU.1 was increased. However, the protein expression of CDK2 and cyclin E1 was decreased. CONCLUSION: DAC inhibits the proliferation and induces differentiation of the K562 cells via regulation of cell cycle.

Decitabine; Leukemia; Cell proliferation; Differentiation; Cell cycle

1000- 4718(2017)01- 0013- 05

2016- 07- 22

2016- 11- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81373876)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. Y14H290004)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.003

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