嚴(yán) 笑， 張艷麗， 歐陽桂芳， 牧啟田， 盛立霞

(寧波市第一醫(yī)院血液科， 浙江 寧波 315000)

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miRNA-181a對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用*

嚴(yán) 笑， 張艷麗△， 歐陽桂芳， 牧啟田， 盛立霞

(寧波市第一醫(yī)院血液科， 浙江 寧波 315000)

目的： 通過沉默人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226中miRNA-181a的表達(dá)，觀察RPMI8226細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞周期的變化，并探討其可能的作用機制。方法: 實時熒光定量PCR檢測多發(fā)性骨髓瘤患者和健康者血清標(biāo)本中miRNA-181a的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后，CCK-8法與集落形成實驗檢測細(xì)胞的增殖能力，劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的周期變化，Western blot法檢測cyclin D1、p-PI3K和p-Akt蛋白水平的變化。結(jié)果: 多發(fā)性骨髓瘤患者血清中miRNA-181a呈高表達(dá)，顯著高于正常人；轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細(xì)胞的存活率和集落形成能力下降，遷移能力降低，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞比例增多，cyclin D1蛋白表達(dá)顯著低于正常對照組， PI3K和Akt的磷酸化水平明顯低于正常對照組。結(jié)論: 沉默miRNA-181a的表達(dá)能夠抑制RPMI8226細(xì)胞的增殖，并降低細(xì)胞的遷移能力，可能與細(xì)胞周期及PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

miRNA-181a； 多發(fā)性骨髓瘤； 細(xì)胞周期

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種來源于漿細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，患者的骨髓中克隆性漿細(xì)胞出現(xiàn)異常增生，臨床主要表現(xiàn)為貧血、腎功能損害，骨損傷以及反復(fù)感染等[1]。多發(fā)性骨髓瘤占所有腫瘤發(fā)生率的1%[2]，在全部血液系統(tǒng)惡性腫瘤中占12%～15%，并隨年齡增長而發(fā)病率逐漸增多，好發(fā)于60歲以上的老年人[3-4]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約22個堿基的非編碼RNA，根據(jù)靶基因的作用不同在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展時具有癌基因或抑癌基因的作用。近年來研究表明，某些miRNA在小鼠和人的胎盤組織中呈高表達(dá)[5]。miRNA-181a是miRNA-181家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤和自身免疫疾病方面的表達(dá)異常，引起細(xì)胞功能障礙[6]。本實驗擬通過沉默miRNA-181a對人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226增殖和遷移能力的影響，探討miRNA-181a的表達(dá)是否能為多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療具有指導(dǎo)意義。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

22例多發(fā)性骨髓瘤患者血清標(biāo)本和26例健康者血清標(biāo)本來自寧波市第一醫(yī)院血液科。人來源多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫)；胎牛血清(Gibco)；CCK-8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；miRNA-181a inhibitor(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；抗cyclin D1(Santa Cruz)、p-PI3K和p-Akt抗體(Cell Signaling Technology)。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 將人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226置于37 ℃水浴箱中快速融化，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液10 mL，800 r/min離心5 min，棄去上清，重懸后將細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至約80%～90%時傳代。

2.2 實驗分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實驗隨機分為3組：正常對照(control)組、miRNA-181a inhibitor陰性對照組(NC inhibitor組)和轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor組。在轉(zhuǎn)染前1 d，用0.25%胰酶消化RPMI8226細(xì)胞，接種于48孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor，4 h后更換新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.3 實時熒光定量PCR檢測miRNA-181a的表達(dá) 嚴(yán)格按照TRIzol說明書進行操作，提取細(xì)胞總RNA，進行蛋白定量后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR儀擴增，反應(yīng)條件為：92 ℃ 35 s, 63 ℃ 35 s, 72 ℃ 45 s，共32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。miRNA-181a的上游引物為5’-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3’，下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參照U6的上游引物為5’-CGCTTCGGCAGCACATATA-3’，下游引物為5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。實驗結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對miRNA-181a的表達(dá)進行相對定量。

