吳肖，王愛軍，王紅鈺，徐晉珩，鄭寶軍，程健，張超，施華，馮俊偉

（河北省唐山市工人醫(yī)院1.腫瘤外科，2.病理科，河北唐山063000）

臨床論著

外周血AREG基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及其臨床意義*

吳肖1，王愛軍1，王紅鈺1，徐晉珩2，鄭寶軍1，程健1，張超1，施華1，馮俊偉1

（河北省唐山市工人醫(yī)院1.腫瘤外科，2.病理科，河北唐山063000）

目的探討外周血中雙向調(diào)節(jié)蛋白（AREG）基因rs2291715位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及其意義。方法選取2012年1月-2015年12月在該院治療的400例結(jié)直腸癌患者作為病例組，同期進行健康體檢的健康者400例作為對照組。檢測病例組與對照組外周血中AREG、CEA、CA50、CA242水平。應用聚合酶鏈反應擴增聯(lián)合DNA直接測序法，檢測兩組外周血中AREG基因rs2291715位點的基因分布情況，按不同基因型將病例組和對照組進行分組，并觀察按基因型分組后不同基因型外周血中AREG水平的變化。Logistic回歸分析AREG基因rs2291715位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性。結(jié)果病例組中血清AREG、CEA、CA50、CA242水平高于對照組（P＜0.05）。AREG基因rs2291715位點存在C和G 2種等位基因，共發(fā)現(xiàn)3種基因型：GG（突變純合子）、CG（突變雜合子）、CC（野生型）。病例組中CG、GG基因型頻率及G等位基因均高于對照組（P＜0.05）。Logistic回歸分析顯示，GG基因型及G等位基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是結(jié)直腸癌的獨立危險因素[＾OR=8.936（95％CI：1.539，48.246）P=0.009]。結(jié)論AREG基因rs2291715位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)直腸癌；雙向調(diào)節(jié)蛋白；基因多態(tài)性；外周血

結(jié)直腸癌的發(fā)生原因主要與生活方式、飲食結(jié)構(gòu)、飲食習慣、遺傳因素等有關(guān)，生活水平高、食物精細、油炸類食品攝入過多、纖維素攝入少、過量飲酒、運動量不足等是結(jié)直腸癌發(fā)病率高的原因[1-2]，其另一重要原因還是遺傳因素，陽性家族史人群是結(jié)直腸癌的高危人群[3]。大多數(shù)結(jié)直腸癌患者早期無癥狀或癥狀不明顯，僅有腹部不適感、消化不良、大便少量帶血或里急后重等，常被誤認為腸道功能紊亂，確診時多為中、晚期，許多患者就診時已出現(xiàn)肝臟或其他部位轉(zhuǎn)移，錯過了最佳治療時間。因此，通過基因分析尋找可以預測結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的臨床指標有重要的現(xiàn)實意義。

雙向調(diào)節(jié)蛋白（amphiregulin，AREG）是腫瘤相關(guān)成纖維細胞釋放的一種外泌蛋白，屬于表皮生長因子家族中的一員，具有酪氨酸激酶活性，與惡性腫瘤的局部增殖擴張、周圍侵襲、遠處轉(zhuǎn)移等有關(guān)。有研究證實，AREG在多種惡性腫瘤中表達明顯增高[4-7]，但該基因突變與結(jié)直腸癌之間關(guān)系的報道較少。本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者AREG在外周血中的濃度及其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點在結(jié)直腸癌和健康人群中的分布差異，以及AREG濃度隨SNP位點的變化情況；同時檢測腫瘤標志物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、糖類抗原50（carbohydrate antigen 50，CA50）、CA242的水平。探討AREG在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義，為正確評估結(jié)直腸癌患者的病情提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月-2015年12月于河北省唐山市工人醫(yī)院就診的結(jié)直腸癌患者400例作為病例組，所有患者經(jīng)術(shù)前活檢及術(shù)后病理學檢查明確診斷為結(jié)直腸癌。選取同期來本院進行體檢的健康人作為對照組（400例）。兩組人員性別、年齡匹配。病例組男性257例，女性143例；年齡（22～70歲），平均（56.4±12.1）歲；對照組男性250例，女性150例；年齡（23～70歲），平均（55.7±11.9）歲。本研究由醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集所有研究對象于空腹過夜晨起抽取靜脈血6 ml。2 ml置于乙二胺四乙酸二鉀（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-K2）抗凝管中，顛倒混勻，置入-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫? ml置于生化促凝管中，室溫血液自然凝固10～20 min，3 000 r/min，離心15 min分離血清。收集上清液，提出的血清-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）血清AREG水平人AREG ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，進口分裝（批號：E-EL-H0237c）。按照ELISA試劑盒說明書操作，依次加入生物素化的抗人AREG抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，形成免疫復合物，加入顯色底物，在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍色，加終止液后變成黃色。用酶標儀在450 nm波長處測光密度（optical density，OD）值，AREG濃度與OD450值呈正比，通過繪制標準曲線，計算出樣品中AREG的濃度。試劑盒檢測范圍31.25～2 000.00 pg/ml，18.75 pg/ml時敏感性最高，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均＜10％。

