朱慧娟

在組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，筆者帶學(xué)生做了植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，學(xué)生在后續(xù)觀察中，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)效果不理想，培養(yǎng)基污染嚴(yán)重（見(jiàn)圖1）。筆者本想通過(guò)科學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)激勵(lì)學(xué)生的探究熱情，結(jié)果卻換來(lái)班上學(xué)生的一片嘆息?？粗鴮W(xué)生那失望和惋惜的眼神，感覺(jué)學(xué)生信心受了打擊，筆者決定要找出實(shí)驗(yàn)失敗的原因。

帶領(lǐng)學(xué)生觀察已污染的培養(yǎng)基后，教師將學(xué)生再次帶到組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，回顧整個(gè)組織培養(yǎng)過(guò)程，試圖和學(xué)生一起找出實(shí)驗(yàn)失敗的原因，并對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)。

1 尋找污染的各種可能原因

1.1 回顧實(shí)驗(yàn)操作

讓學(xué)生復(fù)述實(shí)驗(yàn)操作，也以此檢驗(yàn)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)流程的掌握程度。總結(jié)如下。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前換鞋，并換上已消毒的白大褂。將接種室和超凈工作臺(tái)紫外燈提前20 min全部打開(kāi)，將風(fēng)機(jī)全部打開(kāi)，阻止外部氣體進(jìn)入接種室內(nèi)部。

（2）配置培養(yǎng)基：在配制培養(yǎng)基時(shí)，用的是MS培養(yǎng)基，用超純水溶解。為了防止焦糊，將小火間斷加熱改為在微波爐中用中火加熱5～6 min，配制過(guò)程如圖2所示。

（3）高壓蒸汽滅菌：培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶后，用高壓蒸汽滅菌鍋保持0.1～0.15 kPa（溫度121 ℃）的高壓狀態(tài)滅菌30 min。滅菌過(guò)程如圖3所示。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（1）取外植體（菊花葉）：校植物園內(nèi)有菊花，采新鮮的菊花莖若干。

（2）消毒：將采集的菊花莖先在70%酒精中浸泡10 s后用無(wú)菌水沖洗，然后用2.0%次氯酸鈉溶液消毒15 min，最后再用無(wú)菌水沖洗。具體過(guò)程如圖4所示。

（3）接種：進(jìn)入接種室，在超凈工作臺(tái)上將已消毒的菊花莖剪成若干段（剪子和鑷子都已事先高溫灼燒滅菌），取一段菊花莖接種在已滅菌冷卻的培養(yǎng)基上，如圖5所示。

（4）貼上標(biāo)簽，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度控制在18～22 ℃，如圖6所示。

1.2 引導(dǎo)學(xué)生分析造成污染的原因

針對(duì)學(xué)生回憶出的實(shí)驗(yàn)步驟，教師播放實(shí)驗(yàn)時(shí)拍攝的照片和視頻，讓學(xué)生自己去分析每一個(gè)步驟可能造成微生物污染的原因。總結(jié)如下。

1.2.1 接種和培養(yǎng)環(huán)境不清潔

盡管事先接種室和超凈工作臺(tái)的紫外燈全部都已打開(kāi)，有學(xué)生提出可能由于人多，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后，粘在人身體上的各種微生物被帶入到接種室和培養(yǎng)室。

1.2.2 培養(yǎng)基及各種使用器具滅菌不徹底

由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間有限，而高壓蒸汽滅菌整個(gè)步驟耗時(shí)將近30 min，為了學(xué)生能在有限時(shí)間完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作流程，通常采取的是用一個(gè)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，在等待滅菌的時(shí)間里繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)步驟，這樣就要求教師提前用另一高壓蒸汽滅菌鍋去準(zhǔn)備好已滅菌過(guò)的冷卻了的培養(yǎng)基，冷凝的空氣可能滴入培養(yǎng)瓶蓋上，造成污染。也有的同學(xué)根據(jù)課本提示指出在滅菌過(guò)程中，可能沒(méi)有排凈鍋內(nèi)冷空氣。鍋內(nèi)冷空氣如排放不凈，會(huì)影響滅菌效果，達(dá)不到徹底滅菌的目的。還有同學(xué)認(rèn)為滅菌所需時(shí)間達(dá)到后，切斷電源，讓滅菌鍋?zhàn)匀唤禍?，?dāng)壓力表的壓力降至零時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，可能是壓力未降到零時(shí)，就打開(kāi)了排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的液體由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。

1.2.3 外植體消毒不徹底

由于實(shí)驗(yàn)是在校園內(nèi)取材，外植體上的微生物眾多，需要徹底消毒。但是考慮到氯化汞對(duì)環(huán)境危害大，對(duì)人畜的毒性極強(qiáng)，為防止學(xué)生中毒，所以教學(xué)中并沒(méi)有選用氯化汞，消毒時(shí)選用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精浸泡10 s，然后用1.0%次氯酸鈉溶液消毒15 min。兩次都應(yīng)用無(wú)菌水沖洗，不過(guò)當(dāng)時(shí)并沒(méi)有無(wú)菌水，用超純水替代，很多學(xué)生質(zhì)疑，超純水中可能含有細(xì)菌，造成了污染。

