衛(wèi) 冬， 張曉娟， 劉 潔， 宋秋穎△

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院 1眼科， 2放射科， 黑龍江 牡丹江 157011)

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Survivin抑制劑YM155對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞線粒體凋亡途徑的影響*

衛(wèi) 冬1， 張曉娟2， 劉 潔1， 宋秋穎1△

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院1眼科，2放射科， 黑龍江 牡丹江 157011)

目的： 探討人生存素(survivin)抑制劑YM155{4，9-二氫-1-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-4，9-二氧代-3-(2-吡嗪甲基)-1H-萘并[2，3-d]咪唑鎓溴化物}對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位(Δψm)和細(xì)胞色素C(Cyt C)的影響，探討其誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)Y79細(xì)胞，分別以0、0.5、1、2、4、8 nmol/L的YM155進(jìn)行處理，采用CCK-8法和溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)摻入標(biāo)記法檢測(cè)YM155對(duì)Y79細(xì)胞增殖的抑制作用。Y79細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組[加入10 nmol/L拓?fù)涮婵?topotecan)]和低劑量(1 nmol/L)、高劑量(2 nmol/L) YM155組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，處理24 h。分別采用TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)凋亡的情況；采用JC-1活細(xì)胞染色檢測(cè)Δψm的變化；采用免疫熒光分析檢測(cè)Cyt C的分布；采用Western blot法檢測(cè)survivin和線粒體內(nèi)Cyt C的蛋白表達(dá)。結(jié)果: 與對(duì)照組比較，YM155對(duì)Y79細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，并誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡(P<0.05)；YM155顯著降低Y79細(xì)胞的Δψm，促進(jìn)Cyt C由線粒體釋放至胞漿，降低線粒體內(nèi)Cyt C的水平(P<0.05)。結(jié)論: YM155對(duì)Y79細(xì)胞增殖具有抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤； YM155； 細(xì)胞凋亡； 線粒體凋亡途徑

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種嚴(yán)重的致殘致死的小兒眼內(nèi)惡性腫瘤，通常在出生后的第1年發(fā)病，往往好發(fā)于一側(cè)眼球，發(fā)病率約1/17 000，近年來發(fā)病率有上升趨勢(shì)[1]，危害著許多兒童的健康。有關(guān)于RB的確切發(fā)病機(jī)制，目前仍然不清楚，但是有研究表明，凋亡抑制蛋白人生存素(survivin)表達(dá)升高可能是RB的發(fā)病機(jī)制之一[2-3]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員中分子質(zhì)量最小的蛋白質(zhì)，在正常分化成熟組織中幾乎不表達(dá)，但是對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及血管形成起重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是其強(qiáng)大的抑制凋亡能力，作為近年來發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用最強(qiáng)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子之一，已經(jīng)成為腫瘤治療一個(gè)新的重要靶點(diǎn)[4-5]。YM155 是一種咪唑類化合物，也是survivin的第一個(gè)特異性抑制劑，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞survivin的表達(dá)水平，在腫瘤治療研究中得到了廣泛的關(guān)注。研究表明，YM155對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，如乳腺癌、腎癌、胃癌、白血病等[6-9]。但是，有關(guān)于YM155對(duì)RB的作用卻鮮見報(bào)道，因此本研究以YM155和Y79細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探討YM155對(duì)Y79細(xì)胞的抑制作用以及誘導(dǎo)凋亡是否與線粒體途徑有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。復(fù)蘇Y79細(xì)胞，培養(yǎng)在含有10%熱滅活胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液(含碳酸氫鈉2.0 g/L、青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)候，1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，Hank 液洗滌細(xì)胞2次，然后用不含有BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及配制 YM155(Selleckchem；純度>98%)，溶解于ddH2O，配制成10 nmol/L儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存，臨用時(shí)以RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.3 主要試劑 拓?fù)涮婵?貴州漢方制藥有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；BrdUIn-SituDetection Kit(BD)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI試劑盒(南京凱基生物有限公司)；DAPI(上海碧云天公司)；線粒體抽提試劑盒和Hoechst 33258染料(Biowest)；JC-1線粒體膜電位(Δψm)檢測(cè)試劑盒(Genmed)；鼠抗人survivin和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)單克隆抗體(Santa Cruz)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗鼠IgG II抗(Sigma)。