1.2.3 腫瘤標志物血清CEA、CA50、CA242水平的測定采用電化學發(fā)光法（美國雅培公司i2000化學發(fā)光儀）測定腫瘤標志物CEA、CA50、CA242水平。

1.2.4 基因組DNA的提取EDTA-K2抗凝血復融后，充分混勻，取300μl進行檢測。應用血液基因組DNA提取試劑盒Wizard Genomic DNA Purification kit（批號：D1192-01，美國Promega公司），采用離心柱法提取各樣本基因組DNA。

1.2.5 擴增目的基因AREG基因rs2291715 SNP位點引物序列，正向引物：5'-GAGAATAAGCTTAAAA CACACC-3'，反向引物：5'-AATTTGTAAGTTATGTCA TA-3'。建立總體積為25μl的聚合酶鏈式反應（polymerase chain realtion，PCR）反應體系，包括正反向引物（25μmol/L）各1μl、4種脫氧核糖核苷三磷酸混合物（dNTP 2 mmol/L）5μl，10×擴增緩沖液[500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4，20℃），150 mmol/L MgCl2，1 mg/ml明膠]2.5μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶（5 u/μl）1μl，加ddH2O至終體積為25μl。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。經(jīng)2％瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物并與Marker（日本TaKaRa公司，150 bp）進行比較，判斷PCR擴增產(chǎn)物的準確性。

1.2.6 AREG基因rs2291715 SNP位點的核苷酸序列分析應用DNA直接測序技術(shù)檢測病例組和對照組人群外周血AREG基因rs2291715 SNP位點的等位基因分布。將擴增的PCR產(chǎn)物進一步純化，應用Beckman Coulter GeXP遺傳分析系統(tǒng)（美國Beckman公司）進行雙向測序，得出SNP位點周圍的堿基序列圖。應用DNAMAN軟件將測定結(jié)果與Gen-Bank查詢確定的AREG基因序列進行比對，比較測序結(jié)果與基因庫中公布的基因序列之間的基因序列的差異。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用t檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，用χ2檢驗。應用Logistic回歸分析AREG基因rs2291715多態(tài)位點與結(jié)直腸癌間的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清AREG、CEA、CA50、CA242水平比較

病例組與對照組的血清AREG、CEA、CA50、CA242水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病例組血清AREG、CEA、CA50、CA242水平高于對照組。見表1。

2.2 AREG基因rs2291715 SNP位點直接測序結(jié)果

PCR產(chǎn)物純化后雙向測序結(jié)果顯示，AREG基因rs2291715 SNP位點存在2種等位基因C和G，共有3種基因型：GG（突變純合子）、CG（突變雜合子）、CC（野生型）。見附圖。

表1 兩組血清AREG水平比較（n=400，x±s）

附圖AREG基因rs2291715 SNP位點基因序列圖

表2 兩組AREG基因rs2291715 SNP位點多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較[n=400，例（％）]

2.3 兩組AREG基因rs2291715 SNP位點多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較

病例組與對照組GG、CG基因型頻率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病例組GG、CG基因型頻率均高于對照組。病例組與對照組G等位基因頻率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病例組G等位基因頻率高于對照組。見表2。

2.4 兩組AREG基因rs2291715 SNP位點不同基因型血清AREG水平的比較

病例組和對照組按GG、CG、CC基因型進一步分組后，病例組中GG、CG基因型AREG水平與CC基因型比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=18.252、7.067，P=0.000），病例組GG、CG基因型AREG水平均高于CC基因型，而GG基因型AREG水平又高于CG基因型（t=14.381，P=0.000）。對照組中GG、CG基因型AREG水平與CC基因型比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=17.423、9.658，P=0.000），GG、CG基因型AREG水平均高于CC基因型，而GG基因型AREG水平亦高于CG基因型（t=11.955，P=0.000）。見表3。

2.5 Logistic回歸分析AREG基因rs2291715 SNP位點與結(jié)直腸癌間的相關(guān)性

以有無患結(jié)直腸癌（無=0，有=1）為因變量，以年齡、性別、CEA、CA242、CA50、AREG基因rs2291715 SNP位點基因型[CC（0，0），CG（0，1），GG（1，0）]為自變量，進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，GG基因型與結(jié)直腸癌關(guān)系密切，AREG基因rs2291715 SNP位點GG基因型是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素[＾OR=8.936（95％CI：1.539，48.246），P=0.009]。見表4。

表3 病例組與對照組AREG基因rs2291715 SNP位點不同基因型血清AREG水平的比較

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，該病的發(fā)生率隨著生活水平的提高不斷上升，對人民健康造成嚴重危害[8]。結(jié)直腸癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療會很好地改善預后。因此，找到一種敏感性高、特異性強、便于監(jiān)測的指標用于結(jié)直腸癌的診斷治療十分重要。AREG是一種促癌因子，研究顯示，AREG具有促癌作用，與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-7]。AREG具有兩方面的作用，一方面促進機體多種細胞的生長分化、代謝更新，另一方面可以抑制機體細胞尤其包括腫瘤細胞的增殖。AREG通過介導腫瘤細胞之間，以及腫瘤細胞與周圍組織細胞的相互作用，激活多條信號轉(zhuǎn)導通路，幫助腫瘤細胞實現(xiàn)免疫逃避，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，加快腫瘤的生長[9-10]。有研究證實，AREG在多種人類惡性腫瘤中高表達，尤其是在發(fā)生局部侵襲或遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達明顯增強。在本研究中，筆者檢測結(jié)直腸癌患者外周血中AREG的水平，發(fā)現(xiàn)病例組血清AREG水平高于對照組，這與上述研究結(jié)果一致。

