楊翔宇， 李曉紅，肖 靜，胡潔媚，馮 娟，霍 然，何國東, 吳岳恒，余細勇，3

(1.南方醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心，廣東省醫(yī)學科學院，廣東廣州 510080；3.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州 511436；4.廣東食品藥品職業(yè)學院國際交流學院，廣東 廣州 510520)

干擾素γ刺激hUC-MSCs分泌外泌體促進調(diào)節(jié)性T細胞生成

楊翔宇1,2， 李曉紅2，肖 靜2，胡潔媚2，馮 娟1,4，霍 然1,2，何國東2, 吳岳恒2，余細勇1,2，3

(1.南方醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州 510515；2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心，廣東省醫(yī)學科學院，廣東廣州 510080；3.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東 廣州 511436；4.廣東食品藥品職業(yè)學院國際交流學院，廣東 廣州 510520)

目的 探討生理和炎性微環(huán)境下人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)能否通過外泌體誘導調(diào)節(jié)性T細胞的生成來發(fā)揮免疫抑制功能。方法 膠原酶消化法分離hUC-MSCs，應用流式細胞術(shù)鑒定hUC-MSCs。IFN-γ模擬體內(nèi)炎性微環(huán)境，以未預處理為對照，分別提取外泌體，得到Nor-hUC-exo和IFN-γ-stimulated hUC-exo，分析其濃度及粒徑分布等特征、并鑒定表面標記蛋白CD63的表達。采用hUC-MSCs、Nor-hUC-exo、IFN-γpretreated-hUC-MSCs、IFN-γstimulated hUC-exo與人外周血單個核細胞共培養(yǎng)5 d后，流式細胞術(shù)檢測T細胞的增殖、調(diào)節(jié)性T細胞的比例變化。結(jié)果 hUC-MSCs高表達CD73、CD44等間充質(zhì)干細胞標志物。IFN-γ刺激前后外泌體粒徑無明顯變化，但IFN-γ刺激后分泌量和CD63增加(P<0.05)。CFSE染料示蹤結(jié)果顯示，hUC-MSCs來源的外泌體抑制PBMCs增殖(P<0.01)，且IFN-γ刺激后明顯提高外泌體的免疫抑制能力(P<0.01)。在活化T細胞中， IFN-γ-stimulated hUC-exo組Treg比例(11.53±0.88%)與IFN-γ pretreated-hUC-MSCs組(7.54±0.50%)(P<0.05)、Nor-hUC-exo組(6.60±0.56%)(P<0.01)、對照組(3.87±0.73%)(P<0.01)相比升高。結(jié)論 hUC-MSCs可通過分泌外泌體來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，在炎癥因子刺激下hUC-MSCs分泌的外泌體明顯促進調(diào)節(jié)性T細胞的生成，hUC-exo可能是潛在的免疫抑制載體。

