鄭書國，朱元美，陶善珺，鄭浩文，任尤楠，趙夢秋，楊解人，吳元潔

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽人口職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，安徽 池州 247009；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)教研室，安徽 合肥 230038)

丹酚酸B對間歇性高糖誘導(dǎo)的JNK活化和INS-1細胞凋亡的影響

鄭書國1，朱元美1，陶善珺1，鄭浩文1，任尤楠1，趙夢秋2，楊解人1，吳元潔3

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽人口職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，安徽 池州 247009；3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)教研室，安徽 合肥 230038)

丹酚酸B；INS-1細胞；2型糖尿??；間歇性高糖；JNK；凋亡

近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于存在胰島素抵抗和胰島功能缺陷，加之飲食控制不佳、用藥不當(dāng)?shù)仍颍悄虿』颊叱憩F(xiàn)為高血糖外，還常出現(xiàn)明顯血糖波動，表現(xiàn)為血糖水平在波峰和波谷之間持續(xù)震蕩的一種不穩(wěn)定狀態(tài)[1]。大量研究表明，血糖波動較持續(xù)性高血糖更易誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡，加重胰島功能障礙，這也是糖尿病胰島功能進行性減退的主要原因之一[2]。然而，目前臨床仍無有效措施完全克服糖尿病患者血糖水平波動。因此，抑制血糖波動所致的胰島β細胞凋亡，就成為保護胰島功能、延緩糖尿病發(fā)生發(fā)展和改善糖尿病預(yù)后的有效措施。

丹酚酸B(salvianolic acid B, Sal B)是從唇形科植物丹參中提取的水溶性成分，具有抗氧化、抑制血小板聚集等多種藥理活性[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Sal B可明顯改善2型糖尿病糖脂代謝紊亂[4]，并可有效改善糖尿病腎病、動脈粥樣硬化等多種并發(fā)癥[3]，但對其確切機制至今仍未明確。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠胰島素瘤細胞(INS-1)，觀察Sal B對間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞凋亡及胰島素分泌的影響，并探討其可能機制，闡明Sal B改善糖尿病作用機制，以為臨床用于防治糖尿病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 INS-1細胞株，上海艾睿生物科技有限公司；Sal B(>98%)，南京春秋生物工程有限公司； RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清，Hyclone公司；β-actin、p-JNK抗體，Abcam公司；JNK抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、蛋白定量試劑盒、活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；胰十二指腸同源盒-1(pancreatic and duodenal homeobox-1，PDX-1)抗體，CST公司；細胞凋亡檢測試劑盒，上海貝博公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 高速冷凍離心機(5417 R)，德國Eppendorf公司；Thermo Fisher多功能酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo有限公司；流式細胞儀，美國BD公司；PowerPac300 型電泳儀、Mini PROTEAN 轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國Bio Rad公司；FluorChem FC3 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國ProteinSimple公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) INS-1細胞在37℃、5% CO2、飽和空氣濕度條件下培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、11.1 mmol·L-1葡萄糖、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素、1 mmol·L-1丙酮酸鈉、50 μmol·L-1β-巰基乙醇)，待細胞生長至近融合時，0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行以下實驗。

2.2 細胞活力檢測 細胞活力采用MTT法檢測。INS-1細胞接種于96孔培養(yǎng)板(1×104/孔)，24 h后更換培養(yǎng)液。細胞隨機分為對照組(Control)、間歇性高糖組(IHG)、Sal B高(Sal B 10 μmol·L-1)、中(Sal B 1.0 μmol·L-1)、低劑量組(Sal B 0.1 μmol·L-1)。Sal B各組加入相應(yīng)濃度Sal B預(yù)孵24 h。除對照組外，其余各組加入高濃度葡萄糖(33.3 mmol·L-1)，孵育12 h，更換為普通濃度葡萄糖(11.1 mmol·L-1)，持續(xù)12 h，連續(xù)3 d。每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL孵育4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，震蕩混勻，570 nm測定吸光度(OD)值。

2.3 胰島素分泌功能檢測 INS-1細胞以1×105/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板，細胞分組及處理同2.1項下。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入含5.6 mmol·L-1葡萄糖的Hanks液，37℃孵育30 min。棄培養(yǎng)液，分別加入含5.6 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1葡萄糖的Hanks液孵育1 h，收集上清液，ELISA法檢測胰島素含量。

