董春娜， 馬愛榮,2， 張 蕾， 李 靜， 巴利民， 王振豹， 齊 鵬， 汪 明， 肖 進(jìn)

(1. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京 海淀 100095 ； 2. 中牧股份蘭州生物藥廠，甘肅 蘭州 730046 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動物的烈性傳染病，該病傳播途徑多、傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展及畜產(chǎn)品生產(chǎn)供應(yīng)，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)在1984年將其列為A類傳染病之首[1]。我國每年都投入大量人力、物力和財力用于口蹄疫的防控，疫苗的免疫效果直接影響著口蹄疫防控的成敗，因此加強(qiáng)針對口蹄疫疫苗免疫后動物的免疫抗體水平的監(jiān)控，才能確保疫苗的免疫效果，從而做好口蹄疫的防控[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在口蹄疫抗體檢測中因其具有敏感、特異、穩(wěn)定、快速等特點(diǎn)而備受青睞，為了進(jìn)一步了解不同檢測方法的相關(guān)性和特點(diǎn)，同時為了對本實(shí)驗(yàn)室研制的基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒進(jìn)行評價，本試驗(yàn)選取了國際上廣泛使用的基于單克隆抗體的進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒(Prionics-O)，當(dāng)前國內(nèi)廣泛使用的基于多克隆抗體的液相阻斷ELISA試劑盒(LB-O)和本實(shí)驗(yàn)室研制的基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒(iELISA-O)3種試劑盒進(jìn)行比對試驗(yàn)，對3種試劑盒的符合程度、重復(fù)性和便捷性進(jìn)行比較，以期選擇更簡單、更準(zhǔn)確的方法用于大規(guī)模檢測，從而做好口蹄疫防控工作。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口蹄疫病毒O型抗體檢測阻斷ELISA試劑盒(Prionics-O) 由瑞士Prionics公司生產(chǎn)，批號為：O160501L。

1.1.2 口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒(LB-O) 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制生產(chǎn)，批號為：20170221101-1。

1.1.3 自制間接ELISA試劑盒(iELISA-O) 基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒，批號為2016001。

1.1.4 被檢血清 從臨床送檢血清中選擇免疫口蹄疫O型滅活疫苗后第14天、21天和第28天血清各50份，共150份血清。

1.2 方法

1.2.1 檢測結(jié)果一致性的比較 對150份血清樣品分別使用Prionics-O、LB-O和iELISA-O 3種試劑盒同時進(jìn)行檢測，分別按其說明書進(jìn)行操作(LB-O操作中，根據(jù)其說明書，血清進(jìn)行1∶128倍稀釋來判定陰陽性)，最后以3種試劑盒各自判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，對各試劑盒檢測的抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別用Kappa統(tǒng)計(jì)方法比較其一致性。Kappa值計(jì)算方法按照文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行，Kappa值越高代表一致性越好。Kappa值<0.40，表明兩種方法間一致性較差；Kappa值在0.41～0.60，中度符合；Kappa值在0.61～0.80，高度符合；Kappa值在0.81～1.00，完全符合。

1.2.2 重復(fù)性比較 從150份血清樣品中隨機(jī)抽取15份血清，應(yīng)用同一批試劑盒，分2次檢測，比較2次檢測結(jié)果，對各試劑盒的重復(fù)性進(jìn)行評價。

1.2.3 結(jié)果判定

1.2.3.1 Prionics-O結(jié)果判定PI值<50%，判為陰；PI值≥50%，判為陽性。PI值=100-(待檢樣品OD450nm值/陰性對照OD450nm值×100)。

1.2.3.2 LB-O結(jié)果判定 以病毒抗原對照OD450nm值的50%為臨界值，被檢血清稀釋孔OD450nm值大于臨界值為陰性，小于或等于臨界值為陽性，抗體滴度≥1∶128判定陽性。

1.2.3.3 iELISA-O結(jié)果判定 臨界值(Cut-off值)=陽性對照孔OD450nm均值×0.17；待檢血清測定OD450nm值≥臨界值者判為陽性；待檢血清測定OD450nm值<臨界值者判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種試劑盒檢測結(jié)果一致性的比較 用Kappa值對3種試劑盒的檢測結(jié)果，兩兩試劑盒之間進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Prionics-O與LB-O的Kappa值為0.86，表明Prionics-O與LB-O完全符合(表1)；Prionics-O與iELISA-O的Kappa值為0.89，表明Prionics-O與iELISA-O完全符合(表2)；LB-O與iELISA-O的Kappa值為0.84，表明LB-O與iELISA-O完全符合(表3)。