臍帶；間充質(zhì)干細胞；外泌體；炎性微環(huán)境；免疫調(diào)節(jié)；調(diào)節(jié)性T細胞

外泌體是直徑30～100 nm的胞外囊泡，內(nèi)部包裹著豐富的蛋白質(zhì)、RNA等生物活性分子，可以激活下游的、遠程的信號分子，被認為是細胞與周圍靶細胞間信息交流的重要“內(nèi)分泌”物質(zhì) 。間充質(zhì)干細胞被認為是目前分泌外泌體能力最強的細胞之一[1]，許多研究證實了MSC分泌的外泌體參與抑制淋巴細胞增殖、免疫抑制、促進干細胞增殖以及損傷修復。臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord derived-mesenchymal stem cell，hUC-MSCs)因來源豐富、采集時對供體無損傷，體外增殖能力旺盛，具有良好的低免疫原性，成為繼骨髓間充質(zhì)干細胞后的最有應用前景的干細胞來源。但是，對hUC-MSCs外泌體研究甚少，尤其是病理微環(huán)境下的hUC-MSCs外泌體生物特性及功能的研究。干擾素γ( IFN-γ) 是炎性因子中重要的一員，本課題擬用IFN-γ模擬體內(nèi)炎性病理微環(huán)境，探究炎性微環(huán)境下hUC-MSCs分泌的外泌體在免疫調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Ⅱ膠原酶(Gibco)，Exo-Quick exosome 提取試劑盒(System Bioscience)，人臍帶間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基(賽業(yè))，MSC 無血清培養(yǎng)基(Life)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)， CD73-PE、CD44-FITC、CD29-PE、CD90-FITC、CD31-PE、CD34-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE等流式抗體(BD)，干擾素γ(PeproTech)，絲裂霉素(Sigma)，植物凝血集素(PHA)(Sigma)，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE )染料(DOJINDO)，人調(diào)節(jié)性T細胞標記試劑盒3(eBioscience)，F(xiàn)icoll分離液(GE)，F(xiàn)ACS Calibur型流式細胞儀(BD)，Nanosight-NS500(Malveron)，rabbit anti-CD63 抗體(Abcam)，mouse anti-rabbit HRP二抗(CST)，ECL發(fā)光液(Bioworld)，自動曝光機(GE)。

1.2 hUC-MSCs的分離培養(yǎng) 本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，產(chǎn)婦簽署知情同意書后，無菌取足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶5～10 cm，在超凈臺內(nèi)用含有雙抗的PBS洗去臍帶多余的殘存血漬及血塊，將臍帶剪成2～3 cm小段?？v向剖開臍帶，剔除臍靜脈、臍動脈及其周圍的血管外膜，剝離出華通氏膠(Fig 1A)。將華通氏膠剪碎，加入0.2% Ⅱ型膠原酶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱消化。待消化16～18 h后，用10% DMEM終止消化，收集上清并過200目細胞篩，1 200 r·min-1離心后棄掉上清，用臍帶間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基重懸并接種，細胞放置在飽和濕度37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)基，采用倒置相差顯微鏡觀察hUC-MSCs形態(tài)。待細胞融合達到80%時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取生長狀態(tài)良好的P3-P5代細胞進行實驗。

1.3 流式細胞術(shù)鑒定細胞表型 將P3代的hUC-MSCs消化下來，調(diào)整細胞數(shù)1.0×106個/管，室溫避光孵育鼠抗人CD73-PE、CD44-FITC、CD29-PE、CD90-FITC、CD31-PE、CD34-FITC、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-PE以及同型對照30 min，1 000 r·min-1離心5 min，棄去未結(jié)合的抗體。用PBS洗滌1遍后，用適量PBS重懸，使用流式細胞儀檢測進行分析。用FlowJo7.6.1軟件分析陽性細胞頻數(shù)和分布直方圖。

1.4 hUC-MSCs外泌體的提取 P3代hUC-MSC用50 μg·L-1IFN-γ處理24 h后，繼續(xù)換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清，同時以未處理的hUC-MSC作為對照。按照課題組建立的外泌體試劑盒提取法提取外泌體[2-3]，具體方法為：2 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，丟棄細胞碎片，上清通過0.22 μm濾膜過濾。按1 ∶5的比例加入SBI公司的Exo-Quick提取試劑，上下顛倒溫和混勻，4℃靜置過夜后1 500×g離心30 min，棄掉上清，1 500×g再次離心5 min，輕輕去除殘留的液體，離心管管底的沉淀即為外泌體，分別標記為Nor-hUC-exo和IFN-γ-stimulated hUC-exo。用適量的PBS重懸后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 hUC-exo的特性分析 根據(jù)Nanosight-NS500記錄的顆粒數(shù)，用適量超純水調(diào)整稀釋倍數(shù)，即Nor-hUC-exo稀釋100倍，IFN-γ-stimulated hUC-exo稀釋1 000倍，按照儀器使用說明書上機進行納米粒子特性分析(Nanoparticle Tracking Analysis , NTA)，待儀器測量結(jié)束后，收集并分析報告。利用Western blot 鑒定外泌體表面標志物CD63(1 ∶500)。