2.4 細胞凋亡水平檢測 INS-1細胞以1×106/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，細胞分組及處理同2.1項下。棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化后將細胞收集于離心管中，預(yù)冷PBS洗滌2次，每管加入Annexin V結(jié)合液400 μL懸浮細胞。在細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15 min，再加入10 μL PI染色液，4℃避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

2.5 Western blot檢測 將INS-1細胞接種于6孔培養(yǎng)板(1×106/孔)，細胞分組及處理同2.1項下。收集細胞后RIPA裂解液冰浴裂解細胞，12000 g、4℃離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入JNK、p-JNK、PDX-1和β-actin抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析條帶光密度，結(jié)果以p-JNK/JNK和PDX-1/β-actin表示。

2.6 細胞內(nèi)ROS水平測定 INS-1細胞以接種于96孔培養(yǎng)板(1×104/孔)，細胞分組及處理同2.1項下。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入含10 μmol·L-1二氯熒光素二乙酯(dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)的無血清培養(yǎng)液，37℃孵育20 min。棄培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，熒光酶標(biāo)儀檢測各孔熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

3 結(jié)果

3.1 Sal B對INS-1細胞活力的影響 由Fig 1可見，暴露于間歇性高糖72 h后，INS-1細胞活力較對照組明顯下降(P<0.01)，而與Sal B預(yù)孵可明顯提高INS-1細胞活力(P<0.05或P<0.01)，提示Sal B可有效減輕間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞損傷(Fig 1)。

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

3.2 Sal B對INS-1細胞胰島素分泌的影響 由Fig 2可見，基礎(chǔ)狀態(tài)下INS-1細胞胰島素分泌水平較低，而在高濃度葡萄糖(16.7 mmol·L-1)刺激下，其胰島素分泌量明顯增加。當(dāng)暴露于間歇性高糖72 h后，INS-1細胞基礎(chǔ)狀態(tài)和葡萄糖刺激的胰島素分泌水平均明顯下降(P<0.01)，提示間歇性高糖損傷了INS-1細胞胰島素分泌功能；與Sal B預(yù)孵可明顯提高INS-1細胞基礎(chǔ)狀態(tài)和葡萄糖刺激的胰島素分泌水平(P<0.05或P<0.01)，提示Sal B可有效改善間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞胰島素分泌功能損傷。

3.3 Sal B對INS-1細胞凋亡的影響 正常培養(yǎng)條件下，INS-1細胞凋亡水平較低，而給予間歇性高糖刺激72 h后，細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，表現(xiàn)為凋亡早期和凋亡晚期細胞均明顯增加；與Sal B預(yù)孵可明顯抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞凋亡(P<0.05或P<0.01)，這一結(jié)果與Sal B增強INS-1細胞活力、促進胰島素分泌作用一致，提示Sal B減輕間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞損傷、改善胰島素分泌功能與抑制細胞凋亡有關(guān)(Fig 3)。

Fig 2 Effect of Sal B on insulin

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

3.4 Sal B對INS-1細胞JNK活化的影響 由Fig 4可見，正常培養(yǎng)條件下，INS-1細胞JNK活化水平較低，而暴露于間歇性高糖72 h后， JNK活化水平明顯升高(P<0.01)，說明間歇性高糖可明顯誘導(dǎo)JNK活化。當(dāng)INS-1細胞與Sal B預(yù)孵后再暴露于間歇性高糖時，JNK活化水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)，這一作用與Sal B抑制INS-1細胞凋亡作用一致，提示Sal B抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞凋亡與抑制JNK活化有關(guān)。

3.5 Sal B對INS-1細胞PDX-1蛋白表達的影響 暴露于間歇性高糖72 h后，INS-1細胞PDX-1蛋白表達水平明顯下降(P<0.01)，而與Sal B預(yù)孵可明顯提高INS-1細胞PDX-1蛋白水平(P<0.05，P<0.01)，這一結(jié)果與Sal B抑制INS-1細胞凋亡、增加胰島素分泌作用一致，提示Sal B減輕間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞損傷與上調(diào)PDX-1蛋白表達有關(guān)，見Fig 5。

3.6 Sal B對INS-1細胞內(nèi)ROS水平的影響 由Fig 6可見，暴露于間歇性高糖72 h后，INS-1細胞內(nèi)ROS水平明顯升高(P<0.01)，而與Sal B預(yù)孵后再暴露于間歇性高糖，細胞內(nèi)ROS水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)。