2 方法

2.2 Y79細(xì)胞凋亡的檢測(cè) (1) 使用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)YM155對(duì)Y79細(xì)胞凋亡的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Y79細(xì)胞，按照每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下過夜培養(yǎng)。對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)液；陽(yáng)性對(duì)照組加入10 nmol/L拓?fù)涮婵担坏蛣┝縔M155組加入1 nmol/L YM155；高劑量YM155組加入2 nmol/L YM155。各組細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。PBS沖洗 3 min、2次，然后-20 ℃甲醇固定15 min。1 mL PBS沖洗 3 min、3次，加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，避光37 ℃孵育1 h。1 mL PBS沖洗3 min、2次，Hoechst 33258染料37 ℃避光染色10 min。Olympus BX43熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)。每個(gè)圖片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI; %)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。(2) Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析：分組同上。1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，1 mL PBS沖洗2次，然后加入490 μL 1×上樣緩沖液混勻。最后加入50 mg/L Annexin V-FITC和PI液各5 μL，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)60 min，BD FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)Y79細(xì)胞的凋亡情況。每組設(shè)6個(gè)平行孔。

2.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Δψm分組同2.2。1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，1 mL PBS沖洗2次，加入2 μL JC-1液，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)130 min。以LSM510 META激光共聚焦顯微鏡按照J(rèn)C-1 Δψm檢測(cè)試劑盒說明書步驟測(cè)量熒光信號(hào)。按照J(rèn)C-1不同形式所發(fā)射的熒光不同，以紅色/綠色熒光比值(FL2/FL1)表示Δψm的變化。ImageJ軟件計(jì)算FL2/FL1。每組測(cè)量6次。

2.4 免疫熒光分析 分組同2.2。待細(xì)胞爬滿爬片，取出，1 mL PBS沖洗2次，3.7%低聚甲醛固定30 min，1 mL PBS沖洗2次，5% BSA室溫封閉15 min，0.2% Triton X-100處理15 min，然后與抗Cyt C小鼠單克隆抗體(1∶50稀釋)一起于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)1 h。1 mL PBS沖洗2次，加入FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG II 抗(1∶400稀釋)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)30 min，DAPI處理10 min，LSM510 META激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。每組設(shè)6個(gè)平行孔。

2.5 Western blot法檢測(cè)survivin和Cyt C的蛋白水平 分組同2.2。1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入含有25 mmol/L HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF和1 mg/L亮肽素的冰冷的裂解緩沖液(pH 7.4)，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄沉渣，收集上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣后進(jìn)行10% SDS-PAGE。當(dāng)電泳完成后，電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上，5%脫脂奶粉PBST(含25 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl和0.1% Tween 20, pH 7.5)4 ℃封閉2 h。然后分別加入鼠抗人survivin和Cyt C單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，加入HRP標(biāo)記的 II 抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h。PBST洗滌 5 min、3次，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行計(jì)值及統(tǒng)計(jì)分析。Cyt C檢測(cè)的線粒體提取過程嚴(yán)格按照線粒體抽提試劑盒說明操作。β-actin抗體孵育方法與上述方法相同，蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度/β-actin蛋白表達(dá)強(qiáng)度。每份樣品檢測(cè)6次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)采用Graphpad 5.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，首先對(duì)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性進(jìn)行檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，繼之多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 YM155對(duì)Y79細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響

庫(kù)存管理子系統(tǒng)可以多維度管理庫(kù)存物料，主要有貨位管理、批次管理、序列號(hào)管理和出入庫(kù)管理、預(yù)警管理、盤點(diǎn)管理?？梢詮念悇e、庫(kù)別、貨位、批次、項(xiàng)目等不同的角度來管理庫(kù)存物品的數(shù)量、庫(kù)存成本和資金占用情況?？梢园床煌男枰从硯?kù)存的分布情況，同時(shí)，庫(kù)存管理還能滿足傳統(tǒng)的收發(fā)存匯總表，能夠定義分部門統(tǒng)計(jì)等功能。

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，Y79細(xì)胞經(jīng)0、0.5、1、2、4、8 nmol/L YM155處理24 h、48 h和72 h后，YM155以濃度和時(shí)間依賴性抑制Y79細(xì)胞的活力，相對(duì)細(xì)胞活力顯著降低，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；YM155作用24 h、48 h和72 h的IC50分別為(2.59±0.31)nmol/L、(1.76±0.23)nmol/L和(1.44±0.20)nmol/L。BrdU摻入法檢測(cè)結(jié)果顯示，Y79細(xì)胞經(jīng)0、0.5、1、2、4、8 nmol/L YM155處理24 h后，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和標(biāo)記指數(shù)顯著降低，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示，YM155可以抑制Y79細(xì)胞增殖，見圖1。

2 YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡

2.1 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組Y79細(xì)胞核呈藍(lán)色，邊緣光滑完整，均勻淡染。低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽(yáng)性對(duì)照組Y79細(xì)胞部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)和邊緣化，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽(yáng)性對(duì)照組Y79細(xì)胞凋亡率顯著升高，且呈劑量依賴性，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3 線粒體膜電位的變化

