齊越++秦文艷++康凱++姜鴻++李昭++王亞斌++賈冬

摘要：目的 觀察溫郁金揮發(fā)油對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠tau蛋白磷酸化的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 60只昆明種小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溫郁金揮發(fā)油低劑量組、溫郁金揮發(fā)油高劑量組、鹽酸多奈哌齊組和參枝苓組，海馬組織注射Aβ25-35制作AD小鼠模型，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)15 d。末次給藥后，免疫組化檢測(cè)小鼠tau蛋白磷酸化位點(diǎn)（Ser 404和Thr 231）的蛋白表達(dá)，Western blot 檢測(cè)tau蛋白磷酸化位點(diǎn)及磷脂酰肌醇-3-激酶信號(hào)/蛋白激酶B（PI3K/Akt）的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組tau蛋白磷酸化位點(diǎn)蛋白表達(dá)增加（P<0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，溫郁金揮發(fā)油高劑量組tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明顯降低（P<0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 溫郁金揮發(fā)油可降低模型小鼠tau蛋白磷酸化水平，其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號(hào)途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞：溫郁金揮發(fā)油；阿爾茨海默病；tau蛋白；磷脂酰肌醇-3-激酶信號(hào)/蛋白激酶B；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.012

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）01-0045-04

Effects of Wenyujin Essential Oil on tau Protein Phosphorylation in Mice with Aβ-induced Alzheimer Disease through PI3k/Akt Pathway QI Yue1， QIN Wen-yan1， KANG Kai2， JIANG Hong1， LI Zhao2， WANG Ya-bin2， JIA Dong2 （1. Department of Pharmacology， The Second Hospital Affiliated to Liaoning Chinese Medical University， Shenyang 110034， China； 2. Laboratory Center， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Wenyujin essential oil on tau protein phosphorylation in mice with Alzheimer Disease （AD）； To discuss the relevant mechanism of action. Methods Sixty Kunming mice were divided into six groups randomly： sham-operation group， model group， Wenyujin essential oil low- and high-dose group， donepezil group and Shenzhiling group. β-Amyloid protein （Aβ25-35） was infused into the hippocampal of mice. Mice in each group were given relevant medicine for gavage for 15 d. After the last administration， immunohistochemistry was used to detect the expressions of tau protein phosphorylation points （Ser 404 and Thr 231）. Western blot was used to detect tau protein phosphorylation points and the expression of PI3K/Akt protein. Results Compared with sham-operation group， tau protein phosphorylation points in the model group increased （P<0.05）， but the phosphorylation levels of PI3K and Akt decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model group， tau protein phosphorylation （Thr231 and Ser404） in Wenyujin essential oil high-dose group decreased significantly （P<0.05）， and the phosphorylation levels of PI3K and Akt increased （P<0.01）. Conclusion Wenyujin essential oil can inhibit tau protein phosphorylation in mice. The possible mechanism may be related to the PI3K/Akt signal pathway.

Key words： Wenyujin essential oil； Alzheimer disease； tau protein； PI3K/Akt； miceendprint

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)-重大新藥創(chuàng)制（2012ZX09102201-005）

通訊作者：賈冬，E-mail：jiadg2003@126.com

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶力減退、行為異常和認(rèn)知功能發(fā)生障礙為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病[1]，其主要的病理特征為老年斑沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和tau蛋白磷酸化。tau蛋白是微管相關(guān)蛋白，含量占整個(gè)蛋白家族的80%，與微管的組裝和穩(wěn)定密切相關(guān)，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)元極性形成、軸突的通信傳導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)染兄陵P(guān)重要的作用[2-3]。溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling為姜科姜黃屬植物的干燥塊根，在我國資源豐富，價(jià)格低廉，具有活血行氣、破瘀、清心解郁之功效。課題組前期研究表明，溫郁金揮發(fā)油可改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，減輕神經(jīng)元的損傷，但其作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察溫郁金揮發(fā)油對(duì)AD模型小鼠tau蛋白磷酸化的影響，探討其相關(guān)的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠60只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（遼）2010-0001。飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫20～23 ℃，濕度50%～60%，自由飲水進(jìn)食。

