趙琴玭，陳建中，胡立濤，韓文文

（湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000）

1 青錢柳的生物學(xué)特性

青錢柳產(chǎn)于長江以南，廣泛分布于我國的亞熱帶地區(qū)的江西、浙江、江蘇、安徽、福建、臺灣、湖北、四川、貴州、湖南、廣西、廣東和云南等省[1,6]。它常生長在海拔800～2500m的山地中，喜陰、耐寒、耐旱，要求深厚、肥沃濕潤土質(zhì)，萌芽力強(qiáng)，生長中速，但在自然狀態(tài)下發(fā)芽率低，僅為0.1%～0.2%，種子空粒率高且具有深休眠特性，一般播種后需隔年甚至2年后才萌發(fā)，很難成片生長[3,7,8]。青錢柳為多年生落葉喬木，樹干通直，高達(dá)20～30m，樹木高大挺拔，樹皮灰褐色；枝葉美麗多姿，枝條呈黑褐色，具灰黃色皮孔；果實(shí)為堅(jiān)果，扁球形，直徑約7 mm，中部圍有水平方向的革質(zhì)圓盤狀翅，頂端有4枚宿存花被片及花柱，與銅錢很相似，因此也被稱為“搖錢樹”，花期 4～5 月，果期 8～10 月[3,7,9]。奇數(shù)羽狀復(fù)葉，互生，有7～9片小葉，橢圓形或長橢圓狀披針形，邊緣具細(xì)齒?；▎涡酝辏彳杌ㄐ蛳麓?，雄花序2～4枚，集生于上年枝葉腋；雌花序單生當(dāng)年枝頂。其果實(shí)及果翅全部被有腺體，在基部及宿存花柱上則被有稀疏的短柔毛[10]。

2 青錢柳組培快速繁殖

無性繁殖不僅能保持母體的遺傳特性，還能解決種子休眠等問題，目前主要的無性繁殖方式有扦插、嫁接和組織培養(yǎng)等。組織培養(yǎng)是目前最有效可行的無性繁殖途徑，除了具備繁殖快、不受場地、季節(jié)和環(huán)境條件限制等諸多優(yōu)點(diǎn)，還能克服常規(guī)無性繁殖速度慢、繁殖率低等缺點(diǎn)[11]。

2.1 外植體的選擇

吳群英等[12]研究表明，春季采集的莖段能夠誘導(dǎo)芽的抽生，出芽率可達(dá)29.17%；夏、秋兩季采集的莖段出芽率和出愈率都比較低，且褐變率都大于50.00%。另外，魯萌研究發(fā)現(xiàn)，4月的青錢柳莖段腋芽萌芽率為86.70%，萌芽生長狀態(tài)最好，而5月份萌芽率為66.67%，但整體生長狀態(tài)不如4月份理想[13]，這說明青錢柳外植體的采取最佳時期是春季的4月份。

2.1.1 嫩葉和嫩芽。青錢柳的嫩葉、嫩芽均不能夠直接誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生，但它們產(chǎn)生愈傷組織的效果較好，出愈率都高于60%，尤其是嫩葉，出愈率可達(dá)93.33%[12]。葉片產(chǎn)生不定芽的主要部位是葉脈切口處和葉柄端切口處，首先外植體切口處細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，后通過再分化形成不定芽[14]。但大部分研究都僅獲得愈傷組織，無法進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。阮氏釧等[15]研究發(fā)現(xiàn)，從葉和莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織須經(jīng)過狀態(tài)調(diào)整后才能產(chǎn)生不定芽，但青錢柳的愈傷組織分化的不定芽難以形成完整的植株。

2.1.2 莖段。在以青錢柳莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時，胡冬南等[16]研究發(fā)現(xiàn)，頂芽下1、2節(jié)的莖段分化效果較好，萌發(fā)率高，是最佳誘導(dǎo)材料。在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑對器官分化的調(diào)節(jié)起重要作用，就形態(tài)學(xué)而言6-BA能夠促進(jìn)芽的分化、側(cè)芽的生長[17]。謝寅峰等[18]首次以青錢柳莖段為外植體直接誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，通過以芽繁芽的方式進(jìn)行增殖，在此試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)6-BA是誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的主要因素；其次是NAA、2ip。目前已有許多研究以青錢柳莖段為外植體，雖可成功分化、誘導(dǎo)生根[13,16,18,19]，但生根率與生根質(zhì)量未達(dá)標(biāo)、芽苗玻璃化和褐化等問題仍需進(jìn)一步研究。