JC-1活細(xì)胞染色結(jié)果顯示，對(duì)照組Y79細(xì)胞紅綠熒光變化不明顯；低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽(yáng)性對(duì)照組Y79細(xì)胞出現(xiàn)明顯紅綠熒光變化，F(xiàn)L2/FL1顯著減小，Δψm降低，且呈濃度依賴性，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

4 YM155對(duì)Y79細(xì)胞Cyt C分布的影響

對(duì)照組Y79細(xì)胞胞漿內(nèi)僅見微弱的熒光信號(hào)；低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽(yáng)性對(duì)照組Y79細(xì)胞，胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯增強(qiáng)的熒光信號(hào)，見圖5。

5 Western blot檢測(cè)YM155對(duì)Y79細(xì)胞survivin和Cyt C蛋白水平的變化

Western blot分析結(jié)果顯示，低劑量YM155組、高劑量YM155組和陽(yáng)性對(duì)照組Y79細(xì)胞的survivin蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，而Cyt C的蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

Figure 1.The effect of YM155 at different concentrations on the proliferation of Y79 cells. A: the results of CCK-8 assay; B: the results of BrdU incorporation assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1 不同濃度YM155對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響

Figure 2. Induction of Y79 cell apoptosis by YM155 observed by TUNEL staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡的TUNEL染色結(jié)果

Figure 3. The results of flow cytometry analysis for determining the Y79 cells apoptosis induced by YM155. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

Figure 4. The JC-1 staining of the Y79 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 Y79細(xì)胞JC-1活細(xì)胞染色結(jié)果

Figure 5.The immunofluorescence of Cyt C in the Y79 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 Y79細(xì)胞Cyt C免疫熒光染色的結(jié)果觀察

Figure 6. The Western blot results of survivin and Cyt C protein levels in the Y79 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6 Y79細(xì)胞Western blot結(jié)果

討 論

基于survivin表達(dá)升高，是RB的發(fā)病機(jī)制之一[2-3]，本研究以survivin抑制劑YM155和Y79細(xì)胞為研究對(duì)象，探討YM155潛在的對(duì)RB治療作用。雖然RB的細(xì)胞株比較多，如HXO-RB44細(xì)胞、SO-RB50細(xì)胞和Y79細(xì)胞等，但是研究凋亡的大多采用Y79細(xì)胞，而且Y79細(xì)胞的研究技術(shù)非常成熟，故此，本研究以Y79細(xì)胞作為RB的代表細(xì)胞。本研究結(jié)果證實(shí)，YM155可顯著抑制Y79細(xì)胞survivin的表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YM155對(duì)Y79細(xì)胞增殖有一定抑制作用，提示YM155可作為RB的潛在藥物。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色分析證實(shí)，YM155可誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因調(diào)控的一種生理性死亡過程，對(duì)保持自身平衡十分重要，腫瘤的生長(zhǎng)速率很難控制，這與凋亡能力的減弱和增殖能力的提升密切相關(guān)[11]。涉及細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路包括線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，其中線粒體途徑和死亡受體途徑為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要途徑[12-13]。線粒體是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞器，在凋亡過程中具有重要的調(diào)控作用，其Δψm是反映線粒體內(nèi)膜通透性的最佳指標(biāo)之一[14]。Cyt C是一種水溶性小分子物質(zhì)，位于線粒體中，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，是最早被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白[15]。Δψm的破壞被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一[16]。當(dāng)Δψm降低后，線粒體膜腫脹、通透性增高，Cyt C從內(nèi)膜脫落出來并釋放到胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子及caspase-3前體相互作用，形成復(fù)合物，激活下游的效應(yīng)caspase，從而誘導(dǎo)凋亡[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡的過程中，也檢測(cè)到Δψm的平行下降，表明YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡可能與Δψm有關(guān)。以上結(jié)果初步提示，YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

為了進(jìn)一步證實(shí)在YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡過程中是否有Cyt C由線粒體釋放至胞漿，本研究采用免疫熒光和Western blot分析相結(jié)合的方法檢測(cè)Cyt C的分布和表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y79細(xì)胞胞漿Cyt C熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，線粒體內(nèi)Cyt C表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果提示，在YM155誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡過程中確實(shí)存在Cyt C由線粒體釋放至胞漿，參與誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，YM155具有明顯抑制Y79細(xì)胞增殖的作用，誘導(dǎo)其凋亡，其誘導(dǎo)Y79細(xì)胞凋亡機(jī)制可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。至于caspase-3及其底物、多聚核糖ADP聚合酶是否參與此過程，本研究將做進(jìn)一步探討。

[1] Houston SK, Murray TG, Wolfe SQ, et al. Current update on retinoblastoma[J]. Int Ophthalmol Clin, 2011, 51(1):77-91.

[2] 黃海東， 李莉洋， 郭 穎， 等. PTEN和survivin基因在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2014, 25(1):24-26.

