許英民

（黑龍江省鐵力市172信箱，黑龍江 鐵力 152500）

雉雞多殺性巴氏桿菌的分離及其藥敏試驗

許英民

（黑龍江省鐵力市172信箱，黑龍江 鐵力 152500）

對黑龍江省鐵力市某珍禽養(yǎng)殖場發(fā)生疑似禽巴氏桿菌病對發(fā)病雉雞進行了細菌分離，通過染色、鏡檢與生化特性等試驗鑒定為多殺性巴氏桿菌。經(jīng)菌株的藥敏試驗以及致病性試驗，結(jié)果表明對頭孢噻呋、氟苯尼考、新生霉素、復方新諾明、三甲氧芐胺嘧啶為敏感藥，對氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、鏈霉素不敏感。

雉雞；多殺巴氏桿菌；鑒定；藥敏試驗

巴氏桿菌病又稱禽霍亂、禽出血性敗血癥，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種侵害家禽和野禽的接觸性傳染病，可引起禽類的急性死亡。臨床癥狀表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高，是對養(yǎng)禽業(yè)危害非常嚴重的傳染病之一。從2012～2015年禽巴氏桿菌病例發(fā)生的比較多，而且出現(xiàn)了新的流行特點，如發(fā)病的家禽品種從蛋雞、肉雞、鴨、鵝到肉鴿、灰雁、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥及雉雞等特禽；發(fā)病禽的日齡趨于小齡化，藥物控制難度大，經(jīng)濟損失也有所增加。

2016年3月下旬，黑龍江省鐵力市某林業(yè)局一林業(yè)經(jīng)營所某珍禽養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)雉雞740只，已開始產(chǎn)蛋，最近幾天發(fā)現(xiàn)有的山雞開始發(fā)病，表現(xiàn)為食欲廢絕，精神萎靡，排出黃綠色糞便，開始零星死亡，而后死亡率迅速增加，每天死亡雉雞5～8只不等，同時產(chǎn)蛋量有所下降。對病死雉雞進行剖檢，主要病變?yōu)樾陌e液，心臟有出血點；肝臟表面布滿密布的壞死點；脾臟萎縮；十二指腸出現(xiàn)嚴重；血液凝固不全。根據(jù)臨床癥狀和病理變化，初步懷疑是巴氏桿菌病。對該病例進行細菌分離，通過染色、鏡檢、細菌形態(tài)、培養(yǎng)與生化特性等試驗鑒定為多殺性巴氏桿菌。

1 材料

1.1 病料來源 病料來源于黑龍江省鐵力市某林業(yè)局下屬的珍禽養(yǎng)殖場，死亡和發(fā)病雉雞，具有典型的巴氏桿菌病癥狀。

1.2 試驗動物 21日齡未經(jīng)禽巴氏桿菌疫苗免疫的健康雉雞15只，由某珍禽養(yǎng)殖場提供。

1.3 疫苗 使用的禽霍亂油乳劑滅活苗、禽霍亂蜂膠滅活苗，采用分離鑒定的菌株常規(guī)方法制備；多殺性巴氏桿菌病活疫苗，為省獸醫(yī)衛(wèi)生防疫站提供。

1.4 試劑 革蘭氏染料、瑞氏染料、糖發(fā)酵管和藥敏試紙，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉、營養(yǎng)肉湯粉均購自杭州微生物試劑有限公司。參照文獻設(shè)計如下1對引物，該引物擴增片段為457bp,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成p1:5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG -3;p2:5 -GCGTAAACGAACTCGCCAC-3′。

2 方法

2.1 剖檢變化與病理組織學觀察 對發(fā)病死亡的雉雞進行解剖檢查，觀察各臟器的病理變化。采集病變明顯的心臟、肝臟、肺和腦等器官的組織，用10%福爾馬林固定后，按常規(guī)方法進行病理組織切片的制作，及用光學顯微鏡檢查各組織的病理變化。

2.2 病原的分離 病料的選取與細節(jié)分離，取剛發(fā)病死亡的雉雞，經(jīng)無菌操作從肝臟、脾臟和腦組織器官劃線接種于鮮血瓊脂平板上，經(jīng)37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察細菌生長情況。挑取單個疑似巴氏桿菌菌落，于鮮血瓊脂平板上劃線，然后進行純化培養(yǎng)。