1.2 藥物

溫郁金購自浙江溫州，經(jīng)遼寧省中醫(yī)藥研究院藥學(xué)室尤獻(xiàn)民研究員鑒定為正品，符合2010年版《中華人民共和國藥典》項(xiàng)下規(guī)定。揮發(fā)油提?。喝赜艚鹚幉? kg，加水6000 mL，提取揮發(fā)油8 h，收得揮發(fā)油4.5 mL，遼寧省中醫(yī)藥研究院制劑中心制備，藥液置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒅呖诜?，山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司，批號(hào)5250101；鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號(hào)140606A。

1.3 主要試劑與儀器

Aβ25-35（Sigma公司），tau-5（Invitrogen 公司），rabbit anti-phospho-tau（Thr231）抗體、rabbit anti- phospho-tau（Ser404）、rabbit anti-PI3K p85抗體、rabbit anti-phospho-PI3 K抗體、rabbit anti-phospho-Akt抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Akt抗體，Santa公司；抗β-actin鼠單克隆抗體，康為世紀(jì)生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；即用型SABC（兔IgG）試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；水合氯醛，天津市津東試劑廠。DW-200腦立體定位儀（成都泰盟科技公司），TD1002B電子臺(tái)秤（四川中泯科技公司），Western blot電泳儀（美國BIO-RAD公司），BX51顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

參照文獻(xiàn)[4]方法并加以改進(jìn)，小鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，固定于腦立體定位儀上。頭部皮膚常規(guī)碘酒、酒精消毒，沿顱骨中線切開約2 cm切口，確定囟門位置，囟門后0.5 mm、旁開1 mm距離移動(dòng)微量進(jìn)樣器，進(jìn)針3 mm，注入3 μL老化的Aβ25-35，2 min內(nèi)緩慢注入側(cè)腦室內(nèi)，留針5 min，創(chuàng)口處涂抹青霉素鈉粉，肌注青霉素鈉注射液，鼠籠飼養(yǎng)，注意保暖。假手術(shù)組注入等量生理鹽水。

2.2 分組及給藥

手術(shù)后第2日，除假手術(shù)組外，其余小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、鹽酸多奈哌齊組（1.3 mg/kg）、參枝苓組（2.6 mL/kg）和溫郁金低劑量組（6.0 mg/kg）、溫郁金高劑量組（18.0 mg/kg），每組10只。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。給藥體積為20 mL/kg，每日1次，連續(xù)15 d。

2.3 免疫組化檢測(cè)小鼠tau蛋白磷酸化位點(diǎn)（Ser404和Thr231）的表達(dá)

末次給藥后1 h，每組取小鼠6～7只，腹腔注射3.5%水合氯醛10 mL/kg麻醉，臥倒后剪開胸腔，暴露心臟，將輸液針經(jīng)心尖刺入左心室，右心耳處剪一小口，先用預(yù)冷生理鹽水快速灌注，待右心房流出液體變透明時(shí)，將輸液針連接至預(yù)冷的4%多聚甲醛，先快后慢灌注，直至肝臟發(fā)白、四肢及尾巴抽搐、僵硬時(shí)，斷頭取腦，4%多聚甲醛4 ℃固定，常規(guī)制作成5 μm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水，高壓修復(fù)，5%BSA封閉，滴加一抗，4 ℃過夜，PBS洗滌后，滴加二抗，DAB顯色，鏡下觀察。每只各取10張冠狀切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，陽性結(jié)果為細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)棕黃色顆粒，用JEOA 801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組陽性細(xì)胞平均光密度值。

2.4 Western blot檢測(cè)小鼠tau蛋白磷酸化位點(diǎn)（Ser404和Thr231）及PI3K/Akt蛋白表達(dá)

末次給藥后1 h，每組取3只小鼠快速斷頭，冰上分離海馬，稱重。小鼠海馬經(jīng)蛋白裂解液裂取后提取總蛋白，BSA法測(cè)定蛋白濃度，10%凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育，4 ℃靜置過夜。PBS洗滌后加入二抗孵育，再次洗滌后加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，借助凝膠成像系統(tǒng)觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)。用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用Fisher's LSD。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果endprint

