劉濤，張英

1.廣東醫(yī)科大學研究生學院2014級3班，廣東湛江 524005；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心四區(qū)，廣東湛江 524005

乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測的研究現(xiàn)狀分析及展望

劉濤1，張英2

1.廣東醫(yī)科大學研究生學院2014級3班，廣東湛江 524005；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤中心四區(qū)，廣東湛江 524005

在現(xiàn)代生物學技術快速發(fā)展地推動下，循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）技術在臨床上得到越來越廣泛的應用。CTCs形成是導致乳腺癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個關鍵性因素,因此，實施CTCs檢測具有重要臨床意義。該綜述以臨床普遍應用的CTCs技術作為切入點，探討CTCs技術在乳腺癌診斷、療效評估、預后中的具體應用，旨在了解CTCs的研究現(xiàn)狀與不足并展望其在未來乳腺癌診治中的應用。

乳腺癌;循環(huán)腫瘤細胞;檢測;展望

乳腺癌為具有較高發(fā)病率的女性惡性腫瘤。隨著臨床診治技術和設備的不斷提高，目前，乳腺癌的臨床診斷、治療效果及預后均不斷得到提高。積極探索新的治療靶點，對療效進行有效預測，對預后效果實施科學檢測，對乳腺癌臨床診治效果的提高具有極為重要的意義。目前，國內(nèi)外均已有諸多臨床研究結果顯示，處于外周血中的循環(huán)循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）是一種實時的“液體活檢”標志物，其有可能成為對乳腺癌的療效進行實時評估的一種重要標志物[1]。加強對，乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測的研究現(xiàn)狀進行全面分析，并提出展望具有重要現(xiàn)實價值和意義。該文主要對乳腺癌臨床診治過程中CTCs檢測的研究現(xiàn)狀以及應用前景展望進行分析，現(xiàn)做如下綜述。

1 CTCs的概念和機制

CTCs為循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells）的簡稱，該概念于1896年由澳大利亞的Ashworth首次提出。Nowell與1976年對CTCs定義進行修正，將其定義為來源于轉(zhuǎn)移或原發(fā)腫瘤，存在脫離基底膜能力，且可入侵組織基質(zhì)，進而進入血管的腫瘤細胞。目前，CTCs指的是外周血中存在的相關腫瘤細胞的一個統(tǒng)稱。循環(huán)腫瘤細胞指的是因診療操作或者自發(fā)原因，由轉(zhuǎn)移灶或者實體瘤釋放出來并進入機體外周血循環(huán)中的一種腫瘤細胞，其為惡性腫瘤患者接受治療后病情復發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生的一個重要原因，同時也是使得腫瘤患者病死率不斷增加的一個重要危險因素。

CTCs的作用機制體現(xiàn)為：腫瘤轉(zhuǎn)移是導致腫瘤患者病情不斷進展，甚至死亡的一個主要原因。在病情的進展過中，腫瘤細胞逐漸侵入存在于原發(fā)腫瘤細胞附件的相關組織中，進而侵入淋巴管系統(tǒng)以及血液中，進而形成循環(huán)腫瘤細胞，并細胞被逐漸運轉(zhuǎn)至遠端相關組織中，其再發(fā)生滲出，不斷適應各種新的微環(huán)境，最后在新環(huán)境中實現(xiàn)播種、增殖、定植，最終形成轉(zhuǎn)移灶[2]。

2 CTCs檢測技術

2.1 細胞鑒定技術

2.1.1 免疫細胞化學方法（ICC）ICC的原理體現(xiàn)為抗原抗體的相互結合反應，主要通過利用單克隆抗體與單克隆抗體相關抗原或蛋白相互結合，同時憑借酶與底物相互反應顯色，或者其他的顯色方法來對腫瘤細胞是否存在進行判斷。在實際應用過程中，其敏感度在105～106范圍內(nèi)，其直觀性好，應用較為簡便[3]。但是因可代表CTCs特征的特異性抗原還尚未被發(fā)現(xiàn)，因此，現(xiàn)階段通常是使用上皮特異抗原來實現(xiàn)CTCs的分離。

2.1.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）該種方法應用原理體現(xiàn)為憑借引物擴增，同時對mRNA特異性進行檢測來實現(xiàn)對腫瘤細胞存在情況進行證實。RT-PCR在實際應用中的優(yōu)點主要體現(xiàn)為具有較高的特異性和敏感度，同時，操作相對較為簡單方便，其為對CTCs進行檢測的一種有效性較高的方法，能夠鑒別出的正常細胞為106～107。該種方法存在的不足表現(xiàn)為CTCs會遭受破壞，因此不能實現(xiàn)對CTCs實施形態(tài)學觀察，也無法實施計數(shù)、分析個別細胞等操作。文獻報道指出，目前在TR-PCR中應用最為普遍的標志物主要為hMAM、CK19和CK20[4-5]。

