柳海平++周明旺++李盛華++陳威++葉丙霖++郭鐵峰++陳嫻

摘要：目的 探討酒精性股骨頭壞死（AIONFH）高發(fā)中醫(yī)體質(zhì)類型痰濕質(zhì)與CYP2C8基因多態(tài)性關(guān)系。方法 選取2014年2月-2015年9月于甘肅省中醫(yī)院門診及住院部漢族非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（NONFH）患者152例，其中AIONFH患者50例作為病例組，同期納入無血緣關(guān)系的健康志愿者45人作為對(duì)照組，建立所有患者及志愿者病例資料數(shù)據(jù)庫(kù)。判定AIONFH患者中醫(yī)體質(zhì)類型，采用溶液型DNA提取試劑盒提取DNA，檢測(cè)DNA濃度及純度，采用普通PCR擴(kuò)增出目的片段，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的目的基因，并確認(rèn)其片段長(zhǎng)度，進(jìn)行目的基因測(cè)序，結(jié)合凝膠電泳及基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出AIONFH痰濕質(zhì)、非痰濕質(zhì)患者與對(duì)照組的CYP2C8基因多態(tài)性與AIONFH發(fā)病關(guān)系。結(jié)果 比較病例組與對(duì)照組的CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)多態(tài)性，2組各基因型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.253，P>0.05）；2組等位基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.077，P>0.05）；病例組CC基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的1.37倍（95%CI：0.339～5.540），兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。AIONFH痰濕質(zhì)患者與非痰濕質(zhì)、對(duì)照組的基因型及等位基因分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)多態(tài)性A/C突變與痰濕質(zhì)AIONFH的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯聯(lián)系，未發(fā)現(xiàn)CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)多態(tài)性與AIONFH明確關(guān)系。

關(guān)鍵詞：酒精性股骨頭壞死；中醫(yī)體質(zhì)；痰濕質(zhì)；基因多態(tài)性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.007

中圖分類號(hào)：R274.94 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）01-0023-05

Study on Alcohol-induced Osteonecrosis of Femoral Head of Phlegm-dampness Constitution with CYP2C8 Gene Polymorphism LIU Hai-ping， ZHOU Ming-wang， LI Sheng-hua， CHEN Wei， YE Bing-lin， GUO Tie-feng， CHEN Xian （Gansu Province Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To study the relation between alcohol-induced osteonecrosis of femoral head （AIONFH） related with high morbidity TCM constitution type with CYP2C8 gene polymorphisms. Methods Totally 152 Han nationality NONFH cases from Feburary 2014 to September 2015 from outpatient and the inpatient departments in Gansu Province Hospital of TCM were collected. 50 AIONFH cases were set as medical case group； meanwhile， 45 healthy volunteers were enrolled as control group. Database for medical materials of all patients and volunteers was established. TCM distribution for AIONFH patients was determined. Solution DNA extraction kit was used to extract DNA， and detect the concentration and purity of DNA. The target gene was amplified by PCR and the target gene was amplified by gel electrophoresis. The length of the fragment was confirmed to conduct target gene sequencing. With the results of sequencing and gel electrophoresis， the relation of AIONFH with CYP2C8 gene polymorphism in AIONFH patients with phlegm-dampness syndrome and the control group. Results The CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism was not statistically significant between the two groups （χ2=0.253， P>0.05）. There was no significant difference in allele between the two groups （χ2=0.077，P>0.05）. The risk of disease in CC

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81473712）；甘肅省自然科學(xué)基金（1308RJZA189）

通訊作者：周明旺，E-mail：15117192717@163.com

genotype was 1.37 times higher than the AA genotype （95%CI： 0.339-5.540）， without statistical significance （P>0.05）. There was no significant difference in genotype and allele distribution between AIONFH patients with phlegm-dampness and non-phlegm-dampness and the control group （P>0.05）. Conclusion CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism A/C mutation has no obvious relation with AIONFH risk. There is no clear relationship between CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism with AIONFH.endprint

Key words： alcohol-induced osteonecrosis of femoral head； TCM constitution； phlegm-dampness constitution； gene polymorphism