4 討論

高血糖是糖尿病最典型的臨床特征之一，長期高血糖一方面可引起各種急慢性并發(fā)癥，另一方面又可誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡，導(dǎo)致胰島素分泌進一步減少，血糖進一步升高，形成惡性循環(huán)。同時，由于胰島功能減退，葡萄糖刺激的胰島素分泌能力明顯下降，加之廣泛存在的胰島素抵抗，致使餐后血糖水平常明顯升高，引起血糖劇烈波動[5]。大量研究表明，血糖波動較持續(xù)性高血糖更易誘導(dǎo)胰島β細胞凋亡，加重胰島功能障礙，且血糖波動幅度越大，糖尿病預(yù)后越差，這也是糖尿病病情進行性加重的主要原因之一[6]。因此，有效抑制血糖波動所致的胰島β細胞凋亡將是改善糖尿病及其并發(fā)癥的有效措施之一。本研究結(jié)果顯示，暴露于間歇性高糖72 h后，INS-1細胞凋亡水平明顯升高，細胞活力和胰島素分泌能力均明顯下降，這一結(jié)果與文獻報道一致[7]。與Sal B預(yù)孵可明顯抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞凋亡，提高細胞活力和胰島素分泌能力，提示Sal B可有效抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的胰島β細胞凋亡，改善胰島功能，這一發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)研究結(jié)果基本一致[8]。由于本研究采用了更符合糖尿病臨床特點的間歇性高糖環(huán)境，因此該研究結(jié)果可更客觀地反映Sal B在體內(nèi)對胰島β細胞的保護作用，這為應(yīng)用Sal B改善糖尿病胰島功能提供依據(jù)。

A～E: Representative flow cytometric dot plots. A: Control; B: IHG; C: Sal B (10 μmol·L-1); D: Sal B (1 μmol·L-1); E: Sal B (0.1 μmol·L-1); F: Apoptotic rate of INS-1 cells.**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

**P<0.01 vs Control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs IHG group

Fig 5 Effect of Sal B on PDX-1 protein

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

Fig 6 Effect of Sal B on intracellular

**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsIHG group

大量研究表明，高血糖引起胰島β細胞凋亡的機制與誘導(dǎo)氧化應(yīng)激有關(guān)[9]。高血糖尤其是間歇性高糖可通過多種途徑促進ROS產(chǎn)生，并可損傷機體抗氧化酶活性，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)[10]。由于胰島β細胞表達的抗氧化酶水平較低，故其更易受到氧化應(yīng)激損傷[11]。ROS既可直接損傷細胞生物膜中多不飽和脂肪酸及胞內(nèi)蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子，誘導(dǎo)細胞凋亡，也可通過激活應(yīng)激敏感性信號通路，啟動細胞凋亡進程[12]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ROS可通過直接或間接等多種途徑激活JNK信號通路，活化的JNK一方面可促進Fas L、Bim等促凋亡蛋白表達，另一方面可抑制Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白表達，從而導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細胞色素C等凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋出，啟動凋亡進程[13]。體外研究顯示，抗氧化劑可有效抑制高血糖誘導(dǎo)的JNK活化和胰島β細胞凋亡[14]，這些發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用抗氧化劑改善糖尿病胰島功能提供了依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，暴露于間歇性高糖72 h后，INS-1細胞內(nèi)ROS和JNK活化水平均明顯升高，這一結(jié)果與文獻報道一致[15]。當(dāng)INS-1細胞與Sal B預(yù)孵后再暴露于間歇性高糖時，細胞內(nèi)ROS和JNK活化水平均明顯低于間歇性高糖對照組，說明Sal B可明顯抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和JNK活化，這一作用與Sal B抑制INS-1細胞凋亡作用一致，提示Sal B抑制間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞凋亡與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、抑制JNK活化有關(guān)。本研究從ROS-JNK信號通路初步揭示了Sal B抑制INS-1細胞凋亡的分子機制，這一結(jié)果將為進一步探討Sal B保護糖尿病胰島β細胞的機制奠定基礎(chǔ)。

此外，本研究結(jié)果還顯示，間歇性高糖可明顯抑制胰十二指腸同源盒-1(PDX-1)蛋白表達。作為胰島β細胞特異表達的轉(zhuǎn)錄因子，PDX-1具有抑制β細胞凋亡、促進胰島素合成及分泌等多種生理作用，是維持胰島正常功能的重要因素之一[16]。ROS可減少PDX-1 mRNA表達，降低PDX-1與胰島素啟動子結(jié)合活性，下調(diào)胰島素基因轉(zhuǎn)錄[17]?；罨腏NK也可磷酸化PDX-1并使其發(fā)生核質(zhì)易位，抑制胰島素基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致胰島素合成和分泌減少[18]。Sal B可明顯提高INS-1細胞PDX-1蛋白水平，提示Sal B抑制INS-1細胞凋亡、改善胰島素分泌能力，與改善氧化應(yīng)激狀態(tài)、增加PDX-1表達有關(guān)。