2.4 CCK-8法和集落形成實驗檢測細(xì)胞的增殖能力 收集對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整密度約為每孔1×105個，接種于96孔板，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，并于12 h、24 h、36 h和48 h時分別取各時段的細(xì)胞，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3～4 h，于450 nm波長處用酶標(biāo)儀測定的吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率。存活率(%)=實驗組A值/空白組A值×100%。

收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞集落形成實驗，重懸成單個細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，接種于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加入4 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)肉眼可見的集落，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入5 mL甲醇固定15 min，加入吉姆薩溶液染色20 min，自來水沖洗，晾干，計算集落形成率。集落形成率(%)=集落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.5 劃痕實驗 收集各組細(xì)胞，以5×108/L密度接種于96孔板中，待細(xì)胞融合約90%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕，PBS洗細(xì)胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞遷移軌跡，拍照記錄。

2.6 細(xì)胞周期的測定 收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞，用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2次，棄去PBS，用預(yù)冷70%乙醇溶液重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入100 mg/L RNase A于37 ℃水浴30 min，加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS溶液500 μL，4 ℃避光孵育30 min，在流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2.7 Western blot實驗 細(xì)胞處理48 h后，收集各組細(xì)胞，加入裂解液，收集蛋白并調(diào)整蛋白濃度，后加入上樣緩沖液，上樣并通過SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，加入封閉液封閉1 h，分別孵育相應(yīng)Ⅰ抗[cyclin D1(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、PI3K(1∶4 000)、p-Akt(1∶1 000)和Akt(1∶1 000)]，4 ℃孵育過夜，洗滌3次，再次加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育30 min，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像?；叶戎挡捎肐mageJ掃描并記錄。其中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt后的相對變化量，表示磷酸化水平變化。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗結(jié)果采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組定量數(shù)據(jù)符合方差齊性要求采用單因素方差分析,各組均數(shù)間均數(shù)的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 多發(fā)性骨髓瘤患者血清標(biāo)本miRNA-181a的表達(dá)

多發(fā)性骨髓瘤患者血清中miRNA-181a的表達(dá)水平顯著高于正常血清標(biāo)本(P<0.05)，提示mi-RNA-181a在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中呈高表達(dá)。

Figure 1.The mRNA expression levels of miRNA-181a in serum from normal people (n=26) and multiple myeloma patients (n=22). Mean±SD.*P<0.05vsnormal people.

圖1 正常人與骨髓瘤患者血清中miRNA-181a的表達(dá)

2 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，正常對照組的RPMI8226細(xì)胞隨時間增加存活率迅速增加；轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細(xì)胞的存活率隨時間增加的幅度顯著低于正常對照組(P<0.05)；正常對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2。平板集落形成實驗的結(jié)果顯示，與正常對照組相比，沉默miRNA-181a后，細(xì)胞的集落形成能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

Figure 2. The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the viability of RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2 沉默miRNA-181a對細(xì)胞存活率的影響

3 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)，而正常對照組與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 3.The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the colony formation ability of RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞集落形成能力的影響

Figure 4. The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the migratory ability of RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞遷移能力的影響

4 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞周期的影響

如圖5所示，轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后，G0/G1期細(xì)胞的比例明顯減少，S期的細(xì)胞比例顯著大于正常對照組(P<0.05)，正常對照組與陰性對照組的細(xì)胞各周期比例無顯著差異。

Figure 5.The change of cell cycle in RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞周期變化的影響

5 沉默miRNA-181a對cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與正常對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后，RPMI8226細(xì)胞的cyclin D1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，正常對照組與陰性對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 6.The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the protein expression of cyclin D1 in RPMI8226 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖6 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

6 沉默miRNA-181a對PI3K和Akt磷酸化水平的影響

如圖7所示，與正常對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-181a inhibitor后RPMI8226細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的水平均顯著降低，說明沉默miRNA-181a降低PI3K和Akt的磷酸化水平(P<0.05)，正常對照組與陰性對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 7.The effect of inhibition of miRNA-181a expression on the phosphorylation of PI3K and Akt. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖7 沉默miRNA-181a對RPMI8226細(xì)胞p-PI3K和p-Akt磷酸化水平的影響

