莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，姚春陽(yáng)，李 峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬戊型肝炎的病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，張 穎，姚春陽(yáng)，李 峰，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬戊型肝炎病毒（HEV）感染為國(guó)內(nèi)近年來(lái)的新發(fā)人畜共患傳染病，在豬群中普遍存在，豬是重要的儲(chǔ)存宿主和傳染源，嚴(yán)重危害著人類健康和畜牧業(yè)健康發(fā)展。文章概述了豬戊型肝炎病毒的病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，以期為預(yù)防和控制疾病提供參考。

戊型肝炎病毒；病原學(xué)；檢測(cè)；研究進(jìn)展

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由肝炎病毒科戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的一種重要的經(jīng)消化道傳播的人畜共患病，臨床上主要表現(xiàn)為急性肝炎。近年來(lái)，人感染HEV呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類健康。豬是公認(rèn)的HEV重要儲(chǔ)存宿主和傳染源，我國(guó)作為生豬養(yǎng)殖大國(guó)和以豬肉消費(fèi)為主的國(guó)家，為了控制HE的傳播和流行，同時(shí)也為了減少HEV對(duì)人類的危害和食品公共衛(wèi)生安全，必須從源頭上控制該病原。本文簡(jiǎn)要概述了豬HEV的病原學(xué)特征及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，以期為防治該病提供參考。

1 病毒的由來(lái)和發(fā)現(xiàn)

Meng等（1997）[1]首次從美國(guó)的豬體內(nèi)鑒定出HEV。我國(guó)孫中鋒等（2006）[2]將分離到的5個(gè)豬源HEV病毒株和3個(gè)人源病毒株進(jìn)行檢測(cè)并測(cè)序，證實(shí)分離到的病毒株均為基因4型，而且同源關(guān)系較高，揭示了HEV存在種群交叉感染的可能。寧海強(qiáng)等（2007）[3]檢測(cè)了上海近郊收集的36份樣品，檢測(cè)得到5份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率達(dá)到13.9%。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，上海豬HEV同樣屬于基因4型。陸一涵等（2007）[4]首次在上海豬群中檢測(cè)到基因3型HEV。我國(guó)研究人員近年來(lái)分離到的豬HEV多數(shù)為基因4型，表明我國(guó)HEV感染占主導(dǎo)地位的是基因4型。

2 病毒的形態(tài)及分類地位

HEV是單股正鏈RNA病毒，呈球形，直徑32～34 nm，無(wú)囊膜，核衣殼呈二十面體立體對(duì)稱，基因組長(zhǎng)約7.2 kb。HEV只有一個(gè)血清型，但具有高度的遺傳多樣性。目前戊型肝炎主要分為4類，分別為A類肝炎（人、豬、野豬、鹿、兔子、駱駝等）、B類肝炎（禽類）、C類肝炎（鼠、大袋貍、亞洲麝香鼩、雪貂）和D類肝炎（蝙蝠）。其中A類戊型肝炎又可以分為7個(gè)型：基因1型和2型僅發(fā)現(xiàn)于人類，具有一定的地域性，主要存在于發(fā)展中國(guó)家如亞洲、非洲以及美國(guó)中部地區(qū)；基因3型和4型宿主范圍廣，人畜均可感染，基因3型分布在美國(guó)、日本、法國(guó)、荷蘭、澳大利亞、加拿大、阿根廷等發(fā)達(dá)國(guó)家；基因4型分布在中國(guó)、日本、印度和越南；基因5型和6型主要感染野豬；基因7型感染駱駝。在我國(guó)HEV感染以基因1型和4型為主，4型多見。豬HEV感染均為基因3型和4型。

3 病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)

豬是HEV重要的自然宿主及傳染源。HEV在豬群中普遍存在，以水源性暴發(fā)和急性散發(fā)為特點(diǎn)，主要通過(guò)被感染的水和食物經(jīng)糞-口途徑傳播，也可經(jīng)血液、母嬰等途徑傳播，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，主要流行于發(fā)展中國(guó)家，在發(fā)達(dá)國(guó)家呈散發(fā)狀態(tài)。HEV可在肝臟和膽汁中蓄積，同時(shí)也可以在小腸及大腸內(nèi)增生。豬HEV經(jīng)口侵入機(jī)體，從腸道經(jīng)門靜脈感染肝細(xì)胞，在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增生，增生的子代病毒可進(jìn)入血液出現(xiàn)短暫的病毒血癥，并可分泌進(jìn)入膽汁中。病毒主要隨膽汁一起經(jīng)糞便排出體外，帶病毒的糞便可再次經(jīng)口引發(fā)新的感染。