2.3 病原菌的培養(yǎng)特性及菌落形態(tài)觀察 將純化的培養(yǎng)物分別接種于鮮血瓊脂平板上、麥康凱瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)物在這3個平板及肉湯中的生長特點。取病死雉雞肝臟、脾臟組織觸片，分別經(jīng)美蘭染色和姬姆薩染色、鏡檢，觀察細菌形態(tài)，并對分離菌純培養(yǎng)進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

2.4 生化試驗 對純化好的可疑細菌進行生化試驗；用葡萄糖、果糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸鹽、MR、VP，進行觀察。

2.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法作藥敏試驗，對純化好的可疑菌作藥敏試驗，操作方法和判定標準參照杭州天和微生物試劑有限公司的操作方法和標準。藥敏紙片包括頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐青霉素、先鋒霉素、阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、妥布霉素、復方新諾明。

2.6 PCR檢測 用接種環(huán)挑取可疑菌落和禽巴氏桿菌陽性標準菌株，分別懸浮于含50μl無菌水的離心管中，100℃水煮5～10min，然后迅速置于冰上冷卻5min，10000r/min離心2min，分別取出上清液為PCR模板。采用25μl的反應(yīng)體系；10xTap緩存液2.5μm，25mmo/LdNTPs0.5μm，20μmol/L上、下游引物各0.5μl，Tap DNA集合酶0.5μl，無菌水 10μl，模板 10μl。95℃反應(yīng) 5min:95℃30s，56℃ 30s，72℃ 40s，進行 35個循環(huán)；最后 72℃延伸10min，產(chǎn)物于8℃短時間保存。取反應(yīng)產(chǎn)物各10μl，于含EB的10g/L瓊脂糖凝膠中，90V電泳30min，然后在紫外線下觀察。

2.7 致病性試驗 取6只20日齡未經(jīng)免疫禽霍亂疫苗的雉雞，肌肉注射分離菌經(jīng)24h純培養(yǎng)的菌液，1ml/只，觀察發(fā)病情況，記錄結(jié)果，對死亡雉雞進行剖檢與病原菌復制分離。

3 結(jié)果

3.1 病理變化 全身組織器官出現(xiàn)嚴重的敗血癥，肝臟表面有灰白色、針尖大小、邊緣整齊的壞死點，有時融合成塊狀；心包積液，心內(nèi)外膜嚴重出血；肺水腫、出血；氣囊膜出血、壁增厚、發(fā)生水腫（帶血、膠凍狀）；腸管腫脹，充滿帶血內(nèi)容物，粘膜脫落，嚴重出血；脾臟出現(xiàn)出血、壞死；腺胃出血、氣管出現(xiàn)；肺上皮細胞變性壞死；肝細胞索斷裂，空泡變性。肝血竇擴張，充滿炎癥細胞、紅細胞、病原菌、肝細胞變性壞死；心肌細胞萎縮，間質(zhì)增寬，充滿大量紅細胞。

3.2 涂片鏡檢 無菌操作采集病死的雉雞心血制成涂片，同時將肝臟、脾臟和淋巴結(jié)病變組織制成觸片，進行革蘭氏染色，鏡檢，可見短小桿菌，兩端鈍圓；美蘭染色時，可見典型的兩極著色的短桿菌。

3.3 細菌分離與培養(yǎng) 從肝臟、脾臟和腦組織分離到的細菌，分離菌在鮮血瓊脂平板上長出灰白色、半透明、表面光滑的露珠狀小菌落，直徑 1～2mm，不溶血，在普通瓊脂平板上生長不良，在麥康凱平板上不生長，在肉湯培養(yǎng)初期呈均勻渾濁，24h后上清清亮，管底有灰白色絮狀物沉淀。培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色陰性，近似球型或雙球型。組織觸片，經(jīng)姬姆薩、美蘭染色可見到菌體呈明顯的兩極著色。

3.4 生化試驗結(jié)果 分離菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甘露糖，不發(fā)酵棉子糖、乳糖和木糖，硝酸鹽試驗陽性，硫化氫、明膠試驗陰性，根據(jù)生化特性判定為多殺巴氏桿菌。

3.5 PCR檢測結(jié)果 用引物擴增時，分離的疑似菌落和Pm陽性標準均有擴增出目的條件，且大小基本一致，經(jīng)多分離菌的可疑菌落 Pm陽性PCR產(chǎn)物回收測序，與NCBI上發(fā)布的序列對比，同圓性為98.8%。