討 論

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，主要分為G0/G1期、S期、G2期和M期4個時相，其中S期是DNA合成期，G1期和G2期分別是合成前期與合成后期。Cyclin D是細(xì)胞周期進程的啟動因子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的因子之一，當(dāng)cyclin D的活性被抑制后，細(xì)胞將不能進入細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異常增殖或誘發(fā)腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1在腫瘤細(xì)胞的G1期表達(dá)增多，而在正常細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)[7]。另外，cyclin D1參與調(diào)控G1-S期的轉(zhuǎn)換以及S-G2期的轉(zhuǎn)換，研究發(fā)現(xiàn)cyclin D1在HeLa細(xì)胞株P(guān)RAD21整個細(xì)胞周期中呈高表達(dá)，提示cyclin D1在癌細(xì)胞增殖的過程中可能發(fā)揮重要的作用[8]。我們研究發(fā)現(xiàn)，可能是由于cyclin D1本來在RPMI8226細(xì)胞中表達(dá)較高，當(dāng)沉默miRNA-181a后，并沒有引起多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226 G1期的阻滯，而引起S期的阻滯，推測是沉默miRNA-181a引起了S-G2期轉(zhuǎn)換的障礙，DNA合成被抑制，從而抑制細(xì)胞的增殖。

PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞周期的調(diào)控、血管生成和細(xì)胞代謝等方面具有重要作用[9]，Akt的磷酸化是PI3K/Akt信號通路在腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵，射線、輻射和細(xì)胞毒性的藥物均可激活PI3K/Akt信號通路，使得腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激調(diào)節(jié)。Akt處于PI3K/Akt信號通路的核心位置，通過激活下游底物，從而抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期以及促進血管形成[10]。此外，研究發(fā)現(xiàn)使用PI3K/Akt抑制劑能夠抑制SDF-1α和bFGF誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移[11]。細(xì)胞遷移需要微管介導(dǎo)的細(xì)胞體收縮與伸展的一系列過程，PI3K/Akt信號通路影響多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，過表達(dá)PI3K/Akt信號通路下游分子核糖體蛋白S6激酶后，會促進卵巢癌細(xì)胞定向遷移[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，沉默miRNA-181a后，RPMI8226細(xì)胞p-PI3K和p-Akt的蛋白水平顯著下降，提示沉默miRNA-181a可能通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制細(xì)胞的增殖與遷移。

本研究表明，miRNA-181a的表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤的診斷具有提示作用，對于指導(dǎo)臨床治療方面具有參考意義。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of miRNA-181a on proliferation and migration of multiple myeloma cells

YAN Xiao, ZHANG Yan-li, OUYANG Gui-fang, MU Qi-tian, SHENG Li-xia

(DepartmentofHematology,NingboFirstHospital,Ningbo315000,China.E-mail:zhangyanlimd@126.com)

AIM: To investigate the effect of miRNA-181a inhibition on the proliferation, migration and cell cycle of the human multiple myeloma cell line RPMI8226. METHODS: Real-time PCR was used to detect miRNA-181a expression in serum samples from multiple myeloma or healthy subjects. After transfection with miRNA-181a inhibitor, the cell viability was examined by CCK-8 assay and colony formation assay. The cell migration ability was analyzed by wound healing assay. The cell cycle was detected by flow cytometry. Moreover, the protein level of cyclin D1 and the phosphorylation of PI3K and Akt were determined by Western blot. RESULTS: The expression of miRNA-181a was significantly increased in the serum from multiple myeloma patients as compared with healthy group. Inhibition of miRNA-181a expression by transfection with miRNA-181a inhibitor remarkably decreased the cell viability, migratory ability, the population of G0/G1phase and cyclin D1 protein expression in the RPMI8226 cells. However, the population of S phase and the phosphory-lation of PI3K and Akt were reduced. CONCLUSION: Down-regulation of miRNA-181a inhibits the viability and migratory ability in the RPMI8226 cells via inhibition of cell cycle and PI3K/Akt signaling pathway.

miRNA-181a; Multiple myeloma; Cell cycle

1000- 4718(2017)01- 0033- 05

2016- 07- 18

2016- 11- 04

寧波市自然科學(xué)基金資助項目 (No. 2012A610202)

R363．1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.006

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△通訊作者 Tel： 0574-87085591; E-mail: zhangyanlimd@126.com