1.6 健康人外周血單個核細胞(PBMCs)的分離 簽署知情同意書后，取健康志愿者外周血10 mL，用等體積的PBS稀釋外周血，沿著管壁緩緩滴加到預先裝有10 mL Ficoll分離液的離心管，600×g離心20 min。中間的白膜層即為人PBMCs，輕輕吸出來用含有血清的PBS洗滌1次洗凈分離液。用2.5 mg·L-1的植物血凝素(PHA)刺激PBMCs即為活化的PBMCs(active PBMCs，a-PBMCs)。

1.7 hUC-MSCs分泌的外泌體對PBMCs增殖的影響 剛分離的PBMCs用1mL含0.1% BSA的PBS重懸，用終濃度為5 μmol·L-1的CFSE 37℃孵育10 min，且每2 min顛倒混勻。用500 μL冷的PBS終止染色，再加入1 mL PBS洗去非特異性染色。50 μg·L-1IFN-γ預處理24 h的hUC-MSCs及未經(jīng)處理的hUC-MSCs，經(jīng)10 mg·L-1絲裂霉素處理5h使hUC-MSCs失去增殖能力。然后按PBMCs ∶hU-MSCs=10 ∶1的比例事先在24孔板鋪種，hUC-MSC、IFN-γ pretreated-hUC-MSC或者加入Nor-hUC-exo(2×1011個·L-1)和IFN-γ-stimulated hUC-exo(2×1011個·L-1)，隨后加入CFSE標記好的活化PBMCs與之共培養(yǎng)5 d，以單獨培養(yǎng)的CFSE標記的活化PBMCs為對照，以未標記的初始PBMCs為空白。培養(yǎng)5 d后，采用流式細胞術(shù)測定PBMCs增殖率。

1.8 hUC-MSCs分泌的外泌體對調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory cells，Tregs)比例影響 按上述分組，與未標記CFSE的活化的PBMCs共培養(yǎng)5 d后，收集PBMCS并標記CD4-FITC、CD25-PE膜抗體，固定并破膜后再加入Foxp3- PerCP-Cy5.5及IgG1- PerCP-Cy5.5同型對照抗體，流式細胞術(shù)檢測CD4+/CD25+/Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的比例。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的分離及表型鑒定 采用酶消化法原代分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞，原代培養(yǎng)至5 d左右，可見貼壁生長、長梭形或扁平性的成纖維樣細胞，細胞折光性好，呈漩渦狀生長(Fig1 B)。P3代的hUC-MSCs高表達間充質(zhì)干細胞標志物CD73(99.03±1.86)%、CD44(99.34±2.23)%、CD29(99.74±0.61)%、CD90(93.79±1.05)%以及主要組織相容性復合物MHC-Ⅰ類抗原HLA-ABC(82.75±5.32)%，低表達內(nèi)皮細胞表面抗原CD31(0.16±0.03)%、造血干細胞表面抗原CD34(0.16±0.03)%，幾乎不表達MHC-Ⅱ類抗原HLA-DR(0.03±0.01)%(n=3)(Fig 1C)。結(jié)果表明，本研究中制備的hUC-MSCs純度較高，符合國際細胞治療協(xié)會ISCT間充質(zhì)干細胞標準[4]。

Fig 1 Source, morphology and phenotypic characteristics of hUC-MSCs(n=3)

A:The umbilical cord compartments;B:Phase-contrast image of isolated hUC-MSCs growing in spindle shape, scale bar=100 μm;C:Representative flow cytometry of hUC-MSCs in passage 3. Red histogram represents positive reactivity with the indicated antibody and isotype in blue