1.2.4 接種時(shí)沒(méi)有嚴(yán)格要求無(wú)菌操作

可能接種時(shí)，學(xué)生的手沒(méi)有消毒，碰到了外植體；也可能剪刀和鑷子未放在滅菌器中灼燒滅菌。有的同學(xué)因白大褂數(shù)量不夠，沒(méi)有換掉外面的衣服，可能將附著在衣服上的外面的微生物帶入實(shí)驗(yàn)室；還有的同學(xué)完全打開(kāi)了超凈工作臺(tái)的玻璃門，將頭伸進(jìn)去，在培養(yǎng)瓶上方操作，可能頭發(fā)碰到了培養(yǎng)基，如圖7所示。

通過(guò)對(duì)照片和視頻進(jìn)行分析，學(xué)生理解了規(guī)范操作的重要性，也為后面學(xué)習(xí)微生物的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

2 通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)，排除部分因素，進(jìn)一步確定可能因素

在實(shí)驗(yàn)室對(duì)每個(gè)培養(yǎng)瓶檢查后，有位學(xué)生發(fā)現(xiàn)自己在同一時(shí)間同一地點(diǎn)用相同批次滅菌過(guò)的培養(yǎng)基接種的不同種類外植體生長(zhǎng)情況不同。一瓶接種的是校園內(nèi)取材的菊花莖，另一瓶接種的是在實(shí)驗(yàn)室取材的煙草。在組織培養(yǎng)室中教師提前已經(jīng)做了很多煙草葉的組織培養(yǎng)，部分同學(xué)因?yàn)楹闷?，自己也接種了一瓶。接種菊花莖的已經(jīng)被污染，而接種煙草的生長(zhǎng)良好，沒(méi)有污染物，如圖8所示。

該學(xué)生提出，問(wèn)題可能不在培養(yǎng)基上，主要還是外植體的消毒上?？赡苁窍緯r(shí)間太短，還有可能是要嚴(yán)格用無(wú)菌水沖洗，而不能用超純水。教師反問(wèn)學(xué)生，“顧名思義，無(wú)菌水就是將水中微生物殺死而得到的水，你覺(jué)得如何得到無(wú)菌水呢？”有學(xué)生受到高壓蒸汽滅菌的思路引導(dǎo)，提出無(wú)菌水可用自來(lái)水經(jīng)過(guò)高溫殺菌制作而成。將水加入三角瓶中，加棉塞、包扎、高壓滅菌，與培養(yǎng)基的滅菌原理相同。

3 通過(guò)圖片和材料分析，推測(cè)污染物成分

很多學(xué)生發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)瓶中污染物的成分不同，有的污染物是黑色的，有的污染物是紅色的，有的污染物是白色的。學(xué)生提問(wèn)：“這究竟是什么生物呢？是細(xì)菌還是真菌？”

教師提供信息：細(xì)菌菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色；真菌落較大，菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌落疏松，呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀、棉絮狀，無(wú)固定大小，多有光澤，不易挑，有時(shí)還呈現(xiàn)紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色（孢子的顏色）?？淳湟话愦笾驴梢苑直娉黾?xì)菌和真菌，若通過(guò)菌落分辨不出，就需要用顯微鏡鏡檢。學(xué)生根據(jù)筆者剛才提供的信息指出污染物大多是真菌，最常見(jiàn)的污染就是霉菌。為了驗(yàn)證學(xué)生的推論，筆者建議學(xué)生用鑷子取各微生物放在滴加清水的載玻片中，涂勻后蓋上蓋玻片，做成臨時(shí)裝片在顯微鏡下觀察，如圖9所示，霉菌的特點(diǎn)是有許多分生孢子，如圖10所示，看看是否能在顯微鏡下找到。

學(xué)生通過(guò)菌落與顯微鏡的觀察，得出污染物絕大多數(shù)為真菌，少部分為細(xì)菌。

4 對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，并預(yù)設(shè)各種可能

通過(guò)對(duì)現(xiàn)象的分析，大家找到了許多可能造成污染的原因，最可能的原因就是外植體消毒不徹底。接下來(lái)，將實(shí)驗(yàn)中的所有不規(guī)范的操作全部改正，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)規(guī)范來(lái)操作。如果說(shuō)第一次實(shí)驗(yàn)僅僅是為了從知識(shí)層面上讓學(xué)生對(duì)該實(shí)驗(yàn)的具體操作和高壓蒸汽滅菌的原理有所了解，那么后來(lái)的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)就是為了讓學(xué)生在情感上有所收獲：要正視科學(xué)實(shí)驗(yàn)，科學(xué)是容不得一點(diǎn)馬虎的，從而培養(yǎng)學(xué)生從小形成既求真務(wù)實(shí)又開(kāi)拓創(chuàng)新的科學(xué)態(tài)度。

5 重做實(shí)驗(yàn)，每天觀察和分析

班級(jí)學(xué)生人數(shù)太多時(shí)，班級(jí)實(shí)驗(yàn)難以開(kāi)展，很多操作不能一一指導(dǎo)。接下來(lái)，分批讓學(xué)生重做實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按要求對(duì)外植體進(jìn)行消毒，并用無(wú)菌水沖洗。當(dāng)然實(shí)驗(yàn)也可能還有失敗的，需要繼續(xù)探討原因并及時(shí)進(jìn)行改進(jìn)。

收稿日期：2016-10-30