4 病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

4.1 免疫電鏡（immunoelectron microscopy,IEM）觀察

Balayan等（1983）[5]首次運(yùn)用免疫電鏡技術(shù)在急性肝炎患者及志愿者的糞便中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了HEV的存在。HEV感染潛伏期和急性期患者的糞便和膽汁中存在大量的HEV病毒顆粒，可用IEM進(jìn)行檢測(cè)。但是該方法在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制，原因是HEV通過(guò)糞便排毒持續(xù)時(shí)間短，加之在消化道時(shí)大部分病毒顆粒易被降解，完整的HEV少，所以臨床檢測(cè)比較困難。而且免疫電鏡靈敏性較差、重復(fù)性差，又需要特殊的設(shè)備條件和專門的技術(shù)人員，這就使其應(yīng)用受到了較大的限制。

4.2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

4.2.1 免疫熒光試驗(yàn)（immunofluorescence assay,IFA）免疫熒光試驗(yàn)可用于檢測(cè)HEV抗原或抗體，臨床常用的有直接法和間接法。Purdy等（1994）[6]應(yīng)用熒光素標(biāo)記的HEV患者的血清，直接法檢測(cè)標(biāo)本中HEV抗原。Zhu等（2013）[7]運(yùn)用IFA對(duì)肝臟組織中的HEV抗原進(jìn)行檢測(cè)。李丹丹等（2008）[8]利用抗HEV ORF2蛋白單克隆抗體能阻斷熒光標(biāo)記的抗HEV的抗體與標(biāo)本中的HEV抗原反應(yīng)，建立間接免疫熒光檢測(cè)HEV抗體。IFA敏感性高、特異性強(qiáng)，但需取急性期肝組織檢查，且需要熒光顯微鏡，因此不適合HEV的常規(guī)檢測(cè)。

4.2.2 血清中和試驗(yàn)（serum neutralization test,SNT）血清中和試驗(yàn)不僅可以對(duì)病毒的種型鑒定還可以測(cè)定血清抗體效價(jià)。Meng等（1998）[9]用不同毒株的陽(yáng)性血清對(duì)不同地域的HEV毒株進(jìn)行中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HEV只有一個(gè)血清型。

4.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunos orbentassay,ELISA） ELISA是目前用于檢測(cè)血清中HEV抗體最常用的方法。ELISA方法主要分為固相ELISA法、夾心ELISA法和間接ELISA法等。ELISA包被抗原包括全病毒抗原、合成肽抗原、表達(dá)抗原以及重組蛋白抗原。Meng等（1997）[1]利用從SF9細(xì)胞中表達(dá)出的人HEV（Sar55）ORF2重組蛋白作為ELISA包被抗原使用阻斷ELISA來(lái)檢測(cè)HEV抗體，檢測(cè)出美國(guó)中西部豬群的HEV抗體陽(yáng)性率。Yoo等（2001）[10]利用大腸桿菌表達(dá)的重組HEV ORF3蛋白作為包被抗原檢測(cè)豬HEV抗體亦獲成功。張可心等（2006）[11]采用巢式RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增HEV結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF2部分片段AG02并進(jìn)行重組表達(dá)，以分子量為33 kDa重組蛋白建立了初步的間接ELISA方法。曲娟娟等（2007）[12]采用大腸桿菌表達(dá)的HEV ORF2部分蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，并對(duì)黑龍江省、吉林省豬場(chǎng)480份豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為62%、75%，與商品化試劑盒符合率為98.6%。劉濤等（2009）[13]建立了基因4型HEV重組ORF3蛋白抗原間接ELISA方法，檢測(cè)190份豬血清樣品，陽(yáng)性率為84.7%，為進(jìn)一步開發(fā)4型HEV抗體檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。劉啟文等（2010）[14]通過(guò)豬HEV ORF3篩選出來(lái)的一段序列合成肽建立了間接ELISA方法。聞曉波等（2010）[15]應(yīng)用原核表達(dá)的重組蛋白ORF2-C和ORF2-N作為檢測(cè)抗原建立ELISA方法。劉艷玲等（2012）[16]用雙抗原夾心ELISA檢測(cè)廣西14個(gè)市豬群HEV抗體，陽(yáng)性率高達(dá)77.3%。曲立春（2014）[17]采用雙抗原夾心法對(duì)黑龍江雞西地區(qū)采集的600份豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，HEV陽(yáng)性率為19.33%。唐建華等（2015）[18]利用雙抗原夾心ELISA方法對(duì)西藏自治區(qū)拉薩市、墨竹工卡、工布江達(dá)及林芝縣等地12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬1 440份血清進(jìn)行HEV抗體檢測(cè)，結(jié)果12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬均有HEV抗體，HEV抗體平均陽(yáng)性率為41.32%，表明HEV普遍存在于拉薩-林芝公路沿線。杜寧（2016）[19]應(yīng)用雙抗原夾心ELISA對(duì)采集自攀西地區(qū)豬血清樣品245份進(jìn)行HEV感染情況調(diào)查，結(jié)果表明該地區(qū)豬群中HEV感染很嚴(yán)重。陳宜陽(yáng)（2016）[20]通過(guò)原核表達(dá)制備的基因4型豬HEV的ORF2蛋白sORF2-C作為包被抗原，制備和HRP標(biāo)記的抗sORF2-C蛋白的單抗HRP-1E4作為阻斷抗體，建立了豬HEV特異性抗體的阻斷ELISA方法，具有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性。我國(guó)已利用大腸桿菌表達(dá)出HEV結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原成功研制了抗HEV IgM和IgG抗體診斷ELISA試劑盒，經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所檢定后，已經(jīng)用于我國(guó)HE的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。但ELISA方法由于使用的包被抗原不同所以對(duì)恢復(fù)期HEV IgG的檢測(cè)結(jié)果不盡相同，從而限制了血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的可信性。