2.2 hUC-MSCs來源外泌體的特性分析 采用試劑盒法得到的白色沉淀，PBS重懸，Nanosight NS500實時動態(tài)記錄納米粒子的運動軌跡，測量粒徑、濃度等參數(shù)(Fig 2A)。結(jié)果顯示，Nor-hUC-exo粒徑大多分布在(96.5±3.1) nm，濃度為(7.77±0.57)×1010particles·mL-1，IFN-γ-stimulated hUC-exo粒徑為(98.8±2.8) nm，濃度為(1.25+0.07)×1011particles·mL-1(n=3)(Fig 2B)，所獲得的納米粒子大多符合外泌體30～100 nm的范圍，而且IFN-γ刺激后hUC-MSCs分泌的外泌體數(shù)量增加(P<0.05)。CD63是囊泡上的跨膜蛋白，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，提取后的上清中不表達CD63，白色沉淀均陽性表達CD63，而且IFN-γ-stimulated hUC-exo 中CD63蛋白高于Nor-hUC-exo(Fig 2C)，證實了提取到的沉淀確實是hUC-MSCs外泌體。

2.3 hUC-MSCs來源的外泌體對PBMCs增殖的影響 混合淋巴細胞反應共培養(yǎng)5 d后，CFSE標記法檢測PBMCs的增殖。從Fig 3中可以看出，PHA刺激的非特異性T細胞增殖體系中，PBMCs增殖的比例為(83.9±1.18)%，而在該體系中加入hUC-MSCs、IFN-γ-hUC-MSCs共培養(yǎng)后，增殖比例下降到(42.67±2.27)%、(39.07±1.94)%，說明臍帶間充質(zhì)干細胞明顯抑制PHA活化的PBMCs的增殖，但兩組沒有明顯差異(P>0.05)。而加入Nor-hUC-exo、IFN-γ-stimulated hUC-exo，降低PBMCs增殖比例，分別為(26.07±0.92)%、(16.93±0.34)%(P<0.05)，提示臍帶間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體具有抑制T細胞增殖的負向免疫調(diào)節(jié)作用，IFN-γ能增強hUC-MSCs外泌體的免疫抑制功能。

2.4 生理、炎性微環(huán)境下的hUC-exo對PBMCs中CD4+/CD25+/Foxp3+Treg比例的影響 我們進一步用流式細胞術(shù)檢測外泌體能否調(diào)節(jié)T細胞亞群?；旌狭馨图毎w系共培養(yǎng)5 d后，初始PBMCs中Treg(CD4+/CD25+/Foxp3+)為(1.95±0.39)%，PHA刺激后活化PBMCs中 Treg上升到(3.87±0.73)%， 而加入hUC-MSCs后Treg上升到(5.89±0.11)%(P<0.05)，加入Nor-hUC-exo Treg為(6.60±0.56)%，外泌體仍然能增加Treg細胞亞群比例(P<0.05)。而IFN-γ pretreated-hUC-MSCs組中Treg為(7.54±0.50)%， IFN-γ-stimulated hUC-exo組Treg為(11.53±0.88)%。IFN-γ刺激后分泌的外泌體與IFN-γ pretreated-hUC-MSCs組(P<0.05)、Nor-hUC-exo組(P<0.01)、對照組(P<0.01)相比，CD4+/CD25+/Foxp3+Treg比例升高。我們推測臍帶間充質(zhì)干細胞可以通過外泌體發(fā)揮免疫抑制作用，可能是由于外泌體能誘導免疫耐受Treg的產(chǎn)生， 而且IFN-γ可以激發(fā)外泌體調(diào)節(jié)Treg的生成。

3 討論

調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells，Treg)是1995年發(fā)現(xiàn)的一類具有免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群，對于維持機體免疫穩(wěn)態(tài)、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及誘導外周免疫耐受有重要作用。根據(jù)CD4+T細胞表面分子CD25表達的不同，學者們將其分為CD4+/CD25-效應性T 細胞和CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞。由于叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3)是CD4+/CD25+/Treg細胞的譜系決定因子，對Treg的分化、發(fā)育和Treg免疫抑制功能起到重要作用， Treg又以天然的CD4+/CD25+/Foxp3+表型最為重要[5-6]。Treg通過細胞接觸或非接觸的方式抗衡促進免疫反應的效應性T細胞，或者是通過樹突狀細胞等抗原呈遞細胞而間接抑制其他T細胞的活化[7]。因此，調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量和功能的缺失可能會引發(fā)類風濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病。為了緩解免疫過激疾病，臨床上以提高Treg細胞水平為治療策略。