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（n-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH），又稱股骨頭缺血性壞死，屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨蝕”等范疇。NONFH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，激素、酒精、鐮狀紅細(xì)胞病、代謝性疾病、腫瘤、腎臟移植等均與NONFH的發(fā)生有一定聯(lián)系。即使有上述諸多因素影響，也僅有部分患者發(fā)生NONFH，部分個(gè)體未出現(xiàn)任何早期癥狀[1]。這種現(xiàn)象逐漸受到重視，其中，用基因多態(tài)性學(xué)說來解釋上述現(xiàn)象逐漸得到眾多學(xué)者青睞。

對(duì)酒精性股骨頭壞死（alcohol-induced osteonecrosis of femoral head，AIONFH）患者中醫(yī)體質(zhì)類型深入研究發(fā)現(xiàn)，其高發(fā)體質(zhì)為痰濕質(zhì)[1]。痰和濕是較為常見的病理產(chǎn)物和致病因素，可逐漸引起以“黏滯重濁”為主要表現(xiàn)的體質(zhì)特征[2]，極易引起脂質(zhì)代謝紊亂和血液黏滯性增加等異常狀態(tài)，可能成為AIONFH發(fā)病的高危因素[3]。痰濕質(zhì)與男性過量飲酒、過食膏粱厚味有密切聯(lián)系[4]。目前，NONFH基因多態(tài)性研究主要集中于患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的相關(guān)基因、脂代謝相關(guān)基因等，尚缺乏藥物代謝相關(guān)基因CYP450家族的基因多態(tài)性研究。因此，筆者利用基因多態(tài)性尋找該疾病的易感基因，探索易感基因與高發(fā)中醫(yī)體質(zhì)類型之間可能存在的內(nèi)在分子生物學(xué)聯(lián)系，為預(yù)防AIONFH提供新的思路與方法，并為治療提供一定的理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象

病例來源于2014年2月-2015年9月本院門診及住院部的漢族NONFH患者。共收集152例患者病歷資料及血液標(biāo)本，建立所有患者及健康志愿者資料數(shù)據(jù)庫(kù)。其中AIONFH患者50例為病例組，痰濕質(zhì)31例，非痰濕質(zhì)19例，男性46例，女性4例，年齡20～70歲，平均年齡（43.3±11.2）歲；同期收集本院健康體檢中心體檢的健康志愿者45人為對(duì)照組，男性35人，女性10人，年齡18～65歲，平均年齡（39.8±10.6）歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

NONFH診斷標(biāo)準(zhǔn)包括臨床表現(xiàn)、MRI檢查、X線檢查、CT檢查、核素骨掃描等6項(xiàng)，患者具有股骨頭壞死的臨床癥狀且具有其他輔助檢查的任意1項(xiàng)，即可診斷[5]。AIONFH的診斷標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)蝹?cè)或雙側(cè)股骨頭壞死、無外傷史、明確長(zhǎng)期大量飲酒史（每周飲酒量≥320 mL）[6]。

1.3 中醫(yī)體質(zhì)判定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[7]標(biāo)準(zhǔn)判定。痰濕質(zhì)多由水液內(nèi)停、痰濕凝聚引起，主要表現(xiàn)為腹部肥滿、容易困倦、喜食肥甘醇酒、口黏、痰多、胸悶、多汗且黏、身重不爽等。本研究中非痰濕質(zhì)指除痰濕質(zhì)以外的其他8種體質(zhì)，包括平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽(yáng)虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括不同病變程度及治療方式；②年齡18～70歲；③長(zhǎng)期大量飲酒史；④愿意接受病例調(diào)查、血液標(biāo)本采集，能有效配合隨訪者。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

①有明顯髖部外傷史并確診為創(chuàng)傷性股骨頭壞死者；②病例調(diào)查及血液標(biāo)本采集過程中不愿繼續(xù)配合者；③合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、髖臼發(fā)育不良等累及髖關(guān)節(jié)疾病者；④合并嚴(yán)重心腦血管病變或其他嚴(yán)重的代謝異常疾病及骨腫瘤者；⑤精神疾病、智力障礙或無法理解并配合調(diào)查者。

1.6 剔除及脫落標(biāo)準(zhǔn)

①依從性不佳，未能按要求完成病例調(diào)查者；②病例調(diào)查表中一般信息缺失且缺失項(xiàng)目>20%者；③病例調(diào)查表關(guān)鍵信息不完整，無法判斷具體體質(zhì)者。