4.1 溫郁金揮發(fā)油對(duì)小鼠海馬組織tau蛋白磷酸化（Thr231和Ser404）表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織p-tau（Thr231和Ser404）蛋白陽性表達(dá)顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，溫郁金高劑量組、鹽酸多奈哌齊組、參枝苓組小鼠腦組織p-tau（Thr231和Ser404）蛋白陽性表達(dá)顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見圖1、圖2、表1。

4.2 溫郁金揮發(fā)油對(duì)小鼠海馬組織tau蛋白（Thr231和Ser404）、PI3K及Akt磷酸化表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬組織tau（Thr231和Ser404）磷酸化水平明顯升高，PI3K和Akt磷酸化水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，溫郁金高劑量組tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明顯降低、PI3K和Akt磷酸化水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2、圖3。

5 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”范疇。雖病位在腦，但與腎關(guān)系密切，年邁者易腎精虧虛，致髓?？仗摚駲C(jī)失用而成癡呆。另一方面，人至暮年，臟腑虛衰，氣血虧損，導(dǎo)致氣虛血瘀；情志不暢，肝失疏泄，導(dǎo)致氣滯血瘀，血瘀導(dǎo)致臟腑化生的氣血不能充養(yǎng)元神之府，腦失所養(yǎng)而成癡呆。因此，中醫(yī)把補(bǔ)腎益精、活血通絡(luò)作為治療AD的主要方法。有研究表明，以郁金為主要組分的方劑治療AD，可明顯改善AD患者的認(rèn)知和日常生活能力[5]。提示郁金單獨(dú)作用可能具有潛在的抗AD作用。

tau蛋白過度磷酸化是AD的主要病理特征之一，過度磷酸化的tau蛋白容易聚合形成不溶性纖維絲，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元形態(tài)、軸突的通信傳導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫娈a(chǎn)生影響[6-7]，甚至造成神經(jīng)元丟失，造成神經(jīng)退行性病變。tau蛋白上與AD相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)有Thr181、Thr231、Ser262、Ser199、Ser396和Ser404等。因此，檢測(cè)tau蛋白在Thr231和Ser404等位點(diǎn)的磷酸化情況，可以反映AD的輕重程度。免疫組化結(jié)果顯示，注射Aβ后，小鼠腦組織tau蛋白Thr231和Ser404位點(diǎn)過磷酸化的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，溫郁金揮發(fā)油干預(yù)后，小鼠腦組織tau蛋白Thr231和Ser404位點(diǎn)過磷酸化的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，說明溫郁金揮發(fā)油可以減少神經(jīng)細(xì)胞中tau蛋白Thr231和Ser404位點(diǎn)的過磷酸化。

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原及蛋白質(zhì)合成與分解等多種細(xì)胞功能[8-9]?；罨腜I3K/Akt通過磷酸化多種下游因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過程[10]。Schubert M等[11]發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)不足將導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化，表明PI3K/Akt在調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織PI3K和Akt的磷酸化水平降低，而tau蛋白（Thr231和Ser404）的磷酸化水平升高，可能的原因是Aβ抑制了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，Akt對(duì)tau蛋白激酶的抑制不足，使其活性增加，從而使tau蛋白的Thr231及Ser404位點(diǎn)磷酸化。溫郁金揮發(fā)油干預(yù)后，小鼠腦組織PI3K和Akt磷酸化水平升高，而tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平降低，表明溫郁金揮發(fā)油降低Aβ致AD小鼠tau蛋白的磷酸化水平，推測(cè)其作用機(jī)制是激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制tau蛋白激酶的活性，從而抑制其對(duì)tau蛋白的過度磷酸化。

綜上，溫郁金揮發(fā)油可降低AD模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元tau蛋白Ser404和Thr231位點(diǎn)的過磷酸化，其機(jī)制可能與上調(diào)PI3K/Akt通路磷酸化水平有關(guān)。

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（收稿日期：2016-07-05）

（修回日期：2016-07-29；編輯：華強(qiáng)）endprint