MSC可以通過細胞直接接觸、內(nèi)分泌的可溶性小分子和旁分泌的胞外囊泡等方式發(fā)揮生物功能[8]。近幾年的研究也逐漸證實了hUC-MSCs分泌的外泌體能模擬hUC-MSCs的生物學功能，如臍帶來源的外泌體能減輕腎臟損傷和心肌損傷等[9-11]。免疫調(diào)節(jié)作用作為間充質(zhì)干細胞主要功能之一，hUC-MSCs來源的外泌體是否也參與到免疫應答中呢？研究發(fā)現(xiàn)，正常的hUC-MSCs分泌的外泌體確實能抑制外周血單核細胞增殖、抑制IL-4等細胞因子的分泌，提示hUC-MSCs 外泌體具有多種免疫抑制方式[12]。劉明等[13]研究顯示hUC-MSCs分泌的外泌體可在體外明顯抑制CD4+T和CD8+T細胞增殖，并對T細胞亞群中的Treg有上調(diào)作用。在PHA活化的淋巴細胞混合培養(yǎng)實驗中，我們的結(jié)果也證明生理狀態(tài)下分泌的 hUC-MSCs外泌體能抑制PBMCs增殖、促進CD4+/CD25+/Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的生成。

Fig 2 Characterization of hUC-MSCs exosomes

A:Nanoparticle tracking analysis(NTA) of hUC-MSCs exosomes.(a)A representative image showing moving particles(white row) from the NTA videos.(b)3D pattern of size, concentration and intensity distribution.(c)Averaged FTLA size and concentration for extracellular vehicles captured by NTA. B:Sizes and particel concentrations of hUC-MSCs exosomes with or without IFN-γ treated in 3 different batches. C:Equal amounts of proteins from supernatant and exosomes were analyzed by Western blot for exosomes marker CD63. Lane 1, Lane 2, supernatant of Nor-hUC-exo group and IFN-γ-stimulated hUC-exo group, respectively. Lane 3, Noraml hUC-MSCs exosomes and lane 4, IFN-γ-stimulated hUC-MSCs exosomes.

The proliferation proportions of PHA stimulated CFSE-labled PBMCs was analyzed by flow cytometry after 5 days.A:active PBMCs alone;B～E:active PBMCs co-cultured with hUC-MSCs, IFN-γ-pretreated-hUC-MSCs, hUC-MSCs exosomes or IFN-γ-stimulated-hUC-MSCs exosomes, respectively;F:overlay of all groups. Grey histogram indicated CFSE- labled PBMCs without any treatment. Comparison between groups were performed with one-way analysis of variance.*P<0.05,**P<0.01vshUC-exo group

但是，個體體內(nèi)微環(huán)境不同，MSCs活化狀態(tài)不同，免疫功能也不同。炎性病理微環(huán)境對臍帶間充質(zhì)干細胞的外泌體數(shù)量和免疫活性會有怎樣的影響呢？我們的實驗結(jié)果顯示，IFN-γ作為炎性微環(huán)境中的主要一員，刺激臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體分泌量明顯增加。而且IFN-γ就像“l(fā)icense”因子那樣增強hUC-MSCs外泌體的免疫調(diào)節(jié)活性，IFN-γ-stimulated 外泌體能明顯抑制活化的PBMCs增殖，升高CD4+/CD25+/Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞比例，而且這種作用比生理狀態(tài)下分泌的外泌體、IFN-γ預處理的hUC-MSCs還強。我們的研究提示，早期炎癥微環(huán)境下，hUC-MSCs來源的外泌體在免疫應答中依舊扮演著積極的免疫負調(diào)節(jié)角色。與此同時，相關(guān)研究報道了炎癥因子脂多糖(LPS)也可以充當“l(fā)icense”因子。LPS預處理后，臍帶間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體比未處理前外泌體蛋白質(zhì)含量增加LPS pre-Exo富含let-7b，通過let-7b/TLR4/ NF-κB/STAT3/AKT信號通路調(diào)節(jié)巨噬細胞向抗炎的M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化[14]。然而，炎性病理微環(huán)境下，hUC-MSCs調(diào)節(jié)外泌體的釋放機制不詳，hUC-MSCs分泌的外泌體尚不清楚能否作用于其他免疫細胞，外泌體調(diào)節(jié)免疫細胞與干細胞之間的相互作用機制不明確。這些問題都有待下一步的深入研究。