2.1.3 離體胚。相比以青錢柳的嫩葉、莖段等為外植體，離體胚因被堅(jiān)硬種皮包裹，不易受雜菌污染，且其分化能力較強(qiáng)，所以在培養(yǎng)時污染率很低、成苗數(shù)也較多，是一種有效獲得青錢柳無菌小植株的培養(yǎng)方法[20,21]。但青錢柳種子外殼堅(jiān)硬，對種子的萌發(fā)有非常大的阻力，而要取出完整離體胚有一定的困難。尚旭嵐等[22]將青錢柳種子用濃硫酸預(yù)處理4h，剝離出離體胚進(jìn)行培養(yǎng)，采用離體胚培養(yǎng)技術(shù)使休眠期很長的青錢柳種子很快萌發(fā)，并在短期內(nèi)迅速成苗。由于不同種源的種子酸蝕時間不一樣，若酸蝕時間過長，濃硫酸將會破壞種胚致種子無法萌發(fā)。徐慶等[23]對種子進(jìn)行酸蝕和綜合處理后直接將種子接入培養(yǎng)基進(jìn)行無菌培養(yǎng)，可直接得到無菌苗進(jìn)行快速繁殖，減少了剝離種胚的操作步驟，為青錢柳快速繁殖提供了一套簡便的新方法。

2.2 培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中離體材料賴以生存和發(fā)展的營養(yǎng)基質(zhì)，內(nèi)含碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽和水等營養(yǎng)要素，具有維持植物細(xì)胞滲透壓、酸堿度等功能，是組培成功與否的重要因素。不同種類植物或同種植物的不同組織以及不同培養(yǎng)階段對營養(yǎng)的要求都有所不同，因此，在植物組織培養(yǎng)快速繁殖過程中需要選擇合適的培養(yǎng)基。

2.2.1 基本培養(yǎng)基。在以青錢柳莖段腋芽作為外植體的研究中，張志敏等[24]發(fā)現(xiàn)，在7種基本培養(yǎng)基中WPM和改良MS培養(yǎng)基最佳，誘導(dǎo)率分別達(dá)到83.33%和75.76%，其中WPM培養(yǎng)基上的植株葉深綠色、葉片伸展、莖粗壯，說明WPM基本培養(yǎng)基最適宜青錢柳生長。此外，WPM無機(jī)鹽濃度相對較低，還適于離體胚的萌發(fā)和芽苗生長[25]。而胡東南等[16]認(rèn)為，莖段在改良DKW培養(yǎng)基上的分化率高，芽長得快，適合青錢柳的壯苗培養(yǎng)；在改良MS培養(yǎng)基上的分化率稍低，分化所耗時間較長，但能分化出較多芽數(shù)，可用作青錢柳的誘導(dǎo)分化和增殖培養(yǎng)。綜上可得，不同時期或不同取材部位的青錢柳莖段，在相同培養(yǎng)基上的分化效果不一樣，因此選擇適宜的基本培養(yǎng)基極為重要。

2.2.2 酸堿度（pH）。不同植物所適應(yīng)的pH范圍不同，培養(yǎng)基pH值是影響培養(yǎng)基凝固程度的重要因素[26,27]，此外，pH還影響植物對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的吸收，因此，在接種植物材料前必須調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。植物組織培養(yǎng)中多數(shù)植物pH值要求為5.0～6.2；一般青錢柳外植體生長的適宜pH值為5.8[27,28]，然而，蔣小滿等[26]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基高溫滅菌后，其pH值會下降，所以在滅菌前可適當(dāng)調(diào)高培養(yǎng)基pH值0.2～0.5個單位，這樣可以確保滅菌后的pH值與原設(shè)計(jì)值接近。

磚子旁邊戴眼鏡的青年詩人問：余老科，罵誰呢？余科長搖搖頭說，一個莫名其妙的電話，一個莫名其妙的女人，與我聊了一通莫名其妙的廢話，不過聲音很甜，甜得我心里酥酥的，不然我早掛了。詩人勾過頭說，是嗎？沭陽灌南一帶的口音，聲音膩，帶著甘蔗味？我上午也接到一個陌生女人的奇怪電話，態(tài)度特好。另幾個男士先后也喊起來，我也接過一個陌生女人的電話，有說漣水口音，有道楚州音調(diào)，有說尾音像金湖的，也有道盱眙味更重些的。

2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

植物生長調(diào)節(jié)劑能調(diào)節(jié)植物生長，據(jù)研究表明，TDZ能促進(jìn)芽的繁殖，還有利于芽的再生，TDZ是人工合成的苯基脲衍生物之一，具有很高的細(xì)胞分裂素活性，可使細(xì)胞長時間保持較高的分裂和分化能力[29,30]。