AREG是表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）家族的成員之一，位于4號染色體長臂1區(qū)3帶3亞帶，其相對分子質(zhì)量為9 912 bp，共6個外顯子，8個內(nèi)含子，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切形成252個氨基酸的mRNA，屬于跨膜糖蛋白的一種[11]。AREG在惡性腫瘤中的異常表達與其基因位點突變密切相關(guān)。本研究涉及的AREG基因rs2291715是第4外顯子上的SNPs位點，該位點存在C和G 2種等位基因，野生型為CC基因型。當?shù)? 301位堿基由C突變?yōu)镚，導致第177位氨基酸由TTC（苯丙氨酸，F(xiàn)）突變?yōu)門TG（亮氨酸，L）。目前有關(guān)AREG基因的rs2291715位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌關(guān)系的報道還很少見。

本研究采用DNA直接測序法檢測病例組和對照組的目的基因組DNA，結(jié)果顯示，病例組AREG基因GG、CG基因型頻率和G等位基因頻率均高于對照組，提示AREG基因rs2291715 SNPs位點突變與結(jié)直腸癌有關(guān)，是結(jié)直腸癌發(fā)生的危險因素。同時本實驗將病例組和對照組患者根據(jù)rs2291715 SNPs位點不同的基因型進行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是病例組還是對照組，GG基因型和CG基因型患者血清中AREG的水平高于CC基因型，GG基因型患者血清中AREG的水平高于CG基因型，由此可見，G等位基因與AREG的表達密切相關(guān)。推測G等位基因突變，促進AREG蛋白水平的高表達，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

為進一步觀察AREG基因rs2291715 SNPs位點突變的影響，本研究還檢測與結(jié)直腸癌關(guān)系密切的腫瘤標志物的表達，發(fā)現(xiàn)病例組的腫瘤標志物水平高于對照組。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，GG基因型是結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要危險因素，進一步證實AREG基因rs2291715 SNPs位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，AREG基因rs2291715 SNPs位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，推測該基因位點突變通過促進AREG在機體內(nèi)異常高表達，從而導致腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移。因此，加強對AREG基因rs2291715 SNPs位點多態(tài)性的檢測有助于幫助臨床醫(yī)師早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，早期診斷，早期治療，更好地掌握患者腫瘤進展的狀況，把握手術(shù)時機，提高患者的生存率，爭取改善患者的總體預后。

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（童穎丹 編輯）

Correlation of polymorphism of amphiregulin gene in peripheral blood with colorectal cancer and significance*

Xiao Wu1,Ai-jun Wang1,Hong-yu Wang1,Jin-heng Xu2,Bao-jun Zheng1, Jian Cheng1,Chao Zhang1,Hua Shi1,Jun-wei Feng1
(1.Department of Surgical Oncology,2.Department of Pathology, Tangshan Gongren Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship of rs2291715 locus polymorphism of amphiregulin (AREG)gene in peripheral blood with colorectal cancers and its significance.MethodsIn this study,400 colorectal cancer patients treated in our department from Jan.2012 to Dec.2015 were recruited as case group,and 400 healthy people who

health examination during the same period were enrolled as control group.Levels of AREG,CEA,CA50 and CA242 in peripheral blood of both groups were separately detected.Then PCR amplification combined with DNA direct sequencing was applied to test rs2291715 locus polymorphism of AREG gene in peripheral blood.Based on different genotypes,both groups were classified and observed for the change of AREG level in peripheral blood.Logistic regression analysis was used to evaluate the relationship between rs2291715 polymorphism of AREG gene and colorectal cancer.ResultsSerum levels of AREG,CEA,CA50 and CA242 in the case group were higher than those in the control group(P＜0.05).There were 2 kinds of allelic genes C and G in the rs2291715 locus of AREG gene,and 3 kinds ofgenotypes GG,CG and CC were discovered.The frequency of GG and CG genotypes and allelic gene G in the case group was higher than that in the control group(P＜0.05).Logistic regression analysis showed that GG genotype and allelic gene G were closely related to the development of colorectal cancer and were the independent risk factors for colorectal cancer[OR＾=8.936(95％CI:1.539,48.246),P=0.009].ConclusionsPolymorphism of AREG gene rs2291715 locus is closely related to carcinogenesis and progression of colorectal cancer.

colorectal cancer;amphiregulin gene;gene polymorphism;peripheral blood

R735.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.01.010

1005-8982（2017）01-0050-05

2016-04-22

河北省科技計劃項目（No：16277702D）

王愛軍，E-mail：wajts@126.com；Tel：0315-3722178