總之，我們的研究提示了hUC-MSCs在體外干擾素γ的刺激下，能夠分泌大量外泌體，這些外泌體能促使Treg細胞比率升高，可能通過抑制效應性T細胞參與負向免疫調(diào)節(jié)作用，為體內(nèi)輸注臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體或者IFN-γ預處理的外泌體治療移植物抗宿主疾病和自身免疫疾病提供初步依據(jù)。與直接輸注間充質(zhì)干細胞相比，外泌體作為天然的細胞衍生物的納米載體，更為安全、便于儲存運輸[15]，在移植免疫和自身免疫疾病中極其有前景。

Dot plot results of FITC-CD4+/ PE-CD25+/PerCP-Cy5.5-Foxp3+Treg cells in lymphocytes subset in the absence(a) and presence of hUC-MSCs(b), IFN-γ-pretreated-hUC-MSCs(c),*P<0.05,**P<0.01vsa-PBMCs group;#P<0.05vsIFN-γpretreated-hUC-MSCs group;△△P<0.01vsNor-hUC-exo group

(致謝:本實驗主要是在廣東省人民醫(yī)院的醫(yī)學研究中心實驗室完成的，感謝導師余細勇教授及本課題組所有成員對該實驗的指導與幫助。)

[1] Yeo R W, Lai R C, Zhang B, et al. Mesenchymal stem cell: an efficient mass producer of exosomes for drug delivery[J].AdvDrugDelivRev, 2013, 65(3):336-41.

[2] Xiao J, Pan Y, Li X H, et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4[J].CellDeathDis, 2016, 7(6):e2277.

[3] 肖 靜, 潘 宇, 李曉紅,等.心臟干細胞分泌的 exosome對氧化應激下心肌細胞的保護作用研究[J].中國藥理學通報, 2015,31(12): 1656-60.

[3] Xiao J, Pan Y, Li X H,et al.CPC derived exosome protects cardiomyocytes from oxidative stress[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(12): 1656-60.

[4] Dominici M, Le Blanc K, Mueller L, et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-7.

[5] Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003,299(5609):1057-61.

[6] Williams L M, Rudensky A Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3[J].NatImmnol, 2007, 8(3): 277-84.

[7] Pandiyan P, Zheng L, Lenardo M J. The molecular mechanisms of regulatory T cell immunosuppression[J].FrontImmunol, 2011, 2:60.

[8] Fierabracci A, Del F A, Muraca M. The Immunoregulatory activity of mesenchymal stem cells: state of art and future avenues[J].CurrMedChem, 2016,23(27):3014-24.

[9] Zhou Y, Xu H, Xu W, et al.Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosisinvivoandinvitro[J].StemCellResTher, 2013, 4(2):34.

[10]李 佳,辛 毅, 崔 巍,等.人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌小體保護缺氧復氧損傷的心肌細胞[J].中國病理生理雜志, 2016,32(04): 577-83.

[10]Li J, Xin Y, Cui W,et al. Exosomes secreted by human umbilical mesenchymalstem cells protect cardiomyocytes from anoxia-reoxygenation injury[J].ChinJPathophysiol, 2016,32(04): 577-83.

[11]Zhao Y, Sun X, Cao W,et al.Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells relieve acute myocardial ischemic injury[J].StemCellsInt, 2015,2015:1-12.