在青錢柳叢生芽增殖誘導(dǎo)時，將青錢柳外植體誘導(dǎo)出的單芽，基部切一字樣切口[31]后接種于不同濃度激素組合的增殖培養(yǎng)瓶中，發(fā)現(xiàn)最佳組合濃度為TDZ 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，叢生芽誘導(dǎo)率最高（100%），增殖系數(shù)達(dá)7.33[18]。但從TDZ誘導(dǎo)的不定芽產(chǎn)生的植株常常表現(xiàn)出節(jié)間縮短的矮化現(xiàn)象[32]，GA3的生理作用是加速細(xì)胞的伸長生長、促進(jìn)細(xì)胞分裂，在大多數(shù)情況下，對已形成的器官和胚狀體的生長有促進(jìn)作用[30,33]，針對有矮化現(xiàn)象的叢生芽，可將其切成單芽接種于添加濃度為2.0mg/L的GA3繼代培養(yǎng)基上，苗最高達(dá)4.17cm，而且苗形正常，生長健壯，葉大翠綠[18]。

2.4 壯苗與生根

青錢柳是一種不定根較難發(fā)生的樹種[3]，通過不定芽途經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的試管苗沒有根端，因此必須對產(chǎn)生的再生植株進(jìn)行生根誘導(dǎo)。影響試管苗不定根發(fā)生的因素有試管苗本身的生長狀態(tài)及生理年齡等，當(dāng)培養(yǎng)材料得到一定程度的復(fù)壯后，細(xì)胞分化能力提高，從而有利于生根與根的生長[34]。

在青錢柳試管苗繼代培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)生長停滯、莖段纖細(xì)、葉片枯落等現(xiàn)象，若繼代時間過長會發(fā)生褐化導(dǎo)致植株壞死且移栽成活率較低。為解決這些問題以建立完整的組培快繁體系，謝寅峰等[5]研究發(fā)現(xiàn)添加0.1mg/L烯效唑能有效抑制叢芽分化、控制苗高、增粗苗徑，適合作為增殖后的壯苗培養(yǎng)基添加劑。為促進(jìn)芽的分化、增加生物量、增高苗高，也可在增殖培養(yǎng)基中添加硝酸鑭5mg/L，起到良好的壯苗作用[35]。

生根誘導(dǎo)分為試管內(nèi)誘導(dǎo)和試管外誘導(dǎo)，謝寅峰等[5]以IBA作為生根誘導(dǎo)物質(zhì)，添加IBA 0.2mg/L培養(yǎng)2周后有不定根發(fā)生，生根率16.67%，成活率100.00%，在此基礎(chǔ)上再將其暗培養(yǎng)15 d后發(fā)現(xiàn)生根率提升至23.33%，成活率不變；而暗處理8～10d時，生根率有所下降；暗誘導(dǎo)18 d時生根率雖然達(dá)到20.00%，但成活率卻只有86.67%。由此看來，生長素的代謝程度也能對生根產(chǎn)生影響，因?yàn)楣饪梢源龠M(jìn)生長素的降解；同時必須把握暗誘導(dǎo)的時間，時間過短或過長，可能會抑制光合作用而使生長素的代謝速率降低，使生根率降低并影響植株的正常生長。

3 存在的問題

3.1 污染問題

在組培過程中，研究人員的操作不當(dāng)或外植體消毒不充分均會產(chǎn)生污染，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育，而外植體消毒不充分是引起污染的主要原因。在以青錢柳莖段為外植體的試驗(yàn)中，使用正確的消毒劑及其濃度和處理時間不僅能降低污染率，還能提高外植體的萌發(fā)率。張志敏等[24]發(fā)現(xiàn)升汞處理時間過短，會造成污染嚴(yán)重；升汞處理時間較長，會對莖段組織細(xì)胞造成傷害，因此升汞的處理時間是影響消毒效果的主要因素，而乙醇的處理時間對萌發(fā)率效果的影響最大，是誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的主要因素，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)消毒滅菌的最佳組合是70%乙醇30s+0.1%升汞12min，污染率最低（31.25%），萌發(fā)率最高（81.82%）。