[3] Shehata HH, Abou Ghalia AH, Elsayed EK, et al. Detection of survivin protein in aqueous humor and serum of re-tinoblastoma patients and its clinical significance[J]. Clin Biochem, 2010, 43(4-5):362-366.

[4] Carruthers KH, Metzger G, Choi E, et al. A therapeutic role for survivin in mitigating the harmful effects of ionizing radiation[J]. Sarcoma, 2016, 2016:1830849.

[5] 陳立波. 苦參堿對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖、凋亡及Survivin 基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(15):235-238.

[6] Véquaud E, Séveno C, Loussouarn D, et al. YM155 potently triggers cell death in breast cancer cells through an autophagy-NF-kB network[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):13476-13486.

[7] Koike H, Nitta T, Sekine Y, et al. YM155 reverses rapamycin resistance in renal cancer by decreasing survivin[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2014, 140(10):1705-1713.

[8] 成小姣， 丁燕飛， 朱黎明， 等. YM155對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN28的作用及其機(jī)制研究[J]. 胃腸病學(xué), 2013, 18(2):82-85.

[9] 丁亦含， 樊曉東， 吳晶晶， 等. Survivin 抑制劑YM155 對(duì)K562 細(xì)胞凋亡和自噬的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2015, 23(2):375-380.

[10]Ferrario A, Luna M, Rucker N, et al. Targeting survivin enhances chemosensitivity in retinoblastoma cells and orthotopic tumors[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0153011.

[11]邵淑麗， 劉 銳， 隋文靜， 等. 大蒜素誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2015, 34(2):227-233.

[12]劉盛楠， 邵淑麗， 王維熠， 等. 川楝素誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37(8):1087-1094.

[13]范蕊芳， 劉玲玲， 張 玲， 等. 唑來膦酸抑制U937 細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(7):1021-1026.

[14]蔣時(shí)紅， 吳耀松， 劉 燕. 胃康舒寧促胃癌細(xì)胞凋亡機(jī)制與線粒體凋亡途徑[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(21):203-206.

[15]富 蘇， 范吉平， 王新志. 通絡(luò)化痰膠囊對(duì)H2O2所致的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(2):188-192.

[16]齊一鳴， 黃俊琪. 2型登革病毒通過線粒體途徑誘導(dǎo)EA. hy926細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013, 29(3):385-389.

[17]王立宏， 武興斌， 王 利， 等. 銀杏葉提取物對(duì)非小細(xì)胞肺癌PC-9細(xì)胞增殖的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2015, 22(5):65-68.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of survivin inhibitor YM155 on mitochondrial apoptotic pathway of retinoblastoma Y79 cells

WEI Dong1, ZHANG Xiao-juan2, LIU Jie1, SONG Qiu-ying1

(1DepartmentofOphthalmology,2DepartmentofRadiology,HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China.E-mail:songqiuying1980@qq.com)

AIM: To investigate the effects of survivin inhibitor YM155 {4,9-dihydro-1-(2-methoxyethyl)-2-methyl-4,9-dioxo-3-(2-pyrazinylmethyl)-4,9-dihydro-1H-naphtho[2,3-d]imidazolium bromide} on the apoptosis, mitochondrial membrane potential (Δψm) and cytochrome C (Cyt C) of retinoblastoma Y79 cells, and to analyze the mitochondrial mechanisms of apoptosis.METHODS: Y79 cells were culturedinvitroand treated with YM155 at concentrations of 0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 nmol/L. The cells in control group were treated without YM155. The proliferation of Y79 cells were measured by CCK-8 assay and bromodeoxyuridine (BrdU) labeling assay. Y79 cells were randomly divided into 4 groups: control group (with equal volume of RPMI-1640 nutrient medium), positive control group (10 nmol/L topotecan), low-dose (1 nmol/L) YM155 group and high-dose (2 nmol/L) YM155 group. The effects of YM155 on the apoptosis, the changes of Δψm, the mitochondrial distribution and the protein level of Cyt C in the Y79 cells were evaluated by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, JC-1 staining, immunofluorescence analysis and Western blot, respectively. RESULTS: Compared with control group, YM155 significantly inhibited the proliferation of Y79 cells and induced apoptosis (P<0.05). YM155 significantly reduced Δψmof the Y79 cells, promoted Cyt C which released from mitochondria to the cytosol and reduced the protein level of Cyt C in the mitochondria (P<0.05). CONCLUSION: YM155 inhibits Y79 cell proliferation and induces apoptosis, and the possible mechanisms may be involved in the mitochondrium-mediated apoptotic pathway.

Retinoblastoma; YM155; Apoptosis; Mitochondrial apoptotic pathway

1000- 4718(2017)01- 0026- 07

2016- 06- 27

2016- 10- 17

黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(No. JS215H623)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.005

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