[12]楊向榮,丁 娟, 徐正陽,等.人臍帶間充質(zhì)干細胞來源外泌體的生物學特性研究[J].華中科技大學學報(醫(yī)學版),2016,45(02):154-9.

[12]Yang X R, Ding J, Xu Z Y,et al. Biological characteristics of exosomes secreted by human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells[J].ActaMedUnivSciTechnolHuazhong,2016,45(02):154-59.

[13]Liu M, Wang J, Liu M,et al.Study of immunomodulatory function of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells[J].ZhonghuaYiXueZaZhi,2015,95(32):2630-3.

[14]Ti D, Hao H, Tong C, et al.LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b[J].JTranslMed,2015,13(1):308.

[15]Sun L, Xu R, Sun X, et al. Safety evaluation of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stromal cell[J].Cytotherapy, 2016, 18(3): 413-22.

Exosomes secreted from IFN-γ prestimulated hUC-MSCs induce regulatory T cells

YANG Xiang-yu1,2, LI Xiao-hong2, XIAO Jing2, HU Jie-mei2,FENG Juan1,4, HUO Ran1,2, HE Guo-dong2, WU Yue-heng2, YU Xi-yong1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 2.GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China; 3.SchoolofPharmacy,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China; 4.GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510520,China)

Aim To investigate whether human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) exposed to inflammatory conditions could release large amounts of exosomes to induce regulatory T cells(Treg).Methods hUC-MSCs were isolated by enzyme digestion method. (Invitro) interferon γ(IFN-γ) was added into hUC-MSCs to mimic inflammatory microenvironments, then exosomes were extracted from the supernatant of normal conditional medium or IFN-γ pretreated hUC-MSCs. Both sources of exosomes, Nor-hUC-exo and IFN-γ-stimulated hUC-exo, were identified by Nanoparticle Trafficking Analysis(NTA) and Western blot for the exosome-enriched protein CD63. Next, human peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) stimulated with PHA were respectively co-cultured with hUC-MSCs, IFN-γ-pretreated-hUC-MSCs, hUC-MSCs exosomes or IFN-γ-stimulated-hUC-MSCs exosomes for 5 days to assess the exosomes-T cells communication. The proliferation rate of PBMCs and frequency of CD4+/CD25+/Foxp3+Treg were measured by flow cytometry.Results The isolated cells from human umbilical cord tissue, which were positive for CD73, CD44, CD29, CD90 and HLA-ABC, but were negative for CD31 and CD34, were mesenchymal stem cells indeed. After IFN-γtreatment, hUC-MSCs secreted numerous exosomes(P<0.05). Morerover, there was a significantly higher level of CD63, but no difference in diameter between Nor-hUC-exo and IFN-γ-stimulated hUC-exo. IFN-γ-stimulated hUC-exo had a superior ability compared with Nor-hUC-exo to suppress the proliferation of PHA stimulated PBMCs due to their upregulation of the percentage of Treg(11.53±0.88%vs6.60±0.56%,P<0.01).Conclusion hUC-MSCs could promote the expression of Treg to modulate immunosuppression through exosomes, especially for IFN-γ-licenced exosomes, which might carry much immunotherapeutic potential.

umbilical cord; mesenchymal stem cells; exosomes; inflammatory microenvironment; immunodulation; regulatory T cells

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.018.html

2016-08-22，

2016-11-28

國家自然科學基金資助項目(No 81330007，81120108003)；廣東省科技計劃重點項目(No 2015B020225006)；廣東省科技計劃國際合作項目(No 2014A05053047)

楊翔宇(1992-)，女，碩士生,研究方向：干細胞與心血管重編程，E-mail: yxygdzhh@163.com; 余細勇(1962-)，男，博士，博士生導師,研究方向：心血管藥理學及干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學，通訊作者，Tel:020-37103261,E-mail:yuxycn@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.009

A

1001-1978(2017)01-0045-07

R329.24；R392.12；R714.56；R979.5