表1 Prionics-O試劑盒與LB-O試劑盒一致性分析

注：Kappa值=0.86

表2Prionics-O試劑盒與iELISA-O試劑盒一致性分析

iELISA-OPrionics-O+-合計(jì)+1330133-31417合計(jì)13614150

注：Kappa值=0.89

表3 LB-O試劑盒與iELISA-O試劑盒一致性分析

注：Kappa值=0.84

2.2 3種試劑盒在不同時間對免疫血清的檢出率 檢測結(jié)果顯示(表4)，3種試劑盒檢測血清中的抗體陽性率隨著時間的延長而呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，雖然3種試劑盒均可在免疫后第28天100%檢測到牛血清中的口蹄疫O型抗體，但疫苗免疫后第14天，Prionics-O和iELISA-O均可檢測到36/50牛血清中口蹄疫O型抗體陽性，LB-O可檢測到35/50牛血清中口蹄疫O型抗體陽性；免疫后第21天，Prionics-O試劑盒100%檢測到牛血清中的口蹄疫O型抗體，LB-O和iELISA-O分別可檢測到47/50和49/50牛血清中口蹄疫O型抗體陽性。因此，Prionics-O試劑盒檢測敏感性稍高于國產(chǎn)的兩種試劑盒。

表4 3種試劑盒在不同時間對免疫牛血清陽性檢出統(tǒng)計(jì)

注：分子為檢測陽性血清份數(shù)，分母為檢測血清份數(shù)

2.3 3種試劑盒重復(fù)性比較 檢測結(jié)果如表5所示，3種試劑盒前后兩次檢測結(jié)果雖然PI值/OD值略有不同，但是結(jié)果判定完全一致，因此，國內(nèi)廣泛使用的口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒和本實(shí)驗(yàn)室研制的基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒與國際上廣泛使用的瑞士Prionics公司生產(chǎn)的口蹄疫病毒O型抗體檢測阻斷ELISA試劑盒一樣，具有良好的重復(fù)性。

表5 重復(fù)性比較試驗(yàn)

注：N表示結(jié)果判定為陰性，P表示結(jié)果判定為陽性。Test1和test2分別表示第1次檢測和第2次檢測

2.4 3種試劑盒便捷性比較 應(yīng)用Prionics-O試劑盒檢測一批樣品耗時大約3～4 h、應(yīng)用iELISA-O試劑盒檢測一批樣品耗時大約1.5～2 h，且這兩種試劑盒操作也較為簡單，而應(yīng)用LB-O試劑盒進(jìn)行檢測需要1天1夜才能出結(jié)果，從操作便捷性來說，iELISA-O試劑盒最優(yōu)，Prionics-O試劑盒其次，LB-O試劑盒不僅操作麻煩，而且耗時較長。

3 討論

通過進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒，國產(chǎn)液相阻斷ELISA試劑盒和間接ELISA試劑盒3種試劑盒對150份免疫血清的檢測結(jié)果可知，3種試劑盒檢測結(jié)果之間具有較高的符合性，本實(shí)驗(yàn)室研制的試劑盒與進(jìn)口試劑盒的符合程度稍高?？傮w而言，進(jìn)口試劑盒的敏感性高于其他兩種試劑盒，這可能是由于進(jìn)口試劑盒是基于單克隆抗體研制的試劑盒，單克隆抗體針對的表位是口蹄疫O型上較為保守位點(diǎn)，因此受病毒毒株變異的影響較小，因此陽性檢出率會更高，而液相阻斷ELISA由于其用于中和血清抗體的是全病毒抗原，受口蹄疫毒株變異的影響較大，如果動物免疫的毒株與試劑盒病毒抗原不匹配就會影響其檢測的敏感性。本實(shí)驗(yàn)室研制的試劑盒，為了克服口蹄疫毒株變異對檢測結(jié)果的影響，在抗原設(shè)計(jì)方面盡可能涵蓋了目前國內(nèi)主要流行的毒株和疫苗中使用的毒株，因此檢測的敏感性有一定的提升，但敏感性還是稍低于進(jìn)口試劑盒。

重復(fù)性結(jié)果顯示，3種試劑盒檢測結(jié)果的重復(fù)性都較好，因此可以說這3種試劑盒的檢測結(jié)果均是可靠的，可應(yīng)用于口蹄疫疫苗免疫后的抗體水平的檢測。從價格上來說，進(jìn)口試劑盒價格相較于國產(chǎn)試劑盒為昂貴，僅適合于實(shí)驗(yàn)室研究和一些實(shí)力較為雄厚的養(yǎng)殖場使用，國產(chǎn)試劑盒在價格上優(yōu)勢較為明顯。從操作便捷性來說，本實(shí)驗(yàn)室研制試劑盒顯著優(yōu)于其他兩種商品化試劑盒，不僅操作簡單，而且耗時較短。

[1] 普拉. 口蹄疫流行病學(xué)及其防制[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2011, 32(9): 44-45.

[2] 何繼軍, 郭建宏, 劉湘濤. 我國近年口蹄疫流行形勢與主要流行毒株概況[J]. 中國動物檢疫, 2015，32(6):10-14.

[3] 夏邦世, 吳金華. Kappa一致性檢驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2006,29(1):83-84.