2.1.3 流式細胞技術 （FCM）該種技術主要是運用了腫瘤細胞特異性的標志物與標記熒光物質(zhì)的單克隆抗體二者的相互結合，促進腫瘤細胞染色，在憑借流式細胞儀實施相關測量和分析操作，F(xiàn)CM能夠?qū)嵤┒鄥?shù)測量。憑借MACS技術完成腫瘤細胞的富集之后，再選用FCM實施CTCs檢測具有更理想的敏感度[6]。

2.1.4 激光掃描細胞計量技術（LSC）LSC實質(zhì)上為一種高通量細胞分析儀，其同時具備圖像細胞儀功能和流式細胞儀功能，在應用過程中可憑借連續(xù)掃描熒光顯微鏡下的圖像，自動對所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行分析的一種方法。應用實踐顯示，該種技術可在0.5～1h的時間內(nèi)通過顯微鏡對5×104個細胞進行自動篩查。結合濃聚細胞技術與LSC兩種技術應用時，熒光染色后其敏感度得到有效提高，能夠達到在107個細胞中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞1～2個的敏感度。

2.2 富集與分離技術

①免疫磁性分離技術（IMS）：該種技術的原理表現(xiàn)為采用一種可被磁鐵吸引，同時又可與抗體載體相互結合的免疫磁珠。存在于磁珠上的抗體能夠和存在特異性抗原的細胞相互結合，形成細胞抗原-抗體-磁珠免疫復合物。該種復合物憑借磁力作用可移動，與其他物質(zhì)相互分離，進而實現(xiàn)將特異性細胞分離的目的。②濾過法（ISET）：該種方法在實際應用過程中所具有的優(yōu)點主要體現(xiàn)為敏感性相對較高，存在于表面的相關分子標記或抗原都不會受到破壞，細胞特性不會受到任何影響，可較為完整地保存細胞形態(tài)，操作過程較為簡單，對設備和技術無過高要求等。③密度梯度離心法：該種方法的基本原理體現(xiàn)為以血液中所存在的各種不同細胞密度作為根據(jù)實施分離。應用該種方法的優(yōu)點表現(xiàn)在具有較高的細胞回收率，同時對設備無較高要求，操作相對簡單，具有較高的經(jīng)濟性和實用性，易于推廣。

3 CTCs的臨床意義

3.1 在臨床分期、診斷中的應用

目前，在早期乳腺癌的臨床診斷中已經(jīng)可將CTCs檢測出來，但是存在CTCs并不是表明一定有轉(zhuǎn)移。實施CTCs檢測可促進腫瘤分期得到進一步完善。已有諸多研究結果表明，CTCs與原發(fā)腫瘤的分級、大小、周圍組織侵犯、組織類型、淋巴結轉(zhuǎn)移等均存在顯著聯(lián)系。有研究顯示，外周血中乳腺珠蛋白基因表達與腋窩淋巴結狀況二者間存在顯著相關性[7]。

3.2 在療效評估中的應用

在乳腺癌的臨床診治過程中，較多患者因術后缺乏可進行測量的病灶，無法對輔助治療效果進行有效評估。CTCs檢測的實施可為該類患者療效、病情進展評估提供新的指標和方法。有研究結果表明，與接受治療前的CTCs水平相比，患者接受治療后在每7.5 mL血能夠檢測到CTCs數(shù)量超過5個的患者，其病情的進展率會明顯大于檢測CTCs數(shù)量少于5個的患者，病情進展率會高出5倍之多[8]。

4 問題及展望

目前，CTCs檢測應用還存在一定局限性，存在問題主要體現(xiàn)如下：①目前，臨床研究還尚未發(fā)現(xiàn)乳腺癌特異標志物，現(xiàn)階段所選用的檢測標志還存在明顯缺陷，在臨床實際應用中的推廣還存在較大難度；②目前，普遍使用上皮特異抗原來直接代替腫瘤細胞特異抗原，繼續(xù)加強深入研究，積極尋找和探索更適合的腫瘤細胞標志仍為一個研究難點和重點。③臨床上還尚未對乳腺癌血行轉(zhuǎn)移具體機制進行詳細闡明，CTC釋放有可能存在間歇性，在循環(huán)過程中的腫瘤細胞往往是成群的，因此單點時間實施采樣會存在一定偏倚；④乳腺癌患者多數(shù)CTC均是在血循環(huán)的過程中很快就凋亡，因此，在臨床檢測過程中所能夠檢測出CTC有可能并非轉(zhuǎn)移灶形成，僅有極少部分表型CD44+/CD24-的腫瘤細胞能夠形成腫瘤[9]。⑤對患者抽取的外周血存在相同的容積，但是檢測所用的方法卻不相同，選用的上皮腫瘤細胞標志物也不相同；⑥當腫瘤細胞處于靜息休眠狀態(tài)時，在外周血無法檢測得到轉(zhuǎn)移細胞,在這種情況下，選用任何一種方法進行檢測均會出現(xiàn)假陰性或假陽性的問題[10]。⑦目前，CTCs檢測標準還尚未形成國際標準相關研究結果的橫向比較還很難實現(xiàn)。