3.2 褐變問題

褐變是影響組織培養(yǎng)的重要因素，目前在許多植物組培過程中發(fā)現(xiàn)有褐變現(xiàn)象且主要發(fā)生在植物外植體[36,37]。發(fā)生褐變的原因是植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)被多酚氧化酶（PPO）氧化產(chǎn)生棕褐色醌類物質(zhì)，醌類又會在酪氨酸酶等作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，產(chǎn)生黑色或褐色的色素沉淀，同時抑制許多酶活性，進(jìn)而引起其他酶系統(tǒng)失活，使組織代謝活動紊亂，對外植體材料產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重時導(dǎo)致培養(yǎng)材料死亡[37～40]。褐變的發(fā)生往往是多種因素同時作用的結(jié)果，引起褐變的因素主要有外植體材料的生理狀態(tài)、取材部位和大小、培養(yǎng)基的成分及培養(yǎng)條件（溫度、光照時間、光照強(qiáng)度和通氣狀況等）、外加激素的含量及比例，另外轉(zhuǎn)瓶周期也會影響褐變的發(fā)生[37,39]。

由于對易于褐變的外植體材料進(jìn)行預(yù)處理和連續(xù)轉(zhuǎn)接可以減輕酚類物質(zhì)和醌類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用[39]，謝寅峰等[5]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青錢柳試管苗培養(yǎng)40d時長勢較好且能適應(yīng)新培養(yǎng)基中的環(huán)境，因此每隔40d將外植體轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基能避免發(fā)生褐變。吳群英等[12]將外植體先于4℃預(yù)處理5d再接種，發(fā)現(xiàn)可有效降低褐變率，另外直接用燒紅的手術(shù)刀快速切割外植體后再進(jìn)行接種可使莖的褐變率由100%降至55.55%；不同時期的外植體褐變程度不同，該研究發(fā)現(xiàn)幼嫩的組織酚類物質(zhì)含量少，在組織培養(yǎng)中較不容易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，因此選擇幼齡材料作為外植體較合適。

有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入合適的植物生長劑、抗氧化劑及吸附劑或通過下調(diào)PPO的表達(dá)也能有效地防止褐變[38,39,41,42]。

3.3 玻璃化現(xiàn)象

玻璃化指組織培養(yǎng)苗呈半透明狀、外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象[36]。試管植物玻璃化在草本與木本植物中均有發(fā)生，據(jù)報(bào)道出現(xiàn)玻璃化苗的植物已達(dá)70多種[43]。玻璃化苗的分化能力較低，難以增殖生根成苗，移栽成活率低；通常玻璃化苗可通過重新分化恢復(fù)正常，但比例很低并且在繼代培養(yǎng)中仍然會形成玻璃化苗[36,44,45]。張金鳳[25]發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)基中糖含量由3%增加到4%時可有效克服青錢柳組織培養(yǎng)中玻璃化的現(xiàn)象；另外，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中銨離子濃度或者及時轉(zhuǎn)移、增加自然光照和控制光照時間也能避免玻璃化現(xiàn)象[36,44]。

3.4 生根問題

青錢柳屬于難生根樹種，在對不定根發(fā)生與內(nèi)源激素的變化關(guān)系探討過程中，謝寅峰等[46]認(rèn)為外源IBA促進(jìn)內(nèi)源IAA積累進(jìn)而誘導(dǎo)和促進(jìn)發(fā)生不定根，較高的IAA/ABA、IAA/GA3值有利于不定根的啟動和發(fā)生，但GA3可能不是影響不定根發(fā)生的關(guān)鍵因素。

張金鳳[25]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將試管苗放入滅菌后的80mg/L IBA溶液中浸蘸75min，然后轉(zhuǎn)入不含任何激素的1/4 DKW中進(jìn)行培養(yǎng)，不論是生根率、平均生根數(shù)和平均根長方面都能達(dá)到較好的生根效果，此外，在生根培養(yǎng)前加強(qiáng)壯苗培養(yǎng)對誘導(dǎo)生根有一定的幫助。

4 總結(jié)與展望

青錢柳集藥用、材用和觀賞價值于一身，具有很好的人工資源培育和產(chǎn)品開發(fā)前景。然而青錢柳天然資源非常少，建立其組培快繁的完整體系并實(shí)現(xiàn)工廠化快速育苗研究是解決資源匱乏的有效途徑。目前國內(nèi)外已有成功通過組培獲得完整的青錢柳芽苗報(bào)道，但青錢柳的組織培養(yǎng)過程中仍然存在許多亟待解決的問題。如何有效地防止褐變和提高生根率將是青錢柳組培快繁研究的主要重點(diǎn)，而以青錢柳為原材料的新產(chǎn)品開發(fā)也將是今后探索的一個重要方向。

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