綜上所述，本研究采用了更符合糖尿病臨床特點的間歇性高糖環(huán)境，從ROS介導(dǎo)JNK活化信號通路揭示了Sal B對INS-1細胞凋亡的抑制作用及其分子機制。該研究為進一步闡明Sal B改善糖尿病胰島細胞功能的機制奠定基礎(chǔ)，并將為臨床應(yīng)用于改善糖尿病胰島功能提供依據(jù)。

(致謝：本實驗在皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室中藥藥理三級實驗室完成，在此表示感謝。)

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Effect of salvianolic acid B on intermittent high glucoseinduced JNK activation and INS-1 cell apoptosis

ZHENG Shu-guo1, ZHU Yuan-mei1, TAO Shan-jun1, ZHENG Hao-wen1, REN You-nan1, ZHAO Meng-qiu2, YANG Jie-ren1, WU Yuan-jie3

(1.DeptofPharmacology,WannanMedicalCollege,WuhuAnhui241002,China; 2.DeptofBasicMedicine,AnhuiVocationalInstituteofPopulation,ChizhouAnhui247009,China; 3.DeptofBasicTheoryofChineseMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230038,China)

Aim To investigate the effect of salvianolic acid B (Sal B) on c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation and apoptosis of INS-1 cells induced by intermittent high glucose. Methods INS-1 cells were preincubated with Sal B for 24 h, followed by exposure to intermittent high glucose (IHG, 11.1 mmol·L-112 h, 33. 3 mmol·L-112 h) for 72 h. Cell viability was assessed by MTT assay and cell apoptosis was evaluated by flow cytometry. Glucose induced insulin secretion capacity and intracellular reactive oxygen species (ROS) contents were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and a fluorescent probe DCFH-DA, respectively. Levels of JNK activation and PDX-1 protein expression were determined by Western blot analysis. Results Sal B significantly alleviated IHG-induced cell injury and apoptosis, with glucose induced insulin secretion capacity improved evidently (P<0.05 orP<0.01). Preincubation with Sal B notably decreased intracellular ROS and JNK activation in INS-1 cells, while the level of PDX-1 protein was increased markedly (P<0.05 orP<0.01). Conclusion Sal B is capable of ameliorating IHG-induced cell injury and apoptosis in INS-1 cells, which might be derived from suppression of JNK activation and up-regulation of PDX-1 protein expression.

salvianolic acid B; INS-1 cells; type 2 diabetes; intermittent high glucose; JNK; apoptosis

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.026.html

2016-09-27，

2016-11-15

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81102626)；安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點項目(No KJ2015A192)；皖南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研資助金資助項目(No WK2015S26)

鄭書國(1967-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)和中藥藥理學(xué)，E-mail：zhengsg2000@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.013

A

1001-1978(2017)01-0068-06

R-332；R284.1；R322.57；R329.25；R345.57；R587.1摘要：目的 觀察丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)對間歇性高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島素瘤細胞(INS-1)c-Jun氨基末端激酶(JNK)活化和細胞凋亡的影響。方法 INS-1細胞與丹酚酸B預(yù)孵24 h后暴露于間歇性高糖(11.1 mmol·L-112 h，33.3 mmol·L-112 h)72 h。MTT法測定細胞活力，ELISA法測定葡萄糖刺激的胰島素分泌能力，熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平，Western blot法檢測胰十二指腸同源盒-1(PDX-1)蛋白表達和JNK活化水平。結(jié)果 丹酚酸B可明顯減輕間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞損傷和凋亡(P<0.05，P<0.01)，提高葡萄糖刺激的胰島素分泌能力(P<0.05，P<0.01)；與丹酚酸B預(yù)孵可明顯降低細胞內(nèi)ROS水平、抑制JNK活化，并提高PDX-1蛋白表達水平(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 丹酚酸B可有效減輕間歇性高糖誘導(dǎo)的INS-1細胞損傷和凋亡，提高胰島素分泌水平，其機制可能與降低細胞內(nèi)ROS水平、抑制JNK活化和上調(diào)PDX-1蛋白表達有關(guān)。