通過對CTCs的受體狀態(tài)進行分析，可為患者輔助治療方案的確定提供更加有價值的參考依據(jù)，使患者真正能夠接受個性化治療。所以，在將來，對乳腺癌患者實施綜合治療的過程中將會更加注重對CTCs的存在及CTCs具有的特性進行全面考慮。由此可見，對乳腺癌患者實施外周血CTCs檢測擁有良好的應用前景。

[1]俞泓波,劉勝.關于循環(huán)腫瘤細胞在乳腺癌轉(zhuǎn)移及個體化治療方面研究現(xiàn)狀的探討[J].中國實用醫(yī)藥,2014,9(17):241-242.

[2]劉平,魏子白,于俊巖,等.CellSearch檢測循環(huán)腫瘤細胞對轉(zhuǎn)移性乳腺癌預后的Meta分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2014,8(23):4244-4245.

[3]馬磊,伍思培,鄧旭斌,等.D-CIK治療抑制進展期乳腺癌中循環(huán)腫瘤細胞的初步研究[J].海南醫(yī)學,2014,25(13):1884-1885.

[4]陳小松,沈坤煒.乳腺癌“液體活檢”:血清標志物與循環(huán)腫瘤細胞的檢測[J].分子診斷與治療雜志,2012,4(6):410-411.

[5]馬磊,伍思培,鄧旭斌,等.D-CIK治療抑制進展期乳腺癌中循環(huán)腫瘤細胞的初步研究[J].海南醫(yī)學,2014,25(13):1884-1885.

[6]解繼平,張岷,方紅,等.循環(huán)腫瘤細胞檢測在不同轉(zhuǎn)移灶晚期乳腺癌中的應用研究[J].大連醫(yī)科大學學報,2015,37(5):493-494.

[7]楊瑩,王峻峰,李鵬.循環(huán)腫瘤細胞檢測在胰腺癌早期診斷中的作用[J].世界華人消化雜志,2016,24(18):2839-2840.

[8]劉芊,江澤飛.循環(huán)腫瘤細胞人表皮生長因子受體2的檢測對乳腺癌診治意義的研究進展[J].中華乳腺病雜志：電子版,2012,6(2):190-191.

[9]馬春華,姜镕,呂遠,等.免疫FISH技術檢測腦脊液中循環(huán)腫瘤細胞在肺癌腦膜轉(zhuǎn)移診斷中的應用[J].中國腫瘤臨床,2015,42(13):653-654.

[10]龔麗,鄒天寧.乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細胞在預后和疾病進展中的作用[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2013,21(8):1895-1896.

Analysis and Outlook of Circulating Tumor Cells Detection Research on Breast Cancer

LIU Tao1，ZHANG Ying2
1.Class 3 Grade 2014,Graduate School,Guangdong Medical University,Zhanjiang,Guangdong Province,524005 China；2.Guangdong Medical University Affiliated Hospital Cancer Center Fourth District,Zhanjiang,Guangdong Province,524005 China

With the rapid development of modern biology technology,the circulating tumor cells (CTCs)technology has been more widely used in clinical practice.CTCs formation is a key factor leading to the transfer of breast cancer;therefore,the implementation of CTCs detection has key clinical significance.This paper regards the CTCs technology as the starting point and tries to explore its practical application in breast cancer diagnosis,curative effect evaluation and prognosis,aiming at acquiring the current situation as well as the limitations of CTCs research and putting forward the prospects of its application in clinical diagnosis and treatment of breast cancer.

Breast cancer;Circulating tumor cells;Detection;Outlook

R737

A

1672-5654（2017）07（c）-0183-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.21.183

2017-04-27）

劉濤（1980-），男，湖南湘潭人，本科，醫(yī)師，研究方向：乳腺癌的診治。

張英（1964-），女，廣東高州人，碩士，主任醫(yī)師，研究方向乳腺癌，惡性淋巴瘤等臨床常見腫瘤的化學治療及綜合治療，E-mail:1374202704@qq.com。