3.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法作藥敏試驗，結(jié)果分離菌株對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、丁胺卡那霉素高敏，對復方新諾明、妥布霉素、新霉素中敏，對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素不敏感。

3.7 致病性試驗 試驗雉雞在攻毒后 24h內(nèi)即出現(xiàn)死亡，48h內(nèi)全部死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)病變?yōu)椋盒丶?、腿肌出血嚴重；心臟腫大，心包積液，心臟有大的出血點或潑水樣的出血點；脾臟萎縮；肝臟病變不明顯；十二指腸彌漫性出血，雉雞的毛容易拔出，血液凝固不全。接種疫苗的雉雞期間未見死亡，72h對活雉雞進行解剖，可見內(nèi)臟有輕微病變。死亡雉雞可見與自然病例相同的病理變化，并從死亡雉雞的心臟、肝臟等器官中重新分離出攻毒菌。

4 小結(jié)與討論

4.1 從發(fā)病死亡的雉雞中，通過解剖病變、分離細菌培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗、PCR試驗和致病性試驗，分離到一株多殺性巴氏桿菌。由于珍禽場感染率高于分離率，說明鐵力地區(qū)部分區(qū)域已感染禽巴氏桿菌，巴氏桿菌病作為禽的疾病，對養(yǎng)禽業(yè)威脅很大。目前，養(yǎng)殖場長期、大量使用抗生素進行豬病的預防和治療，導致細菌的抗藥性增強，往往引發(fā)混合感染或繼發(fā)感染，導致對細菌的分離培養(yǎng)難度加大，使珍禽場治療效果也越來越差，因此，養(yǎng)禽場應(yīng)引起對雉雞的重視。

4.2 從本試驗結(jié)果來看，可疑菌落培養(yǎng)物攻毒在24h內(nèi)死亡，通過采集死亡雉雞臟器，再次進行細菌分離鑒定試驗，結(jié)果與本次試驗結(jié)果相同，說明本次分離的雉雞巴氏桿菌具有較強的感染率。

4.3 從藥敏結(jié)果來看，分離到的巴氏桿菌具有較強的致病性，對頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林和丁胺卡那高敏，但對青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和復方新諾明常用藥物產(chǎn)生抗藥性。說明這些常用藥物由于在臨床上長期使用，已形成嚴重的耐藥性，應(yīng)該引起養(yǎng)殖者的注意。在有條件的情況下，可通過藥敏試驗篩選出高效的藥物進行治療，制定合理的治療方案，如輪換用藥、控制劑量和療程。

4.4 試驗表明，應(yīng)用敏感藥物結(jié)合緊急疫苗接種，在短時間內(nèi)有效控制了該病的發(fā)生，但在實際生產(chǎn)中禽巴氏桿菌不能依賴于疫苗接種，更重要的是加強飼養(yǎng)管理、獸醫(yī)衛(wèi)生工作，建立完善的衛(wèi)生消毒制度，堅持以防為主、防治結(jié)合的方針，這樣才能很好地控制巴氏桿菌病的發(fā)生。

4.5 本試驗設(shè)計的PCR引物，可直接從第1代培養(yǎng)皿上可疑菌做PCR檢查，無需提供細菌的基因組，最小檢查禽巴氏桿菌病原CFU為103/ml,檢測結(jié)果若為陽性，一般可分離出Pm，若為陰性則反之，耗時只需幾小時，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及鑒定相比，PCR檢測大幅提升了該病的診斷速度，避免費時、費力、漏檢、錯檢等不足，顯示了PCR技術(shù)對疾病的早期診斷、及時治療，對減少經(jīng)濟損失具有重要意義。

[1] Saif.YM著.蘇敬良，高福，索勛，等譯.禽病學（第 11版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[2]George MG.Bergey's Mannal of Systermatic Bacteriology [M].Second Edition，2005.2：850-866.

[3] 甘肅農(nóng)業(yè)大學主編.獸醫(yī)微生物學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：209-230.

[4] 陳博言.獸醫(yī)傳染病學（第 5版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[5] 徐步.我國家禽細菌病的新挑戰(zhàn)及其對策[J].中國家禽，2008，13：5-9.

S858.394.4

B

1673-1085（2017）02-0047-03

2017-01-22