4.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（western blotting,WB） 蛋白質(zhì)印跡法又稱免疫印跡法，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。李凡等（1995）[21]建立了免疫印跡法檢測(cè)抗HEV IgG，結(jié)果表明HEV暴發(fā)點(diǎn)急性肝炎病人血清抗HEV IgG的陽(yáng)性率高于ELISA，具有良好的靈敏度和特異性。Thiry等（2014）[22]用免疫印跡法對(duì)ELISA方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)免疫印跡法檢測(cè)雖然特異性高，但操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。

4.2.5 免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（immunoper oxidase monolayer assay,IPMA） Liang等（2014）[23]用構(gòu)建的pcDNA3.1-ORF3轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞系HepG2，建立了一種檢測(cè)HEV的免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)用于檢測(cè)HEV抗體。

4.3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

4.3.1 RT-PCR技術(shù) PCR可較靈敏地檢出病毒RNA，是最常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。Meng等（1997）[1]率先應(yīng)用套式RT-nPCR檢測(cè)到豬HEV。張維誼等（2009）[24]用建立的RT-nPCR方法對(duì)127份豬膽汁樣品進(jìn)行HEV檢測(cè)，陽(yáng)性率為7.09%。Huang等（2002）[25]用RT-PCR方法對(duì)美國(guó)96份豬糞便進(jìn)行HEV檢測(cè)，陽(yáng)性率為35%。張瀟等（2005）[26]在132份豬糞便標(biāo)本中檢出13份為HEV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為9.85%，在160份豬膽汁標(biāo)本中有11份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為6.88%。宋騰飛等（2011）[27]建立RT-nPCR方法并對(duì)從山東省泰安某屠宰場(chǎng)收集的106份豬膽汁樣品進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性率為30.2%。張序等（2011）[28]也建立了HEV的RT-nPCR方法，并對(duì)江西省部分豬場(chǎng)采集的膽汁及腸容物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果膽汁中的陽(yáng)性率為10%，腸容物的陽(yáng)性率為4%。郝寶成等（2011）[29]也應(yīng)用建立的RT-nPCR對(duì)在甘肅省部分地區(qū)采集的255份豬糞便或豬膽汁血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性率為4.71%。許鋒（2011）[30]通過(guò)RT-PCR對(duì)從河南省鄭州、中牟、新鄭、濟(jì)源和濮陽(yáng)等5個(gè)地區(qū)采集的200份糞便樣品進(jìn)行HEV檢測(cè)，HEV陽(yáng)性率為7.5%。Qiu等（2014）[31]建立了一步法RT-nPCR用于同時(shí)檢測(cè)甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。賀微等（2017）[32]應(yīng)用RT-nPCR對(duì)廣西南寧周邊豬場(chǎng)采集到的104份新鮮豬糞便進(jìn)行HEV檢測(cè)，結(jié)果表明，廣西豬群中流行的HEV均為基因4型，且以4a亞型為優(yōu)勢(shì)流行毒株。