2 方法

2.1 血液標(biāo)本采集

用含EDTA抗凝劑的無菌管采集患者空腹外周血3 mL，及時(shí)混勻并盡快保存至-80 ℃冰箱。在使用血液標(biāo)本前，避免反復(fù)凍融，以免引起DNA提取量嚴(yán)重降低。

2.2 血液DNA提取及其濃度與純度檢測(cè)

全血DNA提取采用北京百泰克基因提取試劑盒（溶液型），DNA濃度及純度測(cè)定在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定260、280 nm吸光度值（OD）。DNA濃度=50 μg/mL×OD260×稀釋倍數(shù)；根據(jù)OD260/OD280數(shù)值判斷所提取的DNA純度，正常檢測(cè)結(jié)果應(yīng)介于1.8～1.9之間。

2.3 PCR擴(kuò)增

2.3.1 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[8]，確定CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度176 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并通過UCSC In-Silico PCR和NCBI BLAST驗(yàn)證。引物序列上游：5'-ACGTTGGATGACACTGATTTCCCTCAA

GGT-3；下游：5'-ACGTTGGATGCTGAAGTAAATGA TTCTATG-3。CYP2C8-F（GC：46.7%；TM：64.8；加35 μL buffer后濃度100 μmol/L的儲(chǔ)存液）；CYP2C8-R（GC：36.7%；TM：60.7；加32 μL buffer后濃度100 μmol/L的儲(chǔ)存液）。

2.3.2 PCR反應(yīng)體系 經(jīng)過多次試驗(yàn)驗(yàn)證，本研究PCR反應(yīng)最終選擇的反應(yīng)體系為25 μL（見表1）。加樣結(jié)束后，將EP管放入離心機(jī)進(jìn)行瞬時(shí)離心，盡量減少管壁附著。

注：模板DNA使用量為10 pg～1 μg

2.3.3 PCR反應(yīng)條件 根據(jù)引物和2×Taq PCR MasterMix說明書提供的條件進(jìn)行綜合、修改，最終選擇反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性49 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。endprint

2.3.4 DNA凝膠電泳檢測(cè) 對(duì)已經(jīng)擴(kuò)增出來的PCR產(chǎn)物可進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證是否為目的產(chǎn)物（電泳結(jié)束后采用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，通過DNA Marker比對(duì)條帶位置、清晰度大概判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度和純度）。產(chǎn)物在送出測(cè)序前盡量保存在-20 ℃冰箱，并盡量避免反復(fù)凍融，以免影響DNA測(cè)序結(jié)果。

使用電子分析天平精確稱取瓊脂糖，配制成2%瓊脂糖溶液，輕輕搖勻或用磁力攪拌器混勻，緩慢倒入制膠槽，盡量靠近固定邊緣倒入，避免產(chǎn)生氣泡或引起膠板過厚影響檢測(cè)準(zhǔn)確度；用微量移液器吸取5 μL DNA Marker加入樣品槽，調(diào)整電壓為120 V，20 min后停止電泳，取出凝膠，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并觀察。全部樣品送至上海生工進(jìn)行提純并測(cè)序。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 —x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示（百分率或構(gòu)成比），采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算相應(yīng)OR值及95%可信區(qū)間（CI）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 電泳結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1。

3.2 CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)A/C基因測(cè)序

CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)A/C共檢出3種基因型：AA基因型、AC基因型、CC基因型。

3.3 各組CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)多態(tài)性比較

3.3.1 病例組與對(duì)照組比較 比較病例組與對(duì)照組的CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)多態(tài)性，2組各基因型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.253，P>0.05）；病例組與對(duì)照組比較，等位基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.077，P>0.05）；病例組CC基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的1.37倍（95%CI：0.339～5.540），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。提示CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)NONFH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯影響。

3.3.2 痰濕質(zhì)患者與對(duì)照組比較 痰濕質(zhì)患者與對(duì)照組基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.317，P>0.05），等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.012，P>0.05）；痰濕質(zhì)患者CC基因型的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的1.5倍（95%CI：0.321～7.008），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

3.3.3 非痰濕質(zhì)患者與對(duì)照組比較 非痰濕質(zhì)患者與對(duì)照組基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.056，P>0.05；χ2=0.099，P>0.05），見表4。

3.3.4 痰濕質(zhì)、非痰濕質(zhì)患者比較 痰濕質(zhì)與非痰濕質(zhì)患者基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.475，P>0.05；χ2=0.000，P>0.05），見表5。