4.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù) 熒光定量RT-PCR具有良好的擴(kuò)增效率、特異性和穩(wěn)定性，且檢測(cè)靈敏度比普通RT-PCR高10～100倍。邱蜜蜜等（2010）[33]根據(jù)HEV ORF2保守區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針，建立了TaqMan探針?lè)晒舛縍T-PCR。張亮權(quán)等（2011）[34]根據(jù)HEV的ORF2保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR。張曉峰等（2011）[35]利用所建立的熒光定量PCR對(duì)浙江及其周邊的上海、江蘇等地區(qū)的豬場(chǎng)環(huán)境進(jìn)行了檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，幾乎所調(diào)查的豬場(chǎng)均存在HEV，感染陽(yáng)性率高達(dá)20.5%。陳小金等（2016）[36]建立了基因3型HEV熒光定量RT-PCR方法。閆蕾等（2016）[37]根據(jù)HEV基因ORF2保守區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針，建立HEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。對(duì)黑龍江省臨床收集的131份樣品（肝臟45份、糞便86份）進(jìn)行檢測(cè)，總陽(yáng)性率為11.45%，其中肝臟陽(yáng)性率為22.22%，糞便陽(yáng)性率為5.81%。熒光定量PCR為HEV的快速檢出及絕對(duì)定量奠定了良好的基礎(chǔ)。

4.3.3 基因芯片技術(shù) 王治偉等（2010）[38]制備HEV檢測(cè)基因芯片并進(jìn)行雜交驗(yàn)證，結(jié)果表明，HEV檢測(cè)基因芯片雜交后得到的探針熒光強(qiáng)度好，信噪比高，RT-PCR驗(yàn)證后得到的電泳結(jié)果與芯片試驗(yàn)一致，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HEV提供了一種快速平行的檢測(cè)方法。Wutz等（2013）[39]以固定化的基因1型和3型HEV重組抗原建立了化學(xué)發(fā)光免疫芯片。紀(jì)方曉（2016）[40]在建立用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV）Nsp7抗體、豬流感病毒（Swine Influenza virus,SIV）HA抗體及HEV ORF2抗體3個(gè)液相蛋白芯片單一檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，同時(shí)建立了檢測(cè) HEV、PRRSV、SIV 3種抗體的多液相蛋白多重檢測(cè)方法，為HEV、PRRSV、SIV抗體監(jiān)測(cè)提供了一種高通量、重復(fù)性好、特異性高的抗體檢測(cè)體系。

4.3.4 高效液相色譜（Size-exclusion HPLC,SEHPLC）技術(shù) 王寧等（2011）[41]采用分子尺寸排阻高效液相色譜（Size-exclusion HPLC,SE-HPLC）法檢測(cè)HEV病毒樣顆粒VLP，可對(duì)HEV VLP進(jìn)行定性、定量分析。

4.3.5 RT-PCR-ELISA Seo 等（2012）[42]以 RT-PCR和ELISA為基礎(chǔ)建立了敏感性高、特異性好的RTPCR-ELISA方法用于HEV的檢測(cè)。

5 小結(jié)

HEV是新發(fā)的重要人畜共患傳染病之一，分布范圍廣，嚴(yán)重危害人類身體健康和畜牧業(yè)健康發(fā)展，在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，是發(fā)展中國(guó)家的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，HEV準(zhǔn)確快速的檢測(cè)對(duì)該病的防控具有重要意義。豬感染HEV后，很少有明顯的臨床癥狀，這對(duì)HE的臨床診斷帶來(lái)很大的不便，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。從首次發(fā)現(xiàn)HEV以來(lái)，研究者建立了多種HEV的檢測(cè)方法，為HEV的相關(guān)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，但這些方法各自存在一定的局限性，而且疾病有效疫苗尚未研制成功，因此HEV的防控還需要研究者的深入研究。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，更加靈敏高效特異的檢測(cè)方法很快會(huì)被研制出來(lái)，使得HEV的檢測(cè)手段更加先進(jìn)，檢驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

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1002-1957(2017)05-0117-04

2017-07-17

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，副研究員，碩士，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物用病毒疫苗研制.

E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com