4 討論

AIONFH作為NONFH比較常見的一種類型，常因長(zhǎng)期、大量飲酒引發(fā)。早在1972年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)飲酒與股骨頭壞死之間存在著重要關(guān)系，該研究指出，每周飲酒量400～1000 mL的NONFH發(fā)生率是<400 mL人群的3倍，當(dāng)飲酒量>1000 mL時(shí)，其NONFH的發(fā)生率是<400 mL人群的5倍之多[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，AIONFH患者大多存在酗酒或近期內(nèi)大量飲酒史，部分患者在長(zhǎng)期飲酒數(shù)年內(nèi)可能出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)髖關(guān)節(jié)不適癥狀[9]。隨著近年來飲酒人群的不斷增加[10]，AIONFH的發(fā)病率可能呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，不排除超過激素成為引發(fā)NONFH的最常見因素的可能[3]。至今AIONFH的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，嚴(yán)重阻礙疾病的治療，預(yù)防該病顯得愈加重要。

CYP450是肝酶最常見的一種酶系，主要通過影響體內(nèi)幾乎所有的脂溶性藥物在肝臟內(nèi)的代謝過程，目前在人體鑒別出12種以上CYP450亞族，其中人體藥物代謝酶的CYP亞族主要為CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。近年來關(guān)于上述幾種常見亞型的基因多態(tài)性研究相對(duì)較多，研究發(fā)現(xiàn)上述多種亞型的基因多態(tài)性與疾病發(fā)生存在重要聯(lián)系。如Brunner-Ziegler S等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9基因突變的患者股骨頸部位的骨密度較常人明顯降低，且CYP2C9基因突變型患者患有骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)比常人高出4倍，并且CYP2C9亞族CYP2C9*2和CYP2C9*3對(duì)抗凝藥物較常人敏感，上述機(jī)制可能與股骨頭壞死的發(fā)生具有一定聯(lián)系。Iwakiri K等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4低活性可能引起股骨頭壞死并對(duì)其發(fā)展產(chǎn)生重要影響。

CYP2C8作為CYP450家族中的重要一員，近年來關(guān)于其基因多態(tài)性的研究相對(duì)較少。Yi X等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C8基因位點(diǎn)rs17110453的多態(tài)性與人體局部缺血性疾病有重要聯(lián)系，并且該位點(diǎn)的突變可明顯提高其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。鑒于近年來眾多學(xué)說認(rèn)為NONFH的發(fā)生與局部的缺血存在重要關(guān)系[13]，本課題研究CYP2C8的基因多態(tài)性與痰濕質(zhì)AIONFH的相關(guān)性，旨在明確CYP2C8的多態(tài)性與AIONFH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否具有一定關(guān)聯(lián)，并在此基礎(chǔ)上了解容易引起局部缺血的痰濕質(zhì)[3]與AIONFH之間的分子生物學(xué)基礎(chǔ)和上述因素之間的重要聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組的基因型、等位基因差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)的基因多態(tài)性對(duì)AIONFH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯影響。痰濕質(zhì)患者與對(duì)照組基因型及等位基因分布分析結(jié)果顯示，CYP2C8基因rs17110453位點(diǎn)的多態(tài)性與痰濕質(zhì)無直接關(guān)系。

上述研究結(jié)果并不能完全說明CYP2C8基因多態(tài)性與AIONFH痰濕質(zhì)患者之間沒有必然聯(lián)系。其原因可能有以下幾點(diǎn)：①本項(xiàng)研究的結(jié)果建立在50例AIONFH的基礎(chǔ)上，可能樣本量過小，對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚，從而影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性；②CYP2C8基因存在眾多可能致病的位點(diǎn)，本研究所選擇的rs17110453位點(diǎn)可能與該病的相關(guān)性較弱，不排除該基因其他相關(guān)位點(diǎn)與痰濕質(zhì)AIONFH存在重要聯(lián)系，需要進(jìn)一步選取更多的樣本、位點(diǎn)進(jìn)行研究；③CYP2C8作為CYP450家族中比較重要的一種亞型，該基因可能在人體的代謝作用與酒精之間的關(guān)系不夠緊密或者沒太大影響，從而出現(xiàn)該基因位點(diǎn)的多態(tài)性與AIONFH無顯著關(guān)系。endprint

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（收稿日期：2016-04-27）

（修回日期：2016-05-11；編輯